专利名称：彻底降解面粉中谷蛋白的微生物方法
彻底降解面粉中谷蛋白的微生物方法
技术领域：
本发明涉及彻底降解面粉中谷蛋白(gluten谷蛋白)的微生物技木。具体地说，本发明方法选用发酵类烘焙产品生产常用的乳酸菌和真菌蛋白酶在液体发酵条件下实现的谷蛋白的彻底降解(残余谷蛋白浓度低于20ppm)。发酵过程产生的谷物粉可作为原料用于生产无谷蛋白食物，供乳糜泻患者食用。生产无谷蛋白食物的现有方法采用天然无谷蛋白或经提取而无谷蛋白的原料，与之相比，本发明提出的生物技术方法具有诸多经济、社会、营养和感官上的优点。流行病谷蛋白不耐或乳糜泻越来越多发。最近一次在欧洲和美国人中进行的普查报道的发病率是1/100受影响个体(Rewers，2005.乳糜泻的流行病学；乳糜泻的流行性、发病率和发展。胃肠病学(Gastroenterology)，128 :47-51)。据目前所知，专门针对这ー饮食不耐的有效疗法是终身严格遵守完全无谷蛋白饮食(Hamer，2005.乳糜泻背景及其生物化学内容。生物技术发展(Biotechnol Advanc), 23 :401-408) 例如，已知可用乳酸菌由无谷蛋白面粉制作烘焙产品(More等,谷物化学(Cereal Chemistry),美国谷物化字家TソJ、会(American Association of Cereal Chemists)。Minneapolis, US, vol. 84,no. 4,1-1-2007, pp. 357-364 和 Moore 等，欧洲食物研究与技术(European Food Research和Technology)，vol. 226，6-6-2007，pp. 1309-1316)。然而，无谷蛋白饮食也有明显的缺点。它很昂贵，与谷物产品相比，无谷蛋白产品的感官性品质较差，且不易保存，这种饮食很难严格遵守，需要营养师的长期监管，还包括因食物中彻底不含谷物造成的营养失衡(例如纤维素、矿物质和维生素)(Grehn等，2001.接受10年无谷蛋白饮食治疗的瑞典成年乳糜湾患者的饮食习惯。Scand J Nutr 45 :178-182 ;Mariani等，1998.无谷蛋白饮食未成年乳糜湾患者的营养风险，儿科胃肠道营养学杂志(J Pediart Gastroenterol Nut) 27 519-523 Thompson等，2005.无谷蛋白饮食研究美国乳糜泻患者是否摄入量推荐量的纤维素、铁、钙和谷类？人类营养与饮食杂志(J. Human. Nutr. Diet.) 18 :163-169)。并且，某些病例(例如“顽固性乳糜泻”)中，即使完全奉行无谷蛋白饮食也无法完全恢复肠道功能(Sollid和Khosla, 2004.乳糜湾的未来治疗方法之选。胃肠道和肝脏科(Gastroenterol.Hepatol.) 2 140-147)。在无谷蛋白饮食的替代疗法中，许多研究利用了目前关于毒性表位序列的已知信息，并且考虑到了采用微生物酶例如脯氨酰内肽酶(PEPs)水解这些多肽。微生物酶已被提议作为饮食补充(Shan等，2004.三种细菌脯氨酰内肽酶的比较生物化学分析乳糜泻处方。生物化学杂志(Biochem. J.)383 :311-318)，和/或者用于谷蛋白的体外(in vitro)脱毒(Chen 等，2003.瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)PeP02 的鉴定与表征，ー种具有后脯氨酸特异性的内肽酶。应用环境学会微生物学(Appl. Environ.Microbiol.) 69 :1276-1282 ;St印niak等，2005。采用新脯氨酰内肽酶的高效谷蛋白降解乳糜湾的处方。美国生理学胃肠道学和肝脏生理学杂志(Am. J. Physiol. Gastrointest.Liver Physiol. )291 :G621_G629)。专利申请W02008/010252 和 Cagno 等.(食物保护杂志(Journal of FoodProtection)，vol. 71，no. 7，2008，pp. 1491-1495)记载的方法用无谷蛋白面粉制作烘焙产
品并试图改善无谷蛋白原料制得产品的营养、感官和保存性品质。
在近几十年中，发酵烘焙产品的生物技术也发生了相当的改变，对整个原谷蛋白类饮食群体的营养习惯产生了影响。现在，发酵烘焙产品的生产技术极其迅速(例如，采用化学发酵剂或采用烘焙酵母(baker' s yeast))，完全取代了采用野生乳酸菌和天然材料来源并用作酵头(“sourdough”)的酵母进行的缓慢发酵过程。采用目前的方法，谷物组分(例如蛋白质)在食物加工过程中不受任何水解作用，保留了天然原料的特征(Gobbetti,1998.酸酵头中的微生物群乳酸菌与酵母之间的相互作用。食品科学与技术趋势(TrendsFood Sci. Technol. )9 :267-274)。基于这些考虑并利用了选定乳酸菌的混合物所具有的酶性潜能，许多研究(Di Cagno等，2002.利用酸酵头乳酸菌的蛋白水解对人谷物不耐相关麦粉蛋白和麦醇溶蛋白肽的作用。应用环境与微生物学(Appl. Environ. Microbiol.)68 :623-633 ；Di Cagno等，2004。乳糜泻患者能够耐受用无毒麦粉并用选定乳杆菌起酵制作的老酵面包。应用环境与微生物学(Appl. Environ. Microbiol.) 70 :1088-1096 ;DiCagno 等，2005。用硬粒小麦面及精制麦麸制作的意大利面是可用于降低谷蛋白不耐的手段之一。农业与食品化学杂志(J. Agr. Food Chem.) 53 :4393-4402 ;De Angelis 等，2005. VSL#3 益生菌制剂能够水解造成乳糜泻的麦醇溶蛋白多肽。生物化学和生物物理学学报(Biochim. Biophys. Acta. ) 1762 :80_93)显示采用传统生物技术，基于选定乳酸菌和长时间发酵，可以将初始谷蛋白浓度显著降低。已为WHO(世界卫生组织)和FAO(食品与农业组织)采纳的国际食品标准(CodexAlimentarius)对“无谷蛋白产品”和“无谷蛋白制造的产品”进行了区分，前者为所含成分的谷蛋白浓度低于20ppm，后者为残余谷蛋白浓度低于200ppm。然而，多项研究(这些研究导致了“醇溶谷蛋白工作组(Prolamins Working Group) ”相关指导意见的颁布)提出任何情况下都需要維持谷蛋白的阈值低于20ppm(Stern等，2001.乳糜泻中谷蛋白的临床影ロ向的研究。欧洲胃肠道肝脏科杂志(Eur. J. Gastroenterol. Hepatol.) 13 :741-747)。最近的ー项研究(Rizzello等，2007.在食物加工过程中用乳杆菌和真菌蛋白酶高效降解谷蛋白乳糜湾的新希望。应用环境与微生物学(Appl. Environ. Microbiol.) 73 :4499-4507)考虑在半液体揉合条件下采用由10种选定乳酸菌构成的复杂混合物、真菌蛋白酶和长时间发酵(48小吋，37°C)。据电泳、色谱和免疫学分析，麦粉中的谷蛋白被降解到了低于20ppm阈值的浓度。此外，专利申请W02006/097415记载了一种降解谷蛋白的方法，与上述研究相似，该方法采用由至少6种乳酸菌和/或双歧杆菌构成的复杂混合物和长时间发酵(24-31小吋)。然而，该方法不适用于将谷蛋白彻底降解，因此不能用于乳糜泻患者。事实上，W02006/097415的图IB显示微生物水解后，仍有未降解麦醇溶蛋白斑点清晰可见，表2也证实了这一点，由此可见，虽然部分麦醇溶蛋白被部分水解，另ー些则对水解不敏感。根据文献和现有数据，有些问题对于由脱毒谷物粉制作无谷蛋白食品而言似乎尤其需要重视(i)简化用于降解过程的选定乳酸菌的组成；(ii)极大缩短发酵时间以适应产业化应用所需；(iii)验证乳酸菌和真菌酶有效作用于不同种类硬粒小麦(durumwheat)粉和面包小麦粉以及大麦粉、黑麦粉和燕麦粉的能力；(iv)提供水解谷蛋白的生物技术方法，从而使得脱毒谷物粉能够用于生产可用的无谷蛋白产品；和(V)通过体内(invivo)和长期医学实验来验证乳糜泻患者在长期食用由脱毒小麦粉制成的无谷蛋白产品后的绝对耐受性。
鉴于以上所述，显然需要合适的原料和方法用于由脱毒谷物粉制作无谷蛋白烘焙产品，一方面消除现有文献和数据中经济、社会、营养和感官评价等方面的缺点，另ー方面消除现有无谷蛋白商品的缺点。本发明的作者发现只用两种乳酸菌，与真菌蛋白酶组合，降解谷蛋白所需的发酵时间显著缩短。并且，本发明证明了乳酸菌和真菌蛋白酶彻底降解不同种类硬粒小麦和面包小麦、大麦、黒麦和燕麦面粉来源谷蛋白的能力；提供了ー种用脱毒小麦粉制作各种发酵烘焙产品的生物技术方法；并且验证了乳糜泻患者对产品的绝对耐受性，由此以ー种全新的方式使得小麦粉能够用作制作无谷蛋白发酵烘焙产品的原料。本发明的乳酸菌属于乳杆菌属(Lactobacillus),分离自制作南意大利面包所用的“酵头”。旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis) DPPMA12 (保藏号DSMZN. DSM22063,保藏日2008 年 11 月 28 日)和胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPPMA125(保藏号DSMZ N. DSM22064，保藏日:2008 年 11 月 28 日)。 本发明对ー种生产无谷蛋白发酵烘焙产品(残余谷蛋白含量低于20ppm)的生物 技术方法进行了标准化和优化，该方案涉及用选定的乳酸菌和真菌蛋白酶对20-50% (重量)的谷物粉水悬浮液进行极快速的发酵(12-20小吋，30-37°C)，然后，按照根据所需特性确定的百分比，将它们作为用烘焙酵母进行的短期(约1-3小时)发酵的成分之一。以下概述的是ー种由脱毒无谷蛋白小麦粉生产发酵烘焙产品的生物技术方法。
权利要求
1.包含旧金山乳杆菌(Lactobacillussanfranciscensis)DSM22063和胚芽乳杆菌(Lactobacillus pi ant arum) DSM 22064 或由它们构成的混合物。
2.如权利要求I所述的混合物，还含有真菌蛋白酶。
3.如权利要求2所述的混合物,所述真菌蛋白酶选自米曲霉(Aspergillusoryzae)蛋白酶和黑曲霉(Aspergillus niger)蛋白酶或它们的混合物。
4.前述权利要求中任一项所述的混合物在彻底降解面粉中的谷蛋白和/或所述面粉的发酵中的应用。
5.如权利要求4所述的应,所述面粉选自软小麦粉或硬小麦粉、大麦粉、黑麦粉或燕麦粉。
6.制作液体面团的方法，其中，谷蛋白被彻底降解，所述面团适用于生产无谷蛋白发酵 产品，所述方法包括或由以下步骤构成 a)培养扩增旧金山乳杆菌DSM22063和胚芽乳杆菌DSM22064 ； b)将浓度为20-50%、以30%为佳的面粉与50-80%、以70%为佳的水混合，水中含有步骤a)中两种菌株的混合物,细胞密度约108cfu/g; c)加入ー种或多种浓度各为200-500ppm、以400ppm为佳的真菌蛋白酶； d)30-37°C发酵8-20小时，以12小时为佳。
7.如权利要求6所述的方法，还包括步骤e):对步骤d)所得的液体面团进行干燥。
8.如权利要求6或7所述的方法，所述面粉选自面包小麦粉、硬粒小麦粉、大麦粉、黒麦粉、燕麦粉，或它们的混合物，优选软小麦粉和硬粒小麦粉。
9.如权利要求6至8中任一项所述的方法,所述真菌蛋白酶选自米曲霉(Aspergillusoryzae)蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)蛋白酶或它们的混合物。
10.液体面团或干面团，其中，谷蛋白被权利要求6-9中任一项所述的方法彻底降解。
11.ー种混合物，包含或由以下成分构成权利要求10所述的面团和ー种或多种天然无谷蛋白面粉。
12.如权利要求11所述的混合物，所述天然无谷蛋白面粉选自天然玉米粉、白玉米粉、稻米粉、藜谷粉、苔麩粉或籽粒苋粉和乔麦粉，或它们的组合物。
13.如权利要求11或12所述的混合物，含有以下百分比的所述面粉天然玉米粉5-15%、以10%为佳，白玉米粉5-15%、以10%为佳，稻米粉、藜谷粉、苔麩粉或籽粒苋粉10-30%、以20%为佳，和乔麦粉1_10%、以5%为佳，所述百分比为重量百分比，以面粉组合物的总重为基准。
14.ー种采用权利要求6-9中任一项所述方法，利用谷蛋白脱毒面粉制作发酵烘焙产品的方法，包括或由以下步骤构成 a)在采用权利要求6-9中任一项所述方法制得的谷蛋白脱毒液体面团中加入天然无谷蛋白面粉10-40%、以30%为佳，烘焙酵母1-2%，盐0. 1-1.0%和造型剂0. 5-1 %，然后揉合； b)任其30°C发酵约1-3小吋，以I.5为佳； c)220°C烘烤50分钟。
15.如权利要求14所述的方法，当谷蛋白脱毒面团被干燥后，所述成分与水的百分比之比约为I. 2 : 0. 8。
16.如权利要求14或15所述的方法，所述天然无谷蛋白面粉选自天然玉米粉、白玉米粉、稻米粉、藜谷粉、苔鉄粉、杆粒觅粉、乔麦粉，或它彳13的混合物。
17.如权利要求14至16中任一项所述的方法，所述谷蛋白脱毒面粉选自面包小麦粉和硬粒小麦粉、大麦粉、黑麦粉、燕麦粉、或它们的混合物，优选软小麦粉和硬粒小麦粉。
18.用权利要求14-17中任一项所述方法制得的烘焙产品。
19.ー种制作发酵烘焙产品的方法，包括或由以下步骤构成 a)直接向权利要求6-9中任ー项限定的谷蛋白脱毒面团中加入天然玉米粉、稻米粉、鸡蛋、糖、黄油和烘焙酵母，并揉合； b)任其30°C发酵I.5小时； c)将发酵面团于250°C烘烤50分钟。
20.如权利要求19所述的方法，步骤a)中，成分的百分比如下天然玉米10%，稻米粉10%，鸡蛋5%，糖3%，黄油I %和烘焙酵母I. 5%。
21.用权利要求19或20所述方法制得的发酵烘焙产品。
22.权利要求10所述面团，权利要求11-13中任一项所述混合物，权利要求18所述的烘焙发酵产品，权利要求21所述的烘焙发酵甜品产品在制作适用于弥补无谷蛋白饮食造成的营养失衡的食品中的应用。
23.ー种乳酸菌，它是旧金山乳杆菌DSM22063。
24.—种乳酸菌，它是胚芽乳杆菌DSM 22064。
全文摘要
本发明涉及用选定乳酸菌和真菌酶彻底降解面包小麦粉和硬粒小麦粉、大麦粉、黑麦粉和燕麦粉中的谷蛋白。尤其是，本发明涉及用选定乳酸菌和真菌酶彻底降解谷物粉中的谷蛋白(残余谷蛋白浓度低于20ppm)，脱毒后的谷物粉可用于按照标准生物方法生产各种无谷蛋白食品。
文档编号C12R1/225GK102655756SQ200980152930
公开日2012年9月5日 申请日期2009年12月17日 优先权日2008年12月23日
发明者A·卡森, A·本纳杜斯, C·G·瑞泽罗, G·吉利亚尼, 安格利斯 M·德, M·戈贝蒂, 家格诺 R·迪 申请人:吉利亚尼股份公司