专利名称：：转基因水稻科丰6号的旁侧序列及定性pcr检测方法
技术领域：
：本发明涉及转基因水稻科丰6号的旁侧序列，以及转基因水稻科丰6号的定性PCR检测方法。
背景技术：
：水稻(Oryzasativa)是一种主要的粮食作物，也是较早成功应用转基因技术进行遗传改良的作物。目前已经培育出了包含不同性状的转基因水稻品种。我国目前尚未批准转基因水稻的商品化生产，但有一些品种(品系)已获准环境释放和生产性实验。对转基因作物的有效监管是安全利用转基因作物的前提和保障。而转基因植物外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，依据外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。自2000年Zimmermarm等利用反向PCR技术破译了转基因玉米Btll的侧翼序列、建立了Btll的品系特异性检测技术体系以来，目前已有多个作物转基因转化体都建立了相应的检测方法。在对现有专利和文献的分析基础上，发现已有一个关于转基因水稻科丰6号的外源插入片段的旁侧序列的专利(专利号200710063780.4)，由于在科丰6号中外源基因是多拷贝插入，而该专利涉及的仅是其中1个拷贝的旁侧序列。
发明内容针对科丰6号为多拷贝插入，本发明提供了另外两个拷贝的外源插入序列的旁侧序列，并在此基础上提供该品系外源两个拷贝的转化事件特异性检测方法。本发明采用的技术方案是一种转基因水稻科丰6号的旁侧序列，所述旁侧序列为载体RB侧序列，所述旁侧序列为SEQIDNo.1所示的序列。一种转基因水稻科丰6号的旁侧序列，所述旁侧序列为载体LB侧序列，所述旁侧序列为SEQIDNo.2所示的序列。所述RB侧旁侧序列可通过HiTaiI-PCR扩增得到。HiTaiI-PCR所用特异性嵌套引物依据nos终止子(NCBI数据库中登录号DQ005463)的序列设计。其中位于NOS序列的11-36，序列为TCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTT；N12位于29-54，序列为AGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGC；N1-3位于204-223，序列为AGCGCGCAAACTAGGATAAA所述LB侧旁侧序列可通过HiTaiI-PCR扩增得到。HiTai1-PCR所用特异性嵌套引物依据hyg抗性基因(NCBI数据库中登录号AB303069.1)的序列设计。其中Hptw位于427-404，序列为CGTACACAAATCGCCCGCAGAAGC；Hpt1-2位于398-375，序列为CCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAG；Hpt1-3位于358-338，序列为GGAAACCGACGCCCCAGCACT。本发明还涉及转基因水稻科丰6号转化事件特异性定性PCR检测方法，所述方法是根据SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的序列设计特异性引物，对待测样品DNA进行扩增，若扩增获得目的片段(目的片段大小由引物决定)，则待测样品为转基因水稻科丰6号；若扩增未获得目的片段，则待测样品不是转基因水稻科丰6号。通常待测样品为单一水稻品种，按照上述方法可直接得出结论；若待测样品为混合物，则可按照上述方法判断混合物中是否含有转基因水稻科丰6号。具体的，所述特异性引物如下KF6-1-F5'-CGACAAAAGATCAGGATTTGGG-3，KF6-1-R5'-GTTTGGAGTTTAAGAGCGA-3，上述引物对中一条引物为依据SEQIDNO.1中169189位设计为正向引物，另一条引物依据450468位设计为反向引物。利用该引物进行扩增，其目的片段为303bp。或者，所述特异性引物如下KF6-2-F5，-GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG-3，，KF6-2-R5，-TCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAG-3，上述引物对中一条引物为依据SEQIDNO.2中134157位设计为正向引物，另一条引物依据684707位设计为反向引物。利用该引物进行扩增，其目的片段为450bp。依赖于外源插入片段的旁侧序列的转基因水稻科丰6号的事件特异性定性PCR检测方法，可依据RB侧旁侧序列检测其中1个插入在6号水稻染色体位置，也可依据LB侧旁侧序列检测另外一个插入拷贝。上述两对引物可单独用于转基因水稻科丰6号的定性PCR检测，也可组合同时用于转基因水稻科丰6号的定性PCR检测使结果更加准确。进一步，所述方法同时以特异性引物KF6-1-F和KF6-1-R或KF6-2-F和KF6-2-R分别对待测样品DNA进行PCR扩增，如果扩增获得303bp和450bp的目的片段，则待测样品为转基因水稻科丰6号；若扩增未获得目的片段，则待测样品不是转基因水稻科丰6号。转基因水稻科丰6号所用载体的T-DNA区域结构见图1，由hpt抗性基因表达盒、CrylAc基因表达盒和CpTI基因表达盒组成。本发明采用常规方法提取植物基因组DNA，利用HiTAIL-PCR方法，分离得到RB侧旁侧序列507bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示通过分析发现SEQIDNO.1中1-167与双元载体pUB_HygDNANCBI登录号AB303069.1的3926-4092完全相同。FillerDNA为转基因过程中修复序列与SEQIDN0.1中168189完全相同。水稻基因组DNA，位于水稻6号染色体NCBI(登录号AP004749.1)的9568495962，与SEQIDNO.1的190507完全匹配。分离得到的LB侧旁侧序列607bp，其核苷酸序列如SEQN0.2所示。通过分析发现其1283与水稻第9染色体(登录号AP009051.1)的89848701匹配。284288为FillerDNA。289-607与双元载体pUB-HygDNANCBI登录号AB303069.1的41358完全相同。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了科丰6号其他两个拷贝的旁侧序列以及建立在这两个拷贝旁侧序列基础上的转化事件特异性检测方法，为转基因那水稻科丰6号的分子特征提供了重要的资料。图1为转基因水稻科丰6号所用载体的T-DNA区域结构图；图2为引物KF6-1-F和KF6-1-R扩增电泳图；其中，Y6，Y7，Y8，Y9，YlO依次表示转基因水稻品系科丰6号、II优科丰6号、华恢1号、Bt63、克螟稻；YS6、YS7、YS8、YS9、YS10分别表示非转基因对照品种明恢86、II优明86、籼优63、明恢63、籼优10号；BLK提取物空白对照；water:PCR扩增试剂对照；M=IOObpDNAladder；图3为引物KF6-2-F和KF6-2-R扩增电泳图；其中，110分别表示转基因大豆GTS40-3-2、转基因玉米M0N863、BTlUBT176、M0N810、转基因油菜GT73、转基因棉花M0N531、转基因水稻华恢1号、Bt63、克螟稻；1120分别为非转基因水稻对照品种明恢86(11、12)、II优明86(13、14)、籼优63(15、16)、明恢63(17、18)、籼优10号(19,20)各自重复2次；21提取物空白对照；22:PCR扩增试剂对照；23转基因水稻科丰6号；M:100bpDNAladder。图4引物KF6-1-F和KF6-1-R对科丰6号不同含量的混合样品的扩增电泳图；其中，Y6科丰6号；YS6明恢86；BLK提取物空白对照；water:PCR空白水对照；10%0.05%示含不同含量的科丰6号混合样品；M:100bpDNAladder。图5引物KF6-2-F和KF6-2-R对科丰6号不同含量的混合样品的扩增电泳图；其中，100%0.01%示含不同含量的科丰6号混合样品；Ck-为非转基因对照明恢86；BLK提取物空白对照；Y7为科丰6号衍生品种II优科丰6号，YS7为II优明86。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1转基因水稻品系科丰6号外源插入载体的旁侧序列克隆一.实验材料1、植物材料转基因水稻科丰6号及其受体对照品种明恢86，由福建农科院提供；2、试剂TaqDNA聚合酶、10XPCRBuffer(IOOmMTris-HClpH8.3,500mMKCl,15mMMgCl2)、dNTP购自宝生物工程大连有限公司；IOObpladderDNAMarker购自北京全式金生物技术有限公司。PCR产物纯化试剂盒(Cat.NO.SKl141)和PCR产物克隆试剂盒(Cat.NO.SK2213)购自上海生工生物工程有限公司。引物合成和克隆测序由Invitrogen公司完成。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。3、实验仪器PCR扩增仪PTC_200(Bio-Rad生产)生物型分光光度计6131(Eppendorf生产)核酸电泳仪=DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)凝胶成像仪GelDocXR(Bio-Rad生产)其他仪器包括离心机、电子天平、培养箱、超净工作台、金属恒温浴等。二.实验方法和过程1、水稻基因组DNA的提取与检测1.1.1、抽提液配制(IOOmL)在60mL水中加入6.93g葡萄糖，2g聚乙烯吡咯烷酮，IOOmgDIECA，充分溶解，然后加入lmol/LTris-HCl(ρΗ7·5)10mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)lmL，加水定容至lOOmL，高压灭菌。使用前加入0.2%(V/V)(200μL)的β-巯基乙醇。1.1.2、裂解液配制(100ml)在60mL水中加入8.17g氯化钠，2g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2g聚乙烯吡咯烷酮(K30)(PVP)，IOOmgDIECA，充分溶解，然后加入lmol/LTris-HCl(pH7.5)10mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.4mL，加水定容至lOOmL，高压灭菌后4°C。使用时加入0.2%(V/V)的β-巯基乙醇。1.1.3、提取方法取水稻叶片或稻粉约200mg在液氮中磨成粉末。加入ImL预冷至4°C的水稻DNA抽提液，颠倒混勻后，在冰上静置5min，4°C条件下IOOOOg离心15min，弃上清液。加入600μL预热到65°C的裂解液，充分重悬沉淀。在65°C恒温保持60min。加入2μLRNaseA37°C保温30min后，用等体积的苯酚氯仿异戊醇混合溶液(25241)和氯仿异戊醇(241)溶液分别抽提两次。室温条件下，IOOOOg离心lOmin。上清加入2/3体积异丙醇，1/10体积3mol/L乙酸钠溶液(pH5.6)。在4°C条件下，IOOOOg离心15min,用70%乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀。加入50μLTE(ρΗ8.0)溶解沉淀。1.1.4、DNA的检测取2.0μLDNA用0.8%的琼脂糖胶电泳检测其完整性，并用生物型分光光度计测定DNA浓度，并将其用TE稀释到浓度为IOOng/μL。2、旁侧序列的获得2.1旁侧序列的扩增利用HiTail-PCR参照Liu等方法进行，第一、二轮反应体积25uL，第三轮反应体积50uL。反应体系为IXPCRbuffer,2.0mmol/LMgCl2,200umol/LdNTP，第一轮扩增25μL反应体系中简并引物用LAD1-1、LAD1-2、LAD1-3、LAD1_4或LAD1-5等1.0μmol/L,嵌套特异引物Nh或Hptw0.3μmol/L,0.5UTaq酶，模板DNA1.0μL；第2轮扩增25μL反应体系中引物AC10.3ymol/L，Np2或HpV20.3μmol/L,0.625UTaq酶，第一轮扩增产物稀释50倍后取LOyL作为模板；第3轮扩增50μL反应体系中引物AC1O.3μmol/L,N1^3或Ηρ、_30.3μmol/L,1.OUTaq酶，第2轮扩增产物稀释10倍后取1.0μL作为模板。扩增产物用2.0%的琼脂糖凝胶电泳并观察成像。所用引物序列见表1，扩增程序见表2。表1:HiTAIL_PCR所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2=HiTAIL-PCR扩增程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.2旁侧序列的克隆和测序利用上海生工生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒(Cat.NO.SK1141)和PCR产物克隆试剂盒(Cat.NO.SK2213)进行PCR产物纯化和克隆。至pUCm-Τ载体后由上海生工生物工程有限测序。序列比较分析运用NCBI网站的blast软件进行。3、结果3.1依据nos终止子序列设计3个嵌套的特异引物，只有用简并引物LAD1-4时在第2和3轮中均仅在转基因水稻科丰6号中扩增出一条带，对其第3轮扩增产物进行回收、克隆和测序。测序结果见SEQIDN0.1。序列分析发现T-DNA插入位置为水稻基因组中第6号染色体，T-DNA断裂位置在RB序列(tgacaggatatattggcgggtaaa)内侧第4个碱基处，在T-DNA序列与水稻基因组序列之间多出22bp的序列。3.2依据hpt基因设计3个嵌套特异引物，只有用简并引物LAD1-4时在第2和3轮中均扩增出一条带，对其第3轮扩增产物进行回收、克隆和测序。测序结果SEQIDN0.2。序列分析发现T-DNA插入位置为水稻基因组中第9号染色体，T-DNA断裂位置在LB序列(tggcaggatatattgtggtgtaaaca)内侧第14个碱基处，在T-DNA序列与水稻基因组序列之间多出5bp的序列。实施例2基于转基因水稻品系科丰6号两个外源插入旁侧序列的品系特异性定性PCR检测一、实验材料转基因水稻品系科丰6号，及其衍生品种II优科丰6号，由福建农科院提供；其他转基因水稻华恢1号和Bt63由华中农业大学提供、克螟稻由浙江大学提供；非转基因水稻对照明恢86和II优明86由福建农科院提供，籼优63由华中农业大学提供，籼优10号由浙江大学提供。实验所用酶和试剂等同实施例1。二、实验过程和方法1、DNA的提取和检测同实施例1。2、基于两个不同插入位点的特异性检测根据实施例1中测定的两个序列，分别在水稻基因组部分和载体部分设计两对PCR引物，引物序列见表4。表4科丰6号两个不同插入位点的特异性检测用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PCR反应体系为IXPCRbuffer、200umol/LdNTP、0.2umol/L特异引物、0.025U/uLTaq酶。反应程序为95°C，5min；94°C30s、59°C45s、72°C45s35个循环；72°C延伸3min。利用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行产物分析。3、结果引物KF6-1-F和KF6-1-R仅在科丰6号及其衍生品种II优科丰6号中得到303bp扩增产物，而在其他转基因水稻品系和对照品种中均未得到扩增，见图2。引物KF6-2-F和KF6-2-R在转基因水稻科丰6号中得到450bp的扩增带，而在其对照非转基因水稻品种和其他转基因植物(包括大豆、玉米)中均未得到扩增(图3)。实施例3品系特异性检测的灵敏性检测一、实验材料转基因水稻品系科丰6号和对照受体品种明恢86。实验所用酶和试剂等同实施例1。二、实验过程和方法1、DNA的提取和检测，将科丰6号及其非转基因对照受体明恢86的种子磨成粉后，制备系列混合样品，各样品所含科丰6号依次为10%、5.0%,2.5%U.25%,0.5%,0.1%,0.05%和0.01%(ff/ff)，混勻后提取DNA方法同实施例1。2、基于两个不同插入位点的灵敏性检测所用引物见表4，PCR反应体系为IXPCRbuffer、200umol/LdNTP、0.2umol/L特异引物、0.025U/uLTaq酶。反应程序为95°C，5min；940C30s,590C45s,72°C45s35个循环；72°C延伸3min。利用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行产物分析。3、结果引物KF6-1-F、KF6-1-R和KF6_2_F、KF6-2-R能够在转基因水稻科丰6号含量为0.10.05%的混合样品中扩增到预期大小的目标产物(见图4、5)。权利要求一种转基因水稻科丰6号的旁侧序列，所述旁侧序列为载体RB侧序列，其特征在于所述旁侧序列为SEQIDNo.1所示的序列。2.—种转基因水稻科丰6号的旁侧序列，所述旁侧序列为载体LB侧序列，其特征在于所述旁侧序列为SEQIDNo.2所示的序列。3.转基因水稻科丰6号的旁侧序列的定性PCR检测方法，所述方法是根据SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的序列设计特异性引物，对待测样品DNA进行扩增，若扩增获得目的片段，则待测样品为转基因水稻科丰6号；若扩增未获得目的片段，则待测样品不是转基因水稻科丰6号。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述特异性引物如下KF6-1-F:5’-CGACAAAAGATCAGGATTTGGG-3’KF6-1-R:5’-GTTTGGAGTTTAAGAGCGA-3’目的片段为303bp。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述特异性引物如下KF6-2-F:5’-GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG-3’，KF6-2-R:5’-TCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAG-3‘目的片段为450bp。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以特异性引物KF6-1-F和KF6-1-R、或KF6-2-F和KF6-2-R对待测样品DNA进行PCR扩增，如果扩增获得303bp和450bp的目的片段，则待测样品为转基因水稻科丰6号；若扩增未获得目的片段，则待测样品不是转基因水稻科丰6号。全文摘要本发明提供了转基因水稻科丰6号的旁侧序列，所述旁侧序列包括载体RB侧旁侧序列和载体LB侧序列，所述RB侧旁侧序列为SEQIDNo.1所示的序列，所述LB侧旁侧序列为SEQIDNo.2所示的序列。本发明提供了科丰6号其他两个拷贝的旁侧序列以及建立在这两个拷贝旁侧序列基础上的转化事件特异性检测方法，为转基因水稻科丰6号的分子特征提供了重要的资料。文档编号C12N15/11GK101824411SQ201010158858公开日2010年9月8日申请日期2010年4月29日优先权日2010年4月29日发明者王渭霞申请人:中国水稻研究所