专利名称：原位qcm环介导恒温核酸扩增快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种恒温核酸扩增检测方法，特别是一种原位QCM环介导恒温核酸扩 增快速检测方法，属分子生物学检测技术领域，可用于病原菌以及其他生物核酸的快速检 测。
背景技术：
常规的病原菌检测方法(例如，大量增殖菌数、菌落纯化分离、外部形态结构和生 理生化鉴定以及血清学鉴定等)由于其耗时费力、步骤繁琐等不足之处，已经愈来愈满足 不了人类对致病微生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。因此，研究人员从分子生物学水 平来研究病原菌的核酸结构和分子特征，以提高对病原菌的检测和研究能力。目前，在病原 菌的分子生物学检测方法中，核酸扩增法是最有效的方法之一。聚合酶链式反应(PCR)方法是至今使用最广泛的核酸扩增方法，它作为一种简便 高效的基因扩增技术在病原菌检测过程中发挥着重大作用。但其操作过程必须有高精密的 温度循环装置及配套检测装备，使得该方法难以在基层广泛推广应用。除此以外，还有其他 核酸扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。 这些方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1小时左右可将目标核酸扩增到相似的范围 内，但它们对目标序列的扩增特异性不强，需要复杂的后续实验操作手段来检测扩增产物。DNA 环介导恒温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification of DNA, LAMP)技术，是日本荣研化学开发的替代PCR的简便、快速、准确并成本低廉的核酸检测方 法，已在世界范围申请技术专利。LAMP技术克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下 能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性。虽然已公开的LAMP技术具 有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是1、为 了满足扩增所需要的DNA的量，必须增殖病原菌的数量；但是，对于一些特殊的样品，细菌 的增殖是很困难的；2、仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现 反应小型化，限制其进一步发展；3、需要对引物进行荧光标记，在荧光显微镜下观察判断结 果；4、检测时间较长，需要0. 5至1. 5小时进行循环链置换反应。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，在环介导恒温核酸扩增(LAMP)技 术平台引入石英晶体微天平OiCM)技术，提供一种原位QCM环介导恒温核酸扩增快速检测 方法，该方法特异性强、灵敏度高、检准率高、检测速度快、鉴定简便。为达到本发明的目的，采用如下技术方案一种原位QCM环介导恒温核酸扩增快速检测方法，通过使用特异性引物，利用环 介导恒温核酸扩增LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，其特征在于，将引物固定于石英 晶体微天平QCM电极上，在安装该电极的QCM检测池中配置反应体系，在63-65°C恒温反应 的同时，利用石英晶体微天平OiCM)技术进行在线检测，包括如下步骤
(1)模板DNA提取采用常规的方法提取DNA。如将试样细胞悬浮于磷酸缓冲液 中，10000-12000rpm离心2_3分钟，去掉上清液，然后.加入样品提取液与沉淀的细胞均勻 混合；在水浴中煮沸IOmin后，置冰水中冷却IOmin ； 10000—12000rpm离心分离2min，上清 液即可作为模板DNA使用。(2)引物固定采用巯基化试剂分子组装方法，将环介导恒温扩增反应体系中的4 个引物G个引物包括2个内引物FIP和BIP、2个外引物F3和B3)之一固定于QCM电极上。(3)反应体系配置在安装上述步骤(2)所述电极的QCM检测池中加入lOpmol/L 的另三条引物、反应缓冲液、BstDNA聚合酶、模板DNA和双蒸水；(4)核酸扩增反应与在线检测在63-65°C恒温反应，用QCM仪器在线检测频率变 化，在10分钟内观察到频率发生周期性波动变化，波动周期在2-5秒，频率曲线呈锯齿状， 说明体系中发生了扩增反应，则判定试样为阳性(试样含有靶基因)，否则为阴性；所述的样品提取液为20mMpH8. 0 WiTris-HCUmMEDTAU. 2% TritonX-IOO 的混合液。所述的引物包括两条外引物、两条内引物，其中一条内引物的5'端用巯基修饰。所述的反应缓冲液组分为IOx聚合酶反应缓冲液IOmMdNTP 150mMMgS04 = 5 · 1 · 2 ο本发明提供的原位QCM环介导恒温基因扩增快速检测方法，具有以下有益效果 检测之前不需要对待检菌进行培养，直接对样本中的病原微生物进行原位基因扩增；扩增 和在线检测10分钟内即可同时完成；高特异性，假阳性检测率极低；灵敏度高，在复杂体系 中可检测到单细胞的靶目标。
具体实施例方式下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方法，但本发明不限于实施例。实施例用本发明的原位QCM环介导恒温基因扩增快速检测方法检测大肠杆菌 0157，所用引物如下BIP 5' -GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATCATCGCACCGTCAA-3‘FIP 3' -TCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTTACCGGGCAATAAGGAAC-5‘B3 5' -TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3‘
F3 3' -GTGAAATTATCGCCACGTTCGG-5‘按以下步骤进行(1)模板DNA提取取120 μ 1 0157菌液于离心管中，10000r/min离心aiiin，去上 清液，加入200μ 1样品提取液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均勻；沸水中煮10分钟后 立即置于冰上冷却10分钟；lOOOOr/min离心2分钟，上清液即可作为模板DNA使用。(2)引物固定将内引物BIP进行巯基修饰，取浓度为lOpmol/L经巯基修饰的BIP 引物 οομ 1，加到石英电极检测面的金膜上于室温反应1小时，然后用双蒸水洗涤两次，完 成引物固定。(3)反应体系配置在安装步骤(2)所述石英电极的IsQCM检测池中加入IOpmol/ μ 1另三条引物各加40μ 1，，反应缓冲液480μ l，BstDNA聚合酶40μ 1，模板DNA170y 1，加 双蒸水180 μ 1。
(4)核酸扩增反应与在线检测63-65°C恒温反应；用QCM仪器在线检测并记录频 率变化，从加入反应液开始计时，10分钟内频率曲线出现两段特异性频率周期性波动变化， 波动周期在3. 1-3. 3秒，频率曲线呈锯齿状，判定该试样为阳性(试样含有大肠杆菌0157 靶基因)；对照2#QCM检测池(与IsQCM检测池平行加样，其中模板DNA2 μ 1用非大肠杆菌 0157DNA取代)频率曲线呈不规律变化，无锯齿状频率曲线出现，判定该试样为阴性(试样 不含有大肠杆菌0157靶基因)。经多次反复试验，未发现假阳性。
权利要求
1.一种原位QCM环介导恒温核酸扩增快速检测方法，通过使用特异性引物，利用环介 导恒温核酸扩增LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，其特征在于，将引物固定于石英晶 体微天平QCM电极上，在安装该电极的QCM检测池中配置反应体系，在63-65°C恒温反应的 同时，利用石英晶体微天平OiCM)技术进行在线检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物固定是，采用巯基化试剂分 子组装方法，将环介导恒温扩增反应体系中的4个引物G个引物包括2个内引物FIP和 BIP、2个外引物F3和B3)之一固定于QCM电极上。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述配置反应体系是，在安装所 述电极的QCM检测池中分别加入另三条引物、反应缓冲液、BstDNA聚合酶、模板DNA及双蒸 水。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述在线检测是，用QCM仪器在线检 测频率变化，在10分钟内观察到频率发生周期性波动变化，频率曲线呈锯齿状，说明体系 中发生了扩增反应，则判定试样含有靶基因即为阳性，否则为阴性。
全文摘要
本发明属分子生物学检测技术领域，公开了一种原位QCM环介导恒温核酸扩增快速检测方法，包括如下步骤将环状介导恒温扩增反应体系中的4个引物(4个引物包括2个内引物FIP和BIP、2个外引物F3和B3)之一经巯基修饰后采用分子组装方法固定于QCM电极上；将配制好的核酸扩增反应物加到QCM检测池中；63-65℃恒温反应；用QCM仪器在线动态监测频率变化，可在10分钟内观察、分析判断出反应产物，判定试样为阳性或阴性。本发明的检测无需荧光标记、特异性高、灵敏度高、快速，可以实现样品原位检测并且鉴定简便。
文档编号C12Q1/04GK102094079SQ20091022744
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者俞宏, 崔学晨, 崔实, 张利群, 李燕国 申请人:崔学晨