靶向雄激素受体的lna拮抗剂的制作方法

专利名称：靶向雄激素受体的lna拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明提供调节雄激素受体的表达的化合物、组合物和方法。特别是，本发明涉及 寡聚化合物(寡聚物)，其在细胞中靶向雄激素受体mRNA，导致雄激素受体的表达减少。雄 激素受体表达的减少有利于一系列医学病症，如癌症，特别是前列腺癌或乳腺癌。相关案件本申请根据35 U. S. C. § 119(e)要求2007年11月26日提交的U. S.临时申请序 列号60/990，125的优先权，其公开以其整体在此引入作为参考。背景雄激素受体(AR)为一类细胞核受体，其通过结合雄激素睾酮或二氢睾酮而活化。 雄激素受体的主要功能是作为调节基因表达的DNA结合转录因子。然而，雄激素受体也具 有独立于DNA结合的其它功能。雄激素受体与孕酮受体最密切相关，且较高剂量的孕酮可 阻断雄激素受体。尽管人的AR基因为单拷贝且发现于X染色体的Xql 1_12位置上，但受体本身存在 两种同工型(A和B)。AR-A为缺少前187个氨基酸(N-端切断)的87kDa蛋白质。同工型 AR-B 全长为 llOkDa。雄激素与雄激素受体的结合诱导受体的构象变化，导致热休克蛋白的解离、细胞 溶胶向细胞核的二聚和转运，在细胞核中雄激素受体二聚物结合至特异的DNA序列-称为 激素效应元素。根据与其它核蛋白质的相互作用，该AR控制基因表达，增加或减少特异基 因的转录，如胰岛素样生长因子I (IGF-I)。尽管在细胞质中具有信号转导蛋白，雄激素受体也可具有胞质活性。结合至细胞 质雄激素受体的雄激素可引起不依赖基因转录的细胞功能的快速转变，例如离子转运，以 及基因转录的间接影响，例如通过介导其它信号转导途径，从而影响其它转录因子的活性。雄激素受体的过表达，或突变的雄激素受体基因的表达已在多种疾病中指征，如 癌症，包括前列腺癌和乳腺癌，以及其它病症如聚谷氨酸(polyglutamate)疾病(Monks等 人，PNAS 2007年11月2日，公开于网上)脱发，良性前列腺增生，脊髓性肌萎缩和Kennedy 疾病。W097/11170报道了治疗诊断为患有良性前列腺增生或前列腺癌的患者的方法，其 包括给药选择性杂交至雄激素受体mRNA的反义寡核苷酸。公开了 27-29个核苷酸的三个 反义寡核苷酸序列。US 6，733，776和EP 0 692 972报道了治疗雄激素性脱发的方法，其通过施加包 含杂交至雄激素受体基因的反义核酸的脂质体。没有提供具有具体序列且靶向雄激素受体 的反义分子。US 2005/0164970报道了使用靶向雄激素受体mRNA的siRNA复合物治疗前列腺癌 的方法。WO 2005/027833报道了治疗前列腺癌的方法，其包括向患者给药长度为12_40个 吗啉代亚单元的吗啉代寡核苷酸。
WO 2001/083740报道了反义化合物，其具有靶向人雄激素受体的18至20个连续 单元的不带电(uncharged)吗啉代主链。吗啉代反义化合物通过结合至核酸靶以阻断其它分子接近mRNA而工作，所述其 它分子如mRNA剪接或翻译起始中涉及的分子。US 7，067，256报道了一种核酶，其明显介导雄激素受体的灭活。提供了与雄激素 受体mRNA的对应区反义的19个核苷酸的RNA分子。然而，尽管使用siRNA、吗啉代反义和核酶，上述雄激素受体抑制剂没有一种成功 地在体内和以药理可接受的剂量有效地减量调节雄激素_受体。在一个示例方面，本发明提供一类新的雄激素受体拮抗剂，其基于使用LNA化学， 和/或通过选择雄激素受体mRNA上的特别有效的靶点而选择。

发明内容
本发明提供长度为10-50，如10-30个核苷酸的寡聚物，其包含总共10_50，如 10-30个核苷酸的连续核苷酸(contiguous nucleotide)序列，其中所述连续核苷酸序列 与对应于以下的区至少80% (例如，85%，90%，95%，98%，或99% )同源编码哺乳动 物雄激素受体的核酸的反向补体(reverse complement)，如哺乳动物雄激素受体基因或 mRNA JBSEQ ID NO 1或其天然存在的变体。因此，例如，该寡聚物杂交至具有SEQ ID NO: 1的(相应)部分的序列的单链核酸分子。本发明提供缀合物，其包含根据本发明的寡聚物，和至少一种共价连接至所述寡 聚物的非核苷酸或非多核苷酸部分。本发明提供药物组合物，其包含根据本发明的寡聚物或缀合物，和药物可接受的 稀释剂、载体、盐或佐剂。本发明提供根据本发明的寡聚物或缀合物，其用作药物，如用于治疗本文公开的 疾病或医学病症，如过度增生性疾病，如癌症。本发明提供根据本发明的寡聚物或缀合物，用于制备用于治疗本文公开的疾病或 医学病症，如过度增生性疾病，如癌症的药物中的用途。本发明提供治疗本文公开的疾病或医学病症，如过度增生性疾病，如癌症的方法， 所述方法包括向患有或可能患有所述疾病或医学病症的患者给药根据本发明的寡聚物、缀 合物或药物组合物。本发明提供在表达该雄激素受体的细胞中抑制雄激素受体的方法，所述方法包括 向所述细胞给药根据本发明的寡聚物或缀合物以实现在所述细胞中时雄激素受体的抑制。本发明提供长度为10-50个核碱基的寡聚物，其包括总共10-50个核碱基的连续 核碱基序列，其中所述连续核碱基序列与编码哺乳动物雄激素受体的核酸的对应区至少 80%同源。本发明提供长度为10-50个核碱基的寡聚物，其包括总共10-50个核碱基的连续 核碱基序列，其中所述连续核碱基序列与编码哺乳动物雄激素受体的核酸的靶区的反向补 体至少80%相同(identical)。本发明进一步提供包含根据本发明的寡聚物的缀合物，如以下缀合物，其除了包 含寡聚物的核碱基序列，还包含共价连接至本发明的寡聚物的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分(“缀合的部分”)。本发明提供药物组合物，其包含本发明的寡聚物或缀合物，和药物可接受的稀释 剂、载体、盐或佐剂。本发明进一步提供本发明的寡聚物，其用于药物。本发明进一步提供本发明的寡聚物在制备用于治疗本文涉及的一种或多种疾病 的药物中的用途，该疾病如选自以下的疾病癌症如乳腺癌或前列腺癌，脱发，良性前列腺 增生，骨髓性肌萎缩(spinal and muscular atrophy)，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病。本发明进一步提供本发明的寡聚物，用于治疗本文涉及的一种或多种疾病，如选 自以下的疾病癌症如乳腺癌或前列腺癌，脱发，良性前列腺增生，骨髓性肌萎缩，Kennedy 疾病和聚谷氨酸疾病。还提供包含本发明的寡聚物的药物和其它组合物。进一步提供减量调节AR在细 胞或组织中的表达的方法，其包括将所述细胞或组织，体外或体内，与一种或多种本发明的 寡聚物、缀合物或组合物接触。还公开了为治疗怀疑患有或倾向于(易于)患有与AR的表达或过表达相关的疾 病或病症的非人动物或人的方法，其通过向该辅助动物或人给药治疗或预防有效量的一种 或多种本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物。而且，提供了使用寡聚物抑制AR的表达，和 治疗与AR的活性相关的疾病的方法。本发明提供治疗选自癌症如乳腺癌如乳腺癌或前列腺癌，脱发，良性前列腺增 生，骨髓性肌萎缩，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病的疾病的方法，该方法包括向需要的患者 给药(有效量的)本发明的一种或多种寡聚物、缀合物或其药物组合物。本发明提供在细胞或组织中抑制或减少雄激素受体的表达的方法，如通过减量调 节，该方法包括将所述细胞或组织与有效量的本发明的一种或多种寡聚物、或其缀合物或 药物组合物接触的步骤，以使雄激素受体的表达被抑制或减少。本发明提供，在一些实施方案中，由10至30个连续单体组成的寡聚物，其中相 邻单体通过磷酸酯基(phosphate group)或硫代磷酸酯基共价连接，其中所述寡聚物包 括至少10个连续单体的第一区；其中所述第一区的至少一个单体为核苷类似物；其中所 述第一区的序列与哺乳动物雄激素受体基因或哺乳动物雄激素受体mRNA的最佳排列的 (best-aligned)靶区的反向补体至少80%相同。在一方面，本发明的寡聚物选自 其中大写字母表示β -D-氧基-LNA单体且小写字母表示DNA单体，下标“S”表示 硫代磷酸酯连接，且feC表示含5-甲基胞嘧啶碱基的β -D-氧基-LNA单体。附图简述

图1.对表3中存在的寡核苷酸使用实时PCR评价其在转染后24小时在浓度1、4 和16ηΜ在MCF7细胞中敲低(knock down)雄激素受体mRNA的潜能。所有结果对于GAPDH 标准化，且AR mRNA的抑制显示为未处理的对照的百分比。所示结果为三个独立实验的平均值。图2.对表3中存在的寡核苷酸使用实时PCR评价其在转染后24小时在浓度1、4 和16nM在A549细胞中敲低雄激素受体mRNA的潜能。所有结果对于GAPDH标准化，且AR mRNA的抑制显示为未处理的对照的百分比。所示结果为三个独立实验的平均值。图3.人雄激素受体mRNA序列(Genbank登记号NM_000044)和小鼠雄激素受体 mRNA序列(Genbank登记号NM_0134769)的序列比对。图4.根据本发明的寡聚物靶向的人AR mRNA(cDNA)的优选靶区的位置。尽管显 示了 16聚体靶点，在一些实施方案中，这些靶区可包含在所示区域的5’或3’的另外4个 碱基_即为最多24个连续核苷酸的靶区。图5. SEQ ID NO=I人雄激素受体(二氢睾酮受体；睾丸女性化；脊髓延髓肌萎缩； Kennedy 病)(AR)，转录变体 1，mRNA。(Genbank 登记号 NM_000044)。图6. SEQ ID NO 81 小鼠雄激素受体mRNA序列。图7. SEQ ID NO 82 猕猴雄激素受体mRNA序列。图8. SEQ ID NO 83 人雄激素受体蛋白氨基酸序列。图9. SEQ ID NO 84 小鼠雄激素受体蛋白氨基酸序列。图10. SEQ ID NO 85 猕猴雄激素受体蛋白氨基酸序列。图11 转染后24小时LNCaP中的AR mRNA图12 转染后24小时A549中的AR mRNA图13 细胞增殖测试-A549，转染后时程图14 细胞增殖测试-转染后时程图15 转染后24，48或72小时LNCaP细胞中的Caspase 3/7活性。图16 转染后24，48或72小时A549细胞中的Caspase 3/7活性。图17 体内寡聚物处理后血浆中的平均PSA。图18 肿瘤生长的体内抑制发明详述寡聚物本发明使用寡聚化合物(本文称为寡聚物)，用于调节编码哺乳动物雄激素受体 的核酸分子，如SEQ ID NO 1中所示的雄激素受体核酸，和这种编码哺乳动物雄激素受体的 核酸分子天然存在的变体的功能。本发明中的术语“寡聚物”，是指两个或多个核苷酸共价 连接形成的分子(即寡核苷酸)。在此，各单核苷酸，如本发明的寡聚物中存在的核苷酸，也 可称为“单体”或“单元”。在一些实施方案中，该寡聚物由长度为10-30个核苷酸的连续核 苷酸序列组成或包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列(即包含10-30个共价连接 的单体或由10-30个共价连接的单体组成)。在不同实施方案中，本发明的化合物不包含RNA(单元)。在不同实施方案中，根 据本发明的化合物为线性分子或合成为线性分子。在该实施方案中，该寡聚物为单链分子， 且通常不包含例如，至少3，4或5个连续核苷酸的短区，该短区与相同寡聚物内的另一区互 补(即双链体)_在这点上，在一些实施方案中，该寡聚物不为(实质上)双链的。在一些 实施方案中，该寡聚物实质上不为双链的，如不为siRNA。在不同实施方案中，本发明的寡聚 物可整个由连续核苷酸区组成。因此，该寡聚物基本上不是自互补的。siRNAs包含2个互补的短RNA(或相当的核碱基单元)序列，如21至23nts长，通常在任一端具有2nt 3’突 出端。为增强体内摄取，siRNAs可为缀合的，如缀合至固醇，如胆固醇基团(通常在一条或 两条链的3’或5’端)。本发明进一步提供AR mRNA或基因中的靶序列，或其等位变体，特别是相应于SEQ ID NOS :2-22的那些，其中相应于所述靶序列的反义寡核苷酸能减量调节AR。例如，相应 于反义寡核苷酸序列SEQ ID NOS 2-22的靶序列分别示于图4 (粗体和下划线的，且相应 寡聚物SEQ ID NOS如上所示)。变体序列，例如但不限于该靶序列的等位变体(如基因座 Xqll-12处存在的(AR)基因)也在本发明的范围内。变体序列可具有与AR中的靶序列至 少60 %，更优选至少70 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至 少91 %，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%的序列同源性。通常，对应于所述变体 序列的本发明的寡聚物还能减量调节AR。也公开了 LNA寡核苷酸的具体设计，例如示于SEQ ID NOS 44-80的那些。本发明 的寡聚物认为是雄激素受体mRNA和蛋白质表达的有效的抑制剂。革巴哺乳动物雄激素受体优选选自人或小鼠雄激素受体。优选该哺乳动物雄激素受体 为人雄激素受体，如SEQ ID NO 1所示的核酸编码的雄激素受体。进一步的哺乳动物雄激 素受体基因(靶)和它们相应的蛋白质示于下表 应认识到人的雄激素受体基因显示一定程度的等位变异，且几种多态性识别以上 公开的核酸的GenBank登记号是指cDNA序列而不是指mRNA序列本身。成熟mRNA的序列 可直接从对应cDNA序列衍生，此时胸腺嘧啶碱基(T)被尿嘧啶碱基(U)替换。应认识到人的雄激素受体基因显示一定程度的等位变异，且几种多态性与疾病表 型相关(Mooney等人，NAR 15 ;31 (8) 2003)。例如，CAG重复扩增与聚谷氨酰胺扩增疾病 (polyglutamine expansion disorder)相关，其它表征的等位变体包括(GGC)n三核苷酸 重复，且已鉴定了 R726L、T887A和L710H单核苷酸多态性，且后两个显示与AR受体对其它 类固醇配体的增强的混杂相关。在一个实施方案中，η的范围可为5至31。小于22的CAG 的重复与African American男性增高的前列腺癌风险相关，且因此这可能为优选的等位变 体。在一些实施方案中，该靶核酸为包含一个或多个单核苷酸多态性(包括R726L、 T887A和L710H)的AR等位变体。因此，在一些实施方案中，该靶为包含(CAG) η三核苷酸重复或(GGC) η三核苷酸重 复的AR等位变体。
编码哺乳动物雄激素受体的核酸在一个优选实施方案中为，人雄激素受体cDNA 序列显示为SEQ ID NO 1和/或小鼠雄激素受体cDNA序列显示为SEQ ID NO 81，或其等位 变体。根据本发明的寡聚物为反义寡核苷酸。因此，根据本发明的寡聚物的‘靶’为雄激素受体mRNA。该寡聚物当引入表达该雄 激素受体基因的细胞时，导致雄激素受体mRNA水平的减少，导致细胞中雄激素受体的表达 水平的减少。已知雄激素受体调节多种基因的表达，如选自以下的基因蛋白质激酶 C5 (PRK⑶)，谷胱甘肽S-转移酶9 2(GSTT2)，瞬时型受体潜在阳离子通道亚家族V成员 3 (TRPV3)，吡咯啉-5-羧酸还原酶1 (PYCRl)或鸟氨酸氨基转移酶(OAT)-这些基因在此称 为雄激素受体靶，且因此，在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物可用于调节一种或多种 雄激素受体靶在细胞中的表达，该细胞表达或能表达(即缓解细胞中雄激素受体靶的抑制 (通过AR)的情况下)所述雄激素受体靶。靶向雄激素受体mRNA的寡聚物可杂交至沿着靶mRNA核酸的任何位点，如5'未翻 译的前导序列(leader)、外显子、内含子和3'未翻译的尾部。然而，优选靶向雄激素受体 mRNA的寡聚物杂交至该靶核酸的成熟mRNA形式。适当地，本发明的寡聚物能减量调节雄激素受体基因的表达。在这点上，通常在哺 乳动物如人细胞中，本发明的寡聚物可实现对雄激素受体的抑制。在一些实施方案中，本 发明的寡聚物结合至该靶核酸且相比于正常表达水平实现至少10%或20%的表达抑制， 更优选相比于正常表达水平(如紧接给药寡聚物之前)至少30%，40%，50%，60%，70%， 80%，90%或95%抑制。在一些实施方案中，当使用0. 04至25nM，如0. 8至20nM浓度的本 发明的化合物时观察到该调解。在相同或不同实施方案中，表达的抑制小于100%，如小于 98 %抑制，小于95 %抑制，小于90 %抑制，小于80 %抑制，如小于70 %抑制。表达水平的调 解可通过测量蛋白质水平而确定，例如通过以下方法，如SDS-PAGE，然后使用针对该靶蛋白 产生的合适的抗体进行蛋白质印迹。或者，表达水平的调解可通过测量mRNA水平确定，例 如通过RNA印迹法或定量的RT-PCR。当通过mRNA水平测量，当使用合适的剂量，如0. 04至 25nM，如0. 8至20nM浓度时，减量调节的水平在一些实施方案中通常达到没有本发明的化 合物的情况下的正常水平的10-20 %的水平。因此本发明提供在表达该雄激素受体蛋白和/或mRNA的细胞中减量调节或抑制 雄激素受体蛋白和/或mRNA的表达的方法，所述方法包括向所述细胞给药或使所述细胞接 触根据本发明的寡聚物或缀合物(合适地以有效量)以在所述细胞中减量调节或抑制雄激 素受体蛋白和/或mRNA的表达。适当地该细胞为哺乳动物细胞如人细胞。在一些实施方 案中，给药或接触可在体外发生。在一些实施方案中，给药或接触可在体内发生。本文使用的术语“靶核酸”是指编码哺乳动物雄激素受体多肽，如人雄激素受体的 DNA或RNA，如SEQ ID NO :1。编码雄激素受体的核酸或其天然存在的变体，和从其衍生的 RNA核酸，优选mRNA，如前mRNA，尽管优选成熟mRNA。在一些实施方案中，例如当在研究或 诊断学中使用时，“靶核酸”可为cDNA或衍生自上述DNA或RNA核酸靶的合成的寡核苷酸。 根据本发明的寡聚物优选能杂交至靶核酸。应认识到SEQ ID N0:1为cDNA序列，且同样 地，相应于成熟mRNA靶序列，尽管在cDNA序列中尿嘧啶被胸苷替换。术语“其天然存在的变体”是指核酸序列的雄激素受体多肽的变体，其天然存在于限定的分类群中，如哺乳动物，如小鼠、猴，且优选人。通常，当涉及多核苷酸的“天然存在的 变体”时，该术语还可包括任何编码基因组DNA (其通过染色体易位或复制存在于染色体X 66. 68-66. 87Mb)和RNA(如其衍生的mRNA)的雄激素受体的等位变体。“天然存在的变体” 还可包括衍生自雄激素受体mRNA的选择剪接的变体。当涉及具体多肽序列时，例如，该术 语还包括天然存在形式的蛋白质，因此其可进行加工，例如通过共翻译_或翻译后修饰，如 信号肽裂解、蛋白水解剪切、糖基化等。寡聚物序列该寡聚物包含以下连续核苷酸序列或由以下连续核苷酸序列组成，该连续核苷酸 序列相应于SEQ ID NO :1中存在的核苷酸序列的反向补体。因此，该寡聚物可包含或由选 自SEQ ID NOS :2-22和86-106的序列组成，其中所述寡聚物(或其连续核苷酸部分)相对 所述选择的序列可任选具有1个、2个或3个错配。该寡聚物可包含以下连续核苷酸序列或由以下连续核苷酸序列组成，该连续核苷 酸序列完全互补(完美互补)于编码哺乳动物雄激素受体的核酸(例如，SEQ ID NO 1)的 等效区。因此，该寡聚物可包含反义核苷酸序列或由反义核苷酸序列组成。然而，在一些实施方案中，当寡聚物与靶序列杂交且还足以与靶结合以显示所需 作用(即下调靶)时，该寡聚物可包括1，2，3，或4(或更多)个错配。错配可通过，例如，增 加寡聚物核苷酸序列的长度和/或增加核苷酸序列中存在的核苷酸类似物(如LNA)的数 量而补偿。在一些实施方案中，该连续核苷酸序列当杂交至靶序列，如杂交至编码哺乳动物 雄激素受体的核酸的对应区时，包含不多于3个，如不多于2个错配。在一些实施方案中，该连续核苷酸序列当杂交至靶序列，如杂交至编码哺乳动物 雄激素受体的核酸的对应区时，包含不多于一个错配。本发明的寡聚物的核苷酸序列或连续核苷酸序列优选与选自SEQ ID NOS :2_22 和86-106的相应序列至少80%同源，如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%同源，如100%同源(相同)。本发明的寡聚物的核苷酸序列或连续核苷酸序列优选与SEQ ID NO :1中存在的 相应序列的反向补体至少80%同源，如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%同源，至少97%同源，至少98%同源，至少99%同源， 如100%同源(相同)。本发明的寡聚物的核苷酸序列或连续核苷酸序列优选与SEQ ID NO :1中存在的子 序列至少80 %互补，如至少85 %，至少90 %，至少91%，至少92 %，至少93 %，至少94 %，至 少95%，至少96%互补，至少97%互补，至少98%互补，至少99%互补，如100%互补(完
美互补)。在一些实施方案中，该寡聚物(或其连续核苷酸部分)选自，或包含，选自SEQ ID NOS :2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21和22 的序列之一，或其至 少10个连续核苷酸的子序列，其中所述寡聚物(或其连续核苷酸部分)当与所述序列比较 时可任选包含1个、2个或3个错配。在一些实施方案中，该寡聚物(或其连续核苷酸部分)选自，或包含，选自SEQ ID NOS=86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100，101，102，103，104，105和 106 的序列之一，或其至少10个连续核苷酸的子序列，其中所述寡聚物(或其连续核苷酸部分) 当与所述序列比较时可任选包含1个、2个或3个错配。其它优选寡聚物包括(连续)核苷酸序列，如长度为12，13，14，15或16个连续核 苷酸的序列，其具有选自以下的核苷酸序列选自SEQ ID No 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12， 13，14，15，16，17，18，19，20，21和22的序列，其中所述寡聚物(或其连续核苷酸部分)相对 所述选择的序列可任选包含1个、2个或3个错配。在一些实施方案中，该子序列可由11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23， 24，25，26，27，28，或29个连续核苷酸组成，如12-22个，如12-18个核苷酸。适当地，在一 些实施方案中，该子序列与本发明的寡聚物的连续核苷酸序列的长度相同。然而，认识到，在一些实施方案中寡聚物的核苷酸序列可包含另外的5’或3’核 苷酸，如，独立地，1，2，3，4或5个另外的核苷酸5’和/或3’，它们不互补于靶序列。在该 方面，本发明的寡聚物在一些实施方案中可包含在5’和或3’侧翼有另外的核苷酸的连续 核苷酸序列。在一些实施方案中该另外的5’或3’核苷酸为天然存在的核苷酸，如DNA或 RNA。在一些实施方案中，该另外的5’或3’核苷酸可表示本文的缺口聚物(gapmer)寡聚 物涉及的D区。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID NO 2的核苷酸序列，如SEQ ID NO 44，或其至少10个连续核苷酸的 子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 3的核苷酸序列，如SEQ ID 45，或其至少10个连续核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 4的核苷酸序列，如SEQ ID NO 46，或其至少10个连续核苷酸的子序 列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 5的核苷酸序列，如SEQ ID NO 47，或其至少10个连续核苷酸的子序 列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 6的核苷酸序列，如SEQ ID NO 48，49或50，或其至少10个连续核苷 酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 7的核苷酸序列，如SEQ ID NO 51，52，或53，或其至少10个连续核苷 酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 8的核苷酸序列，如SEQ ID 54，55或56，或其至少10个连续核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 9的核苷酸序列，如SEQ ID 57，或其至少10个连续核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 10的核苷酸序列，如SEQ ID 58，59，或60，或其至少10个连续核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 11的核苷酸序列，如SEQ ID 61，或其至少10个连续核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 12的核苷酸序列，如SEQ ID 62，或其至少10个连续核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 13的核苷酸序列，如SEQ ID 63，64或65，或其至少10个连续核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 14的核苷酸序列，如SEQ ID 66，或其至少10个连续核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 15的核苷酸序列，如SEQ ID 67，或其至少10个连续核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 16的核苷酸序列，如SEQ ID 68，或其至少10个连续核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 17的核苷酸序列，如SEQ ID 69，70或71，或其至少10个连续核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 18的核苷酸序列，如SEQ ID 72，或其至少10个连续核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 19的核苷酸序列，如SEQ ID 73，74或75，或其至少10个连续核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 20的核苷酸序列，如SEQ ID 76，或其至少10个连续核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 21的核苷酸序列，如SEQ ID 77，78或79，或其至少10个连续核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷 酸序列根据SEQ ID 22的核苷酸序列，如SEQ ID 80，或其至少10个连续核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
当确定本发明的寡聚物(或连续核苷酸序列)和编码哺乳动物雄激素受体的核酸 或其反向补体(如本文公开的那些)之间的“同源性”时，同源性可用本发明化合物的对应 核苷酸序列和编码哺乳动物雄激素受体的核酸(或靶核酸)的对应区或其反向补体通过简 单比对(alignment)而确定，且同源性通过计数对齐(align)的碱基数并除以本发明的化 合物中的连续核苷酸的总数，再乘以100而确定。在该比较中，如果存在缺口(gaps)，优选 该缺口仅为错配而不是下述区域，其中缺口内核苷酸数在本发明的核苷酸序列和靶核酸之 间不同。术语"对应于"和"相应于"是指寡聚物的核苷酸序列或连续核苷酸序列(第 一序列)与另一序列的等效连续核苷酸序列的比较，该另一序列的等效连续核苷酸序列选 自i)核酸靶的反向补体的子序列，如编码雄激素受体蛋白的mRNA JnSEQ ID而1，和/或 )本文提供的核苷酸的序列，如选自SEQ ID NOS :2_22和86-106，或其子序列。核苷酸类 似物直接与它们的等效或对应核苷酸比较。在i)或ii)下对应于另一序列的第一序列通 常在第一序列(如连续核苷酸序列)的整个长度上等同于该序列，或如本文所述，在一些实 施方案中，可与相应序列至少80 %同源，如至少85 %，至少90 %，至少91 %，至少92 %，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%同源，至少97%同源，至少98%同源，至少99%同源， 如100%同源(相同)。术语"相应核苷酸类似物"和"相应核苷酸"是指核苷酸类似物和天然存在的 核苷酸中的核苷酸是相同的。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元连接至腺嘌呤时，该"相 应核苷酸类似物"包含连接至腺嘌呤的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。长度该寡聚物包含长度总共为10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，
25，26，27，28，29或30个连续核苷酸的连续核苷酸序列，或由上述连续核苷酸序列组成。在一些实施方案中，该寡聚物包含长度总共为10-22，如12-18，如13_17或12_16， 如13，14，15，16个连续核苷酸的连续核苷酸序列，或由上述连续核苷酸序列组成。在一些实施方案中，该寡聚物包含长度总共为10，11，12，13，或14个连续核苷酸 的连续核苷酸序列，或由上述连续核苷酸序列组成。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由不超过22个核苷酸，如不超过20个核 苷酸，如不超过18个核苷酸，如15，16或17个核苷酸组成。在一些实施方案中本发明的寡 聚物包含小于20个核苷酸。核苷酸类似物本文所用的术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价连接的磷酸酯基的糖 苷，且包括天然存在的核苷酸和包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸，该 天然存在的核苷酸如DNA或RNA，优选DNA，包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的 核苷酸在此也称为“核苷酸类似物”。非天然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，如双环核苷酸或2’修饰的 核苷酸，如2’取代的核苷酸。“核苷酸类似物”为天然核苷酸如DNA或RNA核苷酸的变体，其经过在糖和/或 碱基部分的修饰。在寡核苷酸的情况下类似物可以原则上仅仅“沉默(silent)”或“等效 (equivalent) ”于天然核苷酸，即对于寡核苷酸抑制靶基因表达的作用方式没有功能上的O=P-N ^ \
吗啉代
2'-(3-羟基)丙基
3'-氨基骑酸酯 (Phosphoramidate)
O=P-BH3" 棚烷碌酸酯(Boranophosphates) 方案1因此该寡聚物可包含以下或由以下组成天然存在的核苷酸-优选2’_脱氧核苷 酸(在此通常称为“DNA”)的简单序列，但也可为核糖核苷酸(在此通常称为“RNA”)，或该 天然存在的核苷酸和一种或多种非天然存在的核苷酸(即核苷酸类似物)的组合。该核苷 酸类似物可适当地增强寡聚物对于靶序列的亲和力。合适的和优选的核苷酸类似物的实例通过PCT/DK2006/000512提供或在其中涉及。在寡聚物中加入增强亲和力的核苷酸类似物，如LNA或2’-取代的糖，可使特异结 合寡聚物的尺寸减小，还可将上限减少至非特异或异常结合发生前寡聚物的尺寸。在一些实施方案中，该寡聚物包含至少2个核苷酸类似物。在一些实施方案中，该 寡聚物包含3-8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。在迄今最优选的实施方案 中，所述核苷酸类似物的至少一个为锁核酸(LNA)；例如至少3或至少4，或至少5，或至少 6，或至少7，或8个核苷酸类似物可为LNA。在一些实施方案中所有核苷酸类似物可为LNA。
影响。如果例如，它们更容易制备或制备更廉价，或对储存或制备条件更稳定，或表示标签 或标记，这种“等效”类似物还是可以使用的。然而，优选地，该类似物将对寡聚物抑制表 达的方式有功能上的影响；例如通过产生增加的对靶的结合亲和力和/或增加的对细胞内 核酸酶的抗性和/或更方便性地转运至细胞。核苷类似物的具体实例描述于例如Freier & Altmann ；Nucl.Acid Res. ，1997，25，4429—4443 禾口 Uhlmann ；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3 (2)，293-213，和方案 1
疏代麟酸酯 (Phosphorthioate)
NH2
2'-AP
HNA
CeNA
PNA
B
O
(
O
KoV 0W
-B
/Wo
Y0T
应认识到当提及优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列(其仅由核苷酸组成)，由 该序列限定的本发明的寡聚物可包含相应的核苷酸类似物以代替所述序列中存在的一个 或多个核苷酸，如LNA单元或其它核苷酸类似物，其增加寡聚物/靶双链体的双链稳定性/ Tffl (即增强亲和力的核苷酸类似物)。在一些实施方案中，寡聚物的核苷酸序列和靶序列之间的任何错配优选在增强亲 和力的核苷酸类似物之外的区域，如在本文所述的B区内，和/或在本文所述的D区内，和/ 或在非修饰的位点如寡核苷酸中的DNA核苷酸，和/或在连续核苷酸序列的5’或3’的区。核苷酸的这些修饰的实例包括修饰糖部分以提供2’_取代基或产生桥接的(锁核 酸)结构，其增强结合亲和力且也可提供增加的核酸酶抗性。优选的核苷酸类似物为LNA，如氧基-LNA(如β-D-氧基-LNA，和α-L-氧 基-LNA)，和/或氨基-LNA (如β -D-氨基-LNA和α -L-氨基-LNA)和/或硫基-LNA (如 β -D-硫基-LNA和α -L-硫基-LNA)和/或ENA (如β -D-ENA和α -L-ENA)。最优选的为 β -D-氧基-LNA。在一些实施方案中，本发明的寡聚物中存在的核苷酸类似物(如在本文提及的A 和C区中)独立地选自，例如2，-0_烷基-RNA单元，2，-氨基-DNA单元，2，-氟-DNA单元， LNA单元，阿糖核酸(ANA)单元，2，-氟-ANA单元，HNA单元，INA (嵌入核酸(intercalating nucleic acid) -Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 200230 :4918_4925，在此引入作为参 考)单元和2’ MOE单元。在一些实施方案中，仅有一种上述类型的核苷酸类似物存在于本 发明的寡聚物或其连续核苷酸序列中。在一些实施方案中，该核苷酸类似物为2’ -0-甲氧基乙基_RNA(2’ Μ0Ε)， 2’ -氟-DNA单体或LNA核苷酸类似物，因此本发明的寡核苷酸可包括独立地选自这三种 类型类似物的核苷酸类似物，或可包括选自这三种类型类似物中的仅一种类型。在一些 实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一种为2’ M0E-RNA，如2，3，4，5，6，7，8，9或10个 2’-MOE-RNA核苷酸单元。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一种为2’-氟DNA， 如2，3，4，5，6，7，8，9或10个2，-氟-DNA核苷酸单元。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物包含至少一个锁核酸(LNA)单元，如1， 2，3，4，5，6，7，或8个LNA单元，如3_7或4至8个LNA单元，或3，4，5，6或7个LNA单元。在 一些实施方案中，所有核苷酸类似物为LNA。在一些实施方案中，该寡聚物可包含β-D-氧 基-LNA和一种或多种以下LNA单元两者β -D或α -L构型的硫基-LNA、氨基-LNA、氧 基-LNA、和/或ENA或其组合。在一些实施方案中，所有LNA胞嘧啶单元为5’甲基-胞嘧 啶。在本发明一些实施方案中，该寡聚物可包含LNA和DNA单元两者。优选LNA和DNA单 元的组合总共为10-25，优选10-20，甚至更优选12-16。在本发明一些实施方案中，寡聚物 的核苷酸序列，如连续核苷酸序列由至少一个LNA组成，且剩余核苷酸单元为DNA单元。在 一些实施方案中，该寡聚物仅包含LNA核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(如RNA或DNA， 最优选DNA核苷酸)，任选具有修饰的核苷酸间连接如硫代磷酸酯(phosphorothioate)。术语“核碱基”是指核苷酸的碱基部分且包括天然存在的以及非天然存在的变体。 因此，“核碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且包括杂环类似物及其互变异构体。核碱基的实例包括，但不限于腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸苷，尿嘧啶，黄嘌呤，次黄 嘌呤，5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤，
152-氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在一些实施方案中，寡聚物中存在的核碱基的至少一个为修饰的核碱基，其选自 5_甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤，2-氨基 嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。LNA术语“LNA”是指双环核苷酸类似物，称为“锁核酸(Locked Nucleic acid)”。其 可表示LNA单体，或当在“LNA寡核苷酸”的环境中使用时是指包含一种或多个该双环核苷 酸类似物的寡聚物。本发明的寡核苷酸化合物中使用的LNA优选具有通式I的结构，及其碱加成盐 (basic salts)和酸加成盐 其中X 选自-0-、-S-、-N(Rn*)-、-C(R6R6*)-；B选自氢、任选取代的Cy-烷氧基、任选取代的CV4-烷基、任选取代的Cy-酰基 氧基、核碱基、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基(import groups) 和配体；P表示与在后的单体之间的核苷间连接的基团位置，或5' _末端基团，该核苷间 连接或5'-末端基团任选包括取代基R5或等同适用取代基Rw ；P*表示与在前的单体的核苷间连接，或3'-末端基团；R4*和R2* —起表示由1-4个选自下列的基团/原子组成的二价基 团-C (RaRb) -，-C (Ra) = C (Rb) -，-C (Ra) = N-, _0_，-Si (Ra) 2_，-S-, -SO2-, -N (Ra)-和〉C = Z,其中Z选自-0-、-S-和-N (Ra) _，且Ra和Rb各自独立地选自氢、任选取代的C^12-烷 基、任选取代的C2_12-烯基、任选取代的c2_12-炔基、羟基、CV12-烷氧基、c2_12-烷氧基烷基、 c2_12-烯基氧基、羧基、CV12-烷氧基羰基、CV12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、 芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二 ((V6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单和二(Cp6-烷基)-氨基-羰基、氨基-Cu-烷基-氨基羰 基、单和二(Cu-烷基)氨基-CV6-烷基-氨基羰基、CV6-烷基-羰基氨基、脲基、Cu-烷酰 基氧基、磺基(sulphono)、CV6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫基(sulphanyl)、Cp6-烷 基硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基和配体，其中芳基 和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的(geminal)取代基Ra和Rb—起可表示任选取代 的亚甲基(=CH2)，且存在的取代基R1*、R2、R3、R5、R8*、R6和R6*各自独立地选自氢、任选取 代的CV12-烷基、任选取代的C2_12-烯基、任选取代的C2_12-炔基、羟基、Ci_12-烷氧基、C2_12-烷 氧基烷基、C2_12-烯基氧基、羧基、C1^12-烷氧基羰基、C1^12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、 单和二((V6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单和二沁_6-烷基)_氨基-羰基、氨基-Cp6-烷 基_氨基羰基、单和二沁_6_烷基)氨基-Cu-烷基_氨基羰基、C1^6-烷基_羰基氨基、脲 基、CV6-烷酰基氧基、磺基、Cp6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫基(sulphanyl) ,C1^6-烷 基硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基和配体、其中芳基 和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的取代基一起可表示氧代、硫代、亚氨基或任选取 代的亚甲基，或一起可形成由1-5个碳原子亚烷基链组成的螺环二价基团，所述亚烷基链 任选插入一个或多个杂原子/基团和/或被一个或多个杂原子/基团终止，所述杂原子/ 基团选自-o-、-s-和-(NRn)-，其中『选自氢和CV4-烷基，且其中两个相邻的(非成对的) 取代基可表示另一键，导致形成双键；且当存在且不涉及二价基团时，选自氢和CV4-烷 基；在一些实施方案中，R5*选自 H，-CH3, -CH2-CH3, -CH2-O-CH3 和-CH = CH2。在一些实施方案中，R4*和R2*—起表示二价基团，其选自-C(RaRb)-O-, -C(RaRb)-C (RcRd) -0-，-C (RaRb) -C (RcRd) -C (ReRf) _0_，-C (RaRb) -O-C (RcRd) -，-C (RaRb) -O-C (RcRd) _0_，-C (RaR b) -C (RcRd) -，-C (RaRb) -C (RcRd) -C (ReRf) -，-C (Ra) = C (Rb) -C (RcRd) -，-C (RaRb) -N (Rc) -，-C (RaR b) -C (RcRd) -N (Re) -，-C (RaRb) -N (Rc) -0-和-C (RaRb) -S-, -C (RaRb) -C (RcRd) _S_，其中 Ra，Rb，Rc， Rd，Re和Rf各自独立地选自氢，任选取代的Ch2-烷基，任选取代的C2_12-烯基，任选取代 的C2_12-炔基，羟基，C1^12-烷氧基，C2_12-烷氧基烷基，C2_12-烯基氧基，羧基，C1^12-烷氧基羰 基，C1^12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳基氧基_羰基，芳基氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳基氧 基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单和二((V6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单和二 ((V6-烷基)_氨基-羰基，氨基-Ch-烷基-氨基羰基，单和二沁_6-烷基)氨基-Cu-烷 基_氨基羰基，C1^6-烷基-羰基氨基，脲基，C1^6-烷酰基氧基，磺基，CV6-烷基磺酰基氧基， 硝基，叠氮基，硫基，Cp6-烷基硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基、热化学活性基、螯合 基、报道基和配体，其中芳基和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的取代基Ra* Rb —起 可表示任选取代的亚甲基(=CH2)，在另一实施方案中，R4*和R2*—起表示二价基团(bivalent group)，其选自-CH2-0-，-CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-N (CH3) _，-CH2-CH2-O-, -CH2-CH (CH3) _，-CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-,-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -CH2-CH2-CH (CH3)-,-CH = CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-0-，-CH2-N(CH3) -0-, -CH2-O-CH2-, -CH(CH3) -0-, -CH(CH2-O-CH3) _0_。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向。优选地，本发明的寡聚物中使用的LNA包括至少一个根据任一下式的LNA单元 其中Y为-0-、-O-CH2-, -S-、-NH-或N(Rh) ；Z和t独立地选自核苷酸间连接、末 端基团或保护基；B构成天然或非天然核苷酸碱基部分，且Rh选自氢和Cy-烷基。
特别优选的LNA单元示于方案2 方案2术语〃硫基-LNA"包括其中上述通式中的Y选自S或-CH2-S-的锁核苷酸。硫 基-LNA可为β -D禾Π α -L-构型。术语〃氨基-LNA 〃是指其中上述通式中的Y选自-N(H)-、N(R)-, CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-(其中R选自氢和Ch-烷基)的锁核苷酸。氨基-LNA可为β-D 和a-L-构型。术语〃氧基-LNA〃是指其中上述通式中的Y表示-0-或-CH2-O-的锁核苷酸。氧 基-LNA可为β -D禾Π α -L-构型。术语〃 ΕΝΑ"是指其中上述通式中的Y为-CH2-O-(其中-CH2-O-的氧原子连接至 相对碱基B的2’ -位)的锁核苷酸。在一个实施方案中，LNA选自β -D-氧基-LNA、α -L-氧基-LNA、β -D-氨基-LNA 和β -D-硫基-LNA，特别是β -D-氧基-LNA。RNAse 募集RNase介导的靶mRNA的降解起作用，如通过翻译的 位阻，或其它方法，然而，本发明优选的寡聚物能募集核糖核酸内切酶(RNase) ^RNase H。优选该寡聚物或连续核苷酸序列，包含至少6个，如至少7个连续核苷酸单元，如 至少8或至少9个连续核苷酸单元(残基)，包括7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个连续 核苷酸的区域，当其与互补靶RNA形成双链体时能募集RNase。能募集RNAse的连续序列可 为本文所述的缺口聚物(gapmer)段落中涉及的B区。在一些实施方案中，能募集RNAse的 连续序列(如B区)的尺寸可更大，如10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个核苷酸单兀。EP 1222309提供了体外测定RNaseH活性的方法，其可用于测定募集RNaseH的 能力。使用EP 1222309的实施例91-95提供的方法，如果当提供互补RNA靶时具有的 初始速率(以pmol/1/min测量)为等效的仅含DNA的寡核苷酸(equivalent DNA only oligonucleotide)的至少1%，如至少5%，如至少10%或少于20%，该等效仅含DNA的寡 核苷酸没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为该寡 聚物能募集RNaseH。在一些实施方案中，使用EP 1 222 309的实施例91_95提供的方法，如果当提供 互补RNA靶和RNaseH时，该RNaseH初始速率(以pmol/1/min测量)少于使用等效仅含DNA 的寡核苷酸测定的初始速率的1%，如少于5%，如少于10%或少于20%，该等效仅含DNA 的寡核苷酸没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为 该寡聚物基本不能募集RNase H。在其它实施方案中，使用EP 1 222 309的实施例91_95提供的方法，如果当提供 互补RNA靶和RNaseH时，该RNaseH初始速率(以pmol/1/min测量)，为使用等效仅含DNA 的寡核苷酸测定的初始速率的至少20 %，如至少40 %，如至少60 %，如至少80 %，该等效仅 含DNA的寡核苷酸，没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸间具有硫代磷酸酯连接基， 则认为该寡聚物能募集RNase H。通常，形成连续核苷酸单元的寡聚物的区域，当与互补靶RNA形成双链体时，能募 集由核苷酸单元(其与RNA靶形成DNA/RNA状的双链体)组成的RNase-且包括α -L构型 的DNA单元和LNA单元，特别优选为α -L-氧基LNA。本发明的寡聚物可包含核苷酸序列，其包括核苷酸和核苷酸类似物，且可为缺口 聚物(gapmer)、头聚物(headmer)或混合聚物(mixmer)的形式。头聚物如下定义在5’ -端的连续的一段非_募集RNase的核苷酸类似物，接着 直到3’-端的连续的一段可由RNAse识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸单元(如至少7个 该核苷酸)，而尾聚物(tailmer)如下定义在5’-端的连续的一段可由RNAse识别和裂解 的DNA或修饰的核苷酸(如至少7个该核苷酸)，接着直到3’ -端的连续的一段非_募集 RNase的核苷酸类似物。其它根据本发明的嵌合体，称为“混合聚物”，其由下述交替组分构 成可由RNAse识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸，和非-募集RNase的核苷酸类似物。一 些核苷酸类似物也能介导RNaseH结合和裂解。因为α-L-LNA募集RNaseH活性到一定程 度，可能需要可由RNaseH识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸的较小缺口区(gap)用于缺口 聚物构建体，且混合聚物构建中会引入更多的柔性(flexibility)。缺口聚物设计
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优选地，本发明的寡聚物是缺口聚物。缺口聚物寡聚物是包含一段连续的核苷酸 的寡聚物(该核苷酸能募集RNAse，如RNAseH)，如至少6或7个DNA核苷酸的区域，在本文 称为B区，其中B区在5’和3’都侧翼有增强亲和力的核苷酸类似物的区域，如1-6个核苷 酸类似物，5’和3’连接至一段连续的能募集RNAse的核苷酸-这些区分别称为A区和C 区。优选该缺口聚物包含下式的(多)核苷酸序列(5’至3’)A-B_C，或任选A-B-C-D 或D-A-B-C，其中；A区(5’区)由以下组成或包含以下至少一个核苷酸类似物，如至少一 个LNA单元，如1-6个核苷酸类似物，如LNA单元，和；B区由以下组成或包含以下至少5 个能募集RNAse (当与互补RNA分子，如mRNA靶形成双链体时)的连续核苷酸，如DNA核苷 酸，和；C区(3’区)由以下组成或包含以下至少一个核苷酸类似物，如至少一个LNA单 元，如1-6个核苷酸类似物，如LNA单元，和；D区，当存在时由以下组成或包含以下1，2或 3个核苷酸单元，如DNA核苷酸。在一些实施方案中，A区由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物(如LNA单元)组成， 如2-5个核苷酸类似物，如2-5个LNA单元，如3或4个核苷酸类似物，如3或4个LNA单 元；和/或C区由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物(如LNA单元)组成，如2_5个核苷酸类 似物，如2-5个LNA单元，如3或4个核苷酸类似物，如3或4个LNA单元。在一些实施方案中，B由以下组成或包含以下5，6，7，8，9，10，11或12个能募集 RNAse的连续核苷酸，或6-10，或7-9，如8个能募集RNAse的连续核苷酸。在一些实施方案 中，B区由以下组成或包含以下至少一个DNA核苷酸单元，如1-12个DNA单元，优选4_12 个DNA单元，更优选6-10个DNA单元，如7_10个DNA单元，最优选8，9或10个DNA单元。在一些实施方案中，A区由3或4个核苷酸类似物(如LNA)组成，B区由7，8， 9或10个DNA单元组成，且C区由3或4个核苷酸类似物(如LNA)组成。这些设计包括 (A-B-C)3-10-3，3-10-4，4-10-3，3—9—3，3—9—4，4—9—3，3—8—3，3—8—4，4—8—3，3—7—3，3—7—4， 4-7-3，且可进一步包括D区，其可具有1个或2个核苷酸单元，如DNA单元。其它缺口聚物设计公开于W02004/046160且在此引入作为参考。美国临时申请，60/977409，在此引入作为参考，涉及‘短聚物(shortmer)，缺口聚 物寡聚物，在一些实施方案中，其可为本发明的缺口聚物寡聚物。在一些实施方案中，该寡聚物由总共10，11，12，13或14个核苷酸单元的连续核苷 酸序列组成，其中该连续核苷酸序列为式(5’ -3’)，A-B-C，或任选A-B-C-D或D-A-B-C，其 中；A由1，2或3个核苷酸类似物单元(如LNA单元)组成；B由7，8或9个连续核苷酸单 元组成，当与互补RNA分子(如mRNA靶)形成双链体时，所述核苷酸单元能募集RNAse ；且 C由1，2或3个核苷酸类似物单元(如LNA单元)组成。当存在时，D由单一 DNA单元组 成。在一些实施方案中，A由1个LNA单元组成。在一些实施方案中，A由2个LNA单元 组成。在一些实施方案中，A由3个LNA单元组成。在一些实施方案中，C由1个LNA单元组 成。在一些实施方案中，C由2个LNA单元组成。在一些实施方案中，C由3个LNA单元组 成。在一些实施方案中，B由7个核苷酸单元组成。在一些实施方案中，B由8个核苷酸单 元组成。在一些实施方案中，B由9个核苷酸单元组成。在一些实施方案中，B包含1-9个 DNA单元，如2，3，4，5，6，7或8个DNA单元。在一些实施方案中，B由DNA单元组成。在一些
20实施方案中，B包含至少一个0-14勾型的11^单元，如2，3，4，5，6，7，8或9个α-L-构型的 LNA单元。在一些实施方案中，B包含至少一个α-L-氧基LNA单元或其中所有α-L-构型 的LNA单元为α-L-氧基LNA单元。在一些实施方案中，A_B_C中存在的核苷酸数选自(核 苷酸类似物单元-B区-核苷酸类似物单元):1-8-1，1-8-2，2-8-1，2-8-2，3-8-3，2-8-3， 3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4,2-8-4，或；1—9—1，1—9—2，2—9—1，2—9—2，2—9—3，3—9—2，1—9—3， 3-9-1,4-9-1,1-9-4，或；1-10-1,1_10_2，2-10—1，2-10—2，1_10_3，3-10-1。在一些实施方 案中，A-B-C 中的核苷酸数选自-.2-7-1,1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2，3-7-4 和 4-7-3。 在一些实施方案中，A和C各自都由两个LNA单元组成，且B由8或9个核苷酸单元，优选 DNA单元组成。核苷酸间连接术语〃连接基〃或“核苷酸间连接(internucleotide linkage) ”是指能将两个核 苷酸、两个核苷酸类似物、以及核苷酸和核苷酸类似物等共价结合在一起的基团。具体且优 选的实例包括磷酸酯基(phosphate group)和硫代磷酸酯基(phosphorothioate)。本发明的寡聚物或其连续核苷酸序列的核苷酸通过连接基结合在一起。合适地， 各核苷酸通过连接基连接至3’邻近的核苷酸。合适的核苷酸间连接包括列于PCT/DK2006/000512的那些，例如列于PCT/ DK2006/000512的第34页第一段的核苷酸间连接(在此引入作为参考)。也就是说，在一些实施方案中，优选将核苷酸间连接从其正常磷酸二酯修饰为对 核酸酶攻击更有抗性的基团，如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)-这两个可 被RNase H裂解，也产生在减少靶基因的表达中反义抑制的途径。本文提供的合适的含硫(S)核苷酸间连接可为优选的。硫代磷酸酯核苷酸间连接 也是优选的，尤其对于缺口聚物的缺口(gap)区(B)。硫代磷酸酯连接也可用于侧翼区(A 和C，和用于将A或C连接至D，和在D区内，视情况而定)。然而A、B和C区可包含除硫代磷酸酯外的其它核苷酸间连接，如磷酸二酯连接，特 别地，例如当使用核苷酸类似物防止A和C区内的核苷酸间连接被内切核酸酶降解-如当 A和C区包含LNA核苷酸时。寡聚物中的核苷酸间连接可为磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯以使得RNase H裂解靶向的RNA。优选硫代磷酸酯，这是由于改善的核酸酶抗性和其它原因，如易于制备。在本发明的寡聚物的一个方面，该核苷酸和/或核苷酸类似物通过硫代磷酸酯基 彼此连接。应认识到将磷酸二酯连接，如一个或两个连接，加入到其它硫代磷酸酯寡聚物，特 别是介于核苷酸类似物单元之间或相邻于核苷酸类似物单元(典型地在A区和或C区)，可 修饰寡聚物的生物利用度和/或生物分布_参见W02008/053314，在此引入作为参考。在一些实施方案中，如上述实施方案，其中适当且非具体表明，所有剩余的连接基 为磷酸二酯或硫代磷酸酯，或其混合物。在一些实施方案中，所有核苷酸间连接基为硫代磷酸酯。当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列时，如那些在此提供的，应理解在多种实施 方案中，当该连接为硫代磷酸酯连接时，可使用如那些在此公开的其它连接，例如可使用磷 酸酯(磷酸二酯)连接，特别是用于核苷酸类似物，如LNA单元之间的连接。同样，当涉及具体缺口聚物寡核苷酸序列时，如在此提供的那些，当C残基注释为5’甲基修饰的胞嘧啶 时，在多种实施方案中，寡聚物中存在的一个或多个C可为未修饰的C残基。寡聚化合物(o ligomeri c compound)本发明的寡聚物，例如，可选自22-43和44至80。缀合物在本文中术语"缀合物(conjugate)“是表示通过将本文所述的寡聚物共价连接 (“缀合”)至一个或多个非核苷酸或非多核苷酸部分而形成的异源(heterogenous)分子。 非核苷酸或非多核苷酸部分的实例包括大分子试剂如蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、 聚合物或其组合。典型的蛋白质可为靶蛋白的抗体。典型聚合物可为聚乙二醇。因此，在多种实施方案中，本发明的寡聚物可包含多核苷酸区和另一非核苷酸区 两者，该多核苷酸区通常由核苷酸的连续序列组成。当涉及本发明的由连续核苷酸序列组 成的寡聚物，该化合物可包含非核苷酸组分，如缀合物组分。在本发明多种实施方案中，该寡聚化合物连接至配体/缀合物，其可用于例如增 加寡聚化合物的细胞吸收。W02007/031091提供了合适的配体和缀合物，其在此引入作为参考。本发明还提供缀合物，其包含本文所述的根据本发明的化合物和至少一个共价连 接至所述化合物的非核苷酸或非多核苷酸部分。因此，在多种实施方案中，其中本发明的化 合物由特定的核酸或核苷酸序列组成，如本文所公开，该化合物也可包含至少一个非核苷 酸或非多核苷酸部分(例如不包含一个或多个核苷酸或核苷酸类似物)共价连接至所述化 合物。缀合(至缀合物部分)可增强本发明的寡聚物的活性、细胞分布(cellular distribution)或细胞吸收。这些部分包括，但不限于，抗体、多肽、脂质部分如胆固醇部 分、胆酸、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫胆固醇(thiocholesterol)、脂肪链，例如， 十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂，例如，二 _十六烷基-rac-甘油或1，2- 二 十六烷 基-rac-甘油-3-h-膦酸三乙基铵、聚胺或聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基 胺或己基氨基_羰基-氧基胆固醇部分。本发明的寡聚物还可缀合至活性药物物质，例如，阿司匹林，布洛芬，磺胺药物，抗 糖尿病药，抗菌素或抗生素。在一些实施方案中，该缀合的部分为固醇，如胆固醇。在多种实施方案中，该缀合的部分包含或由以下组成带正电荷的聚合物，如带正 电荷的肽，例如长度为1-50，如2-20如3-10个氨基酸残基，和/或聚环氧烷如聚乙二醇 (PEG)或聚丙二醇-参见WO 2008/034123，在此引入作为参考。合适地，该带正电荷的聚合 物，如聚环氧烷可通过连接基连接至本发明的寡聚物，如描述于WO 2008/034123的可释放 的连接基。作为实例，以下缀合物部分可用于本发明的缀合物 活化的寡聚物本文所用的术语“活化的寡聚物”，是指共价连接(即，官能化)至至少一个官能 部分(functional moiety)的本发明的寡聚物，该官能部分允许寡聚物共价连接至一个或 多个缀合的部分(即本身不为核酸或单体的部分)，以形成本文描述的缀合物。典型地， 官能部分将包含能通过以下共价连接至寡聚物的化学基团例如，腺嘌呤碱基的3’ -羟基 或环外NH2基，优选亲水性的间隔基(spacer)和能结合至缀合的部分的末端基团(例如， 氨基、巯基或羟基)。在一些实施方案中，末端基团未被保护，例如，为NH2基团。在其它实 施方案中，末端基团被保护，例如，被任何合适的保护基，如描述于Theodora W Greene和 Peter G M Wuts,第三版(John Wiley & Sons, 1999)的"Protective Groups in Organic Synthesis"的那些保护。合适的羟基保护基的实例包括酯如乙酸酯，芳烷基如苄基，二苯 基甲基，或三苯基甲基和四氢吡喃基。合适的氨基保护基的实例包括苄基，α-甲基苄基，二 苯基甲基，三苯基甲基，苄基氧基羰基，叔丁氧基羰基和酰基如三氯乙酰基或三氟乙酰基。 在一些实施方案中，该官能部分是自裂解的(self-cleaving)。在其它实施方案中，该官能 部分为生物可降解的。参见例如，美国专利号7，087，229，其以其整体在此引入作为参考。在一些实施方案中，本发明的寡聚物在5’端官能化以使缀合的部分共价连接至寡 聚物的5’端。在其它实施方案中，本发明的寡聚物可在3’端官能化。在其它实施方案中， 本发明的寡聚物可沿着主链或在杂环碱基部分上官能化。在其它实施方案中，本发明的寡 聚物可在多于一个位置官能化，所述位置独立地选自5’端、3’端、主链和碱基。在一些实施方案中，本发明的活化的寡聚物通过在合成过程中掺入一个或多个共 价连接至官能部分的单体而合成。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚物使用未被官 能化的单体合成，且该寡聚物在合成完成后官能化。在一些实施方案中，该寡聚物使用含氨 基烷基连接基的位阻酯(hindered ester)官能化，其中该烷基部分具有式(CH2)w，其中w为 1至10的整数，优选约6，其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的链，且其中该官能团 通过酯基(-O-C(O)-(CH2)wNH)连接至寡聚物。在其它实施方案中，该寡聚物使用含(CH2)W-巯基(SH)连接基的位阻酯官能化， 其中w为1至10的整数，优选约6，其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的链，且其中 该官能团通过酯基(-O-C(O)-(CH2)wSH)连接至寡聚物。在一些实施方案中，巯基-活化的寡核苷酸与聚合物部分如聚乙二醇或肽缀合 (通过二硫键的形成)。上述包含位阻酯的活化的寡聚物可通过本领域已知的任何方法合成，且特别是通 过公开于PCT
发明者杰斯珀·沃姆 申请人:桑塔里斯制药公司;安佐制药股份有限公司