专利名称：李氏杆菌病疫苗及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗及这种疫苗的制备方法，确切讲是李氏杆菌疫苗及制备方法。
背景技术：
李氏杆菌病(Listeriosis)又名旋转病(Circlingdisease)，是由单核细胞增多 性李氏杆菌(L. monocytogenes)引起的一种重要的人畜共患传染病。该病发病率较低，但 死亡率却很高，各种年龄、不同种类的畜、禽和野生动物以及人均可感染李氏杆菌而发病。 家畜主要以幼龄和妊娠母畜较易感，且发病较急，主要表现为脑膜脑炎、败血症和妊娠母畜 流产。家禽和啮齿类动物则表现为坏死性肝炎和心肌炎。人感染后症状不一，以脑膜炎为 多见。自1926年首次分离到本病病原后，李氏杆菌病现已呈世界性分布。
近年来，因食品污染本菌而引起的食品中毒病例频繁发生，使李氏杆菌病作为一 种重要的食物源性传染病在世界范围内对食品安全及人类健康造成极大的危害。对于李氏 杆菌病的传播，世界各国予以高度重视并投入大量资金用于研究，以有效防控李氏杆菌病 的发生。由于李氏杆菌的血清型变种较多，而且属胞内菌，感染宿主后主要激发的是细胞免 疫应答，所以至今尚未有效的疫苗应用于实践。因此，对本病的有效控制已成为当务之急， 研制高效、实用、安全的李氏杆菌疫苗已迫在眉睫。 由于李氏杆菌灭活后不能产生溶血素等毒力因子。因此，其灭活疫苗的免疫效价 较低，免疫效果不佳。 一些研究已证明，以溶血素作为添加剂的灭活疫苗能大大提高灭活疫 苗的免疫保护效果，但溶血素本身毒性很强，剂量稍过高就会导致宿主的毒性反应，甚至死 亡。因此，本研究以体外表达的P60蛋白作为灭活疫苗的添加剂，使甲醛灭活的李氏杆菌疫 苗的免疫保护效果大大提高。
发明内容
本发明提供一种有较高免疫效价、可明显提高李氏杆菌灭活疫苗免疫效果，并有
较大安全性的李氏杆菌病疫苗，该疫苗能有效预防动物李氏杆菌病的感染。 本发明涉及的疫苗由P60蛋白100 i！ g， 109个李氏杆菌灭活菌及与抗原等体积的
佐剂构成。本发明所用的P60为重组蛋白。 本发明的李氏杆菌疫苗的制备方法是 a.P60重组蛋白制备 以单核细胞增多性李氏杆菌基因组DNA为模板，以上游引物Pl和下游引物P2进 行PCR扩增，Pl和P2的序列如下 上游引物P1:5' -ACCGAATTCATGAAAAAAGCAACTATCGCGGCT-3'; 下游引物P2 :5' -ACCCTCGAGCTAAGCTTTTCCAAGGTGTTTTTGA-3' 双酶切PCR产物和pET-30a，然后回收目的片段和载体片段，用连接酶连接，将P60
基因定向插入pET-30a表达载体，构建成重组表达载体pET-P60，将pET-P60转化BL21 (DE3)
3感受态细菌后，挑选单菌落，接种含卡那霉素(50i!g/mL)的LB培养基中，加IPTG(终浓度 为lmmol/L)诱导3 7h。将诱导表达的菌液离心收集菌体，经反复冻融及超声波处理后收 集上清，过镍琼脂糖亲和柱，用含有100mmol/L咪唑的缓冲液洗脱，收集洗脱峰得到纯化的 P60重组蛋白； b.单核细胞增多性李氏杆菌的灭活； 取李氏杆菌菌液接入LB培养液中，再在菌液中加入终浓度O. 5%的甲醛灭活12小 时； c.取P60重组蛋白、单核细胞增多性李氏杆菌的灭活菌及佐剂进行复配，得李氏 杆菌疫苗。 根据相关的实验表明，本发明的疫苗对动物有较好的安全性，同时有较高的免疫 效价和免疫保护效果。
具体实施例方式
以下为本发明的一个具体制备方法及相关的实验结果。
通过以下实施例对本发明做进一步说明 本实验中所有相关数据均采用SPSS软件进行统计学分析。
实施例一 入侵相关蛋白P60的制备 1. P60蛋白基因RT-PCR扩增及克隆 入侵相关蛋白P60是根据GenBank中已登录的L. monocytogenes P60蛋白基因序 列，设计特异性引物P1和P2，通过RT-PCR扩增并克隆获得的。为下一步亚克隆的需要，分 别在上、下游引物中引入EcoR I和Xho I酶切位点，并加有3个保护性碱基，预期扩增长度 为1122bp。Pl:5' -ACCGAATTCATGAAAAAAGCAACTATCGCGGCT-3';
P2:5' -ACCCTCGAGCTAAGCTTTTCCAAGGTGTTTTTGA-3' 用SDS-蛋白酶K法提取单核细胞增多性李氏杆菌基因组DNA，按如下反应体系进 行PCR扩增PCR反应体系(50. 0 ii L)，模板2 ii L， 10XPCR buffer 5 ii L，引物Pl (50pmo1/ ii L) 、 P2 (50pmo1/ ii L)各0. 5 ii L， 2. 5mmol/L dNTP 4 ii L， DEPC处理水37. 5 ii L， TaqDNA聚 合酶0. 5 ii L (5U/ii L) 。 PCR反应条件95。C预变性5min，94。C 30s，56。C 30s，72。C 60s，共35 个循环；然后72t:再延伸10min。用1. 2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。切下目的DNA片 段，用凝胶回收试剂盒回收，置-2(TC保存备用。
2.表达载体pET-P60的构建及重组蛋白的表达与检测 用EcoR I和Xho 1分别双酶切PCR产物和pET30a，然后回收目的片段和载体片 段，用T4DNA连接酶连接过夜，将P60基因定向插入pET30a表达载体，构建成重组表达载体 pET-P60，并用酶切和PCR鉴定阳性克隆。将pET-P60转化感受态菌BL21(DE3)后，挑选单菌 落，接种含卡那霉素(50 ii g/mL)的LB培养基中，加IPTG (终浓度为lmmoL/L)诱导3 7h。 将表达产物用12%分离胶进行SDS-PAGE电泳，检测目的蛋白的表达，通过凝胶薄层扫描检 测表达量，转膜后进行Western blot分析，结果表明，该重组蛋白可被抗L. monocytogenes 多克隆抗体识别。
3. P60重组蛋白的纯化
将诱导表达的菌液离心收集菌体，经反复冻融及超声波处理后收集上清，过镍琼 脂糖凝胶柱，用含有100mmol/L咪唑的缓冲液洗脱，收集洗脱峰，用SDS-PAGE检测蛋白分子 量大小和纯度，测定纯化蛋白的含量后放入-7(TC保存备用。
实施例二 单核细胞增多性李氏杆菌的灭活 取冻存李氏杆菌菌液50iiL接入5mL LB中，37。C、230r/min振摇过夜。取过夜菌 lmL接入2000mL的LB培养液中，振摇培养2 3小时后，离心，加10ml灭菌生理盐水混匀。 先取5 ii L液体稀释到101Q倍，均匀涂布于40个LB平板上，过夜培养后，计数各板的克隆形 成单位(Clony form皿it， CFU)，并求出平均值，计算出菌液的浓度；然后在剩余菌液中加 入终浓度0. 5%的甲醛灭活12小时，再依上法涂LB平板，观察是否有菌落生长，从而确定细 菌是否灭活完全。 实施例三组合疫苗的免疫效果
1.实验动物的分组与免疫 BALA/c小鼠，体重16 18克，每组10只，雌雄各半。于第0、21、42天皮下注射 下组各配方的疫苗0. 2mL。分别在每次免疫后第21天采集鼠血液标本，分离血清后冻存 于-20。C备用。 各组实验动物免疫剂量及动物只数 P60组P60重组蛋白100 ii g， Montanide ISA206油佐剂，10只BALA/c小鼠。
灭活菌组109个灭活菌，Montanide ISA206油佐剂，10只BALA/c小鼠。
溶血素组重组溶血素蛋白30 ii g，Montanide ISA206油佐剂，10只BALA/c小鼠。
P60+灭活菌组:P60重组蛋白100 ii g， 109个灭活菌，Montanide ISA206油佐剂， 10只BALA/c小鼠。 P60+溶血素组P60重组蛋白100 ii g，重组溶血素蛋白30 ii g， MontanidelSA206 油佐剂，10只BALA/c小鼠。 灭活菌+溶血素组109个灭活菌，重组溶血素蛋白30ii g， Montanide ISA206油
佐剂，10只BALA/c小鼠。 对照组PBS ， 10只BALA/c小鼠。 2.免疫鼠血清抗体的检测 将纯化的P60重组蛋白用0. 02mol/L的PBS (pH 7. 2)稀释为5 y g/mL，包被96孔 酶标板，100yL/孔，37t:放置2小时，4t:放置过夜。次日用5%脱脂奶粉液封闭酶标板， 200 ii L/孔，37t:孵育1小时，用PBST洗液洗板3遍，拍干。将各组小鼠血清用PBST进行 25倍稀释后，100 ii L孔加入酶标板中，37t:反应1小时，洗涤3次后加入羊抗鼠辣根过氧化 物酶标记的二抗，37t:反应1小时后洗涤3次，加入底物液避光显色15分钟，以2mol/L的 硫酸终止反应，测定A450/650值，以平均值的2. 1倍作为Cut off值。小鼠血清从25倍开 始稀释，倍比稀释至3200倍。以A450/650值大于或等于Cut off值的最高血清稀释度为 效价。各组免疫动物血清抗P60蛋白的几何平均滴度实验结果见表1。
表1不同免疫组小鼠的血清抗体几何平均滴度
组别剂量动物数2免后21天3免后21天(mL/只)(只)GMTSDGMTSD
P60 (500ng/mL)0.2101873,373912.85
溶血素(150ng/mL)0,210532.52982.41
灭活菌(5xl()9/mL)0.210461.79842.34
P60 (500ng/mL) +溶 血素(150pg/mL)0.2101942.854143.12
溶血素(500|ag/mL) + 灭活菌(5xl()9/mL)0.2102122.444262.73
P60 (500ng/mL) +灭 活菌(5xl()9/mL)0.2104772.288192.68 从表1可以看出，用P60+灭活菌免疫的小鼠，第2、3次免疫后的抗体几何平均滴 度(Geometric Mean Titer, GMT)显著高于其它各组(P < 0. 05);溶血素+灭活菌组、P6(H 溶血素组和P60组三组小鼠比较，GMT无显著性差异(P > 0. 05)，但与溶血素组和灭活菌组 比较，有显著性差异(P<0.05) ;P60+灭活菌组与溶血素组和灭活菌组比较，抗体几何平均 滴度差异极显著(P > 0. 01)。
3.免疫保护性研究 三免采血后，每只小鼠腹腔注射2 X 106 (半数致死量)个活菌，每组随机抽取5只 小鼠，记录2周内小鼠死亡时间及只数，记录结果见表2 ;剩余的5只小鼠，48小时后，颈椎 脱臼处死，分别无菌摘取每只小鼠脾脏仔细磨碎后，用2. 5mL含1X蛋白胨的PBS(0. 02mol/ L)冲洗后收集洗脱液，取10 L冲洗液用PBS稀释，均匀涂布于MMA李氏杆菌选择培养基 平板，依照CFU法计数每份样品的菌落数，分别计算出各组10 L冲洗液中所含菌数的平均
log(组别菌数)
值，以及含菌的几何增长率(
log(对照组)
表2攻毒后各免疫组小鼠死亡时间及只数
"00%)，结果见表3。
组 别动物 数(只)攻毒后动物死亡时间及数量
第l天死亡3天内死亡数6天内死亡2周后死亡
数(只)(只)数(只)数(只)
P60 (500吗/mL)5只02
溶血素(150|_ig/mL)5只000
灭活菌(5xl()9/mL)5只000
P60 (500ng/mL) +溶 血素(150ng/mL)5只0015
溶血素(500pg/mL) + 灭活菌(5xl()9/mL)5只0011
P60 (500吗/mL) +灭 活菌(5xl()9/mL)5只0025
P60 (500|ag/mL)5只0000 从表2中可以看出，攻毒后第3天，对照组开始有小鼠死亡，其它各组小鼠均健活； 攻毒后第6天，对照组小鼠全部死亡，灭活菌组、溶血素+灭活菌组、P60+溶血素组的小鼠
6开始死亡；攻毒2周后，用P60+灭活菌组合疫苗免疫小鼠在攻毒实验中5只小鼠全部存活， 其它各组均有不同数量的小鼠死亡，其中溶血素组、灭活菌组、溶血素+灭活菌组和对照组 全部死亡。 表3 10 ii L小鼠脾脏洗液中各组LM平均计数及其几何增长率
组别 对照组
P60
溶血素 灭活菌
P60+溶 溶血素+ P60+灭 血素 灭活菌 活菌
动物数 (只)
(个)
细菌几何 增长率 (%)
104 ±531
100
100 ±5.2
50
848 ±13.2
73.12
1236 ±34.5
77.3
54 ±3.5
43.3
588 ±8.2
69.2
±0.56
21.13 从表3中可以看出，试验小鼠在攻毒(2Xl(f个活菌)48小时后，平均每只小鼠 10 y L脾脏洗液中，对照组含菌的个数为104个，以此定为LM菌在小鼠脾脏中的几何增长率 为100%， P60+灭活组菌的几何增长率为21. 13%，其它各组都接近或超过50%，灭活菌组 高达77.3%;对照组含菌的个数(104个)远大于其它各组，是灭活菌组(1236个)的8.09 倍，是P60+灭活菌组(7个)的1428. 57倍；细菌含量最少的两组比较表明，P60+溶血素组 (54个)是P60+灭活菌组(7个)的7. 7倍。 从以上结果可以看出，无论是攻毒后的小鼠存活率，还是细菌在小鼠体内的繁殖 率，P60+灭活菌组合疫苗的免疫效果都明显优于灭活菌单独免疫组，说明重组P60蛋白加 入李氏杆菌灭活疫苗后能大大提高灭活疫苗的免疫保护效果。 研究表明，在对单核细胞增多性李氏杆菌的免疫反应中，分泌性蛋白质是CD/和 CD8+T细胞识别的主要抗原，其中最主要的两个保护性抗原是LLO和P60。 LLO是单核增多性 李氏杆菌分泌的主要毒素蛋白，但其毒性太强，在免疫非致死剂量范围内，很难达到理想的 保护效果。研究表明，李氏杆菌灭活疫苗保护性较低的原因是在李氏杆菌灭活后，溶血素、 P60等主要毒力因子遭到破坏，导致免疫原性降低，保护力减弱。P60蛋白单独作为抗原免 疫动物，仍然得不到满意的保护效果，可能是其抗原表位单一，产生抗体类别较少，不足以 形成复杂的防御体系网；而P60与灭活全菌联合免疫，可使灭活菌中遭破坏的毒力因子浓 度大大提高，而菌体因灭活不能在宿主体内复制，从而使添加P60的灭活菌与活菌达到相 同的免疫效果，但其对动物的安全性却大大提高。实验证明，李氏杆菌灭活菌与其入侵相关 蛋白P60组合疫苗免疫动物不仅使灭活疫苗的保护率提高到100%，而且攻毒后细菌的几 何增长率从77%降低到21%，说明组合疫苗具有很好的免疫保护效果。因此，本发明的疫 苗是一种新型、高效的李氏杆菌疫苗。
附基因序列表
〈210>1
〈211>33
〈212>DNA 〈213>人工序列(上游引物) 〈400> accgaattca tgaaaaaagc aactatcgcg get 33 〈210>2 〈211>34 〈212>DNA 〈213>人工序列(下游引物) 〈400〉 accctcgagc taagcttttc caaggtgttt ttga 3权利要求
李氏杆菌病疫苗，其特征是疫苗由P60蛋白100μg，109个李氏杆菌灭活菌及与抗原等体积的佐剂构成。
2. 根据权利要求1所述的李氏杆菌病疫苗，其特征是P60为重组蛋白。
3. 权利要求2所述的李氏杆菌疫苗的制备方法，其特征是a. P60重组蛋白制备以单核细胞增多性李氏杆菌基因组DNA为模板，以上游引物PI和下游引物P2进行PCR 扩增，P1和P2的序列如下上游引物P1 :5' -ACCGAATTCATGAAAAAAGCAACTATCGCGGCT-3'; 下游引物P2 :5' -ACCCTCGAGCTAAGCTTTTCCAAGGTGTTTTTGA-3'双酶切PCR产物和pET-30a，然后回收目的片段和载体片段，用连接酶连接，将P60基因 定向插入pET-30a表达载体，构建成重组表达载体pET-P60，将pET_P60转化BL21 (DE3)感 受态细菌后，挑选单菌落，接种含卡那霉素(50i!g/mL)的LB培养基中，加IPTG(终浓度为 lmmol/L)诱导3 7h。将诱导表达的菌液离心收集菌体，经反复冻融及超声波处理后收集 上清，过镍琼脂糖亲和层析柱，用含有10Ommol/L咪唑的缓冲液洗脱，收集洗脱峰得到纯化 的P60重组蛋白；b. 单核细胞增多性李氏杆菌的灭活；取李氏杆菌菌液接入LB培养液中，再在菌液中加入终浓度0. 5%的甲醛灭活12小时；c. 取P60重组蛋白、单核细胞增多性李氏杆菌的灭活菌及佐剂进行复配，得李氏杆菌疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种疫苗及这种疫苗的制备方法，确切讲是李氏杆菌疫苗及制备方法。本发明涉及的疫苗由P60蛋白100μg，109个李氏杆菌灭活菌及与抗原等体积的佐剂构成。本发明所用的P60为重组蛋白。
文档编号C12N1/36GK101698100SQ20091020505
公开日2010年4月28日 申请日期2009年10月25日 优先权日2009年10月25日
发明者周邦信, 巩伟, 张少华, 才学鹏, 赵松波, 骆学农 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所