专利名称：黑木耳菌株分子标记鉴定方法及黑木耳菌株hw5的特异性分子标记引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种黑木耳菌株鉴定方法及黑木耳菌株HW5的特异性分子标记引物。
背景技术：
菌种标记鉴定是食用菌杂交育种工作中的一个非常重要的环节，传统的形态标记 一般是从形态、性状和生理特性上加以鉴别，而真菌可供作为分类鉴定的形态特征比较少， 而且容易受到外部环境或者人为因素的影响，导致形态标记在真菌种质资源鉴定中准确性 较低。生化标记主要是同工酶标记，但每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术，同工 酶是基因表达的产物而非基因本身，常受到环境及食用菌发育状态的影响，并且检测到的 多态性位点的数量有限，且只能分析那些编码可溶性酶的基因。相对于传统生物学方法分子标记鉴定技术具有特异性强、可重复性强、准确率高 等特点。近年来运用RAPD、ISSR、SCAR、SRAP、TRAP等分子标记技术在食用菌菌株差异性鉴 定上得到广泛应用，表现在对食用菌栽培菌株的分子标记差异性分析和菌种鉴定上。分子 标记技术在黑木耳双核菌株的特异性标记筛选、菌种鉴别和在单核菌株相似性分析上已有 相关研究报道武昌胜等(2004)用交配反应将黑木耳F1代孢子进行交配型分类，构建交配 型基因的等基因池，通过64个随机引物的RAPD分析扩增出差异带，确立了 1个与交配型基 因连锁的分子标记，该方法通过杂交F1代菌株利用随机引物进行特异标记筛选，存在工作 量大、耗时长、程序繁琐，而且未进行后代同源性、遗传稳定性追踪分析。宋小亚等(2007)研 究了 ISSR标记在单核体遗传分析，利用73条引物对黑木耳两个亲本单核体、33个单孢子 进行了遗传相似性分析，却未涉及分子标记在单核及杂交后代遗传稳定性研究。张介驰等 (2006、2007)用RAPD和ISSR技术对东北黑木耳指纹图谱进行分析，仅就菌株区分鉴定和菌 株的相似性进行了研究，未涉及分子标记杂交菌株遗传鉴定及稳定性研究。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前分子标记黑木耳菌株鉴定方法特异引物筛选量大、 特异标记难以获得，且无法鉴定杂交后代和确定其遗传稳定性的问题，而提供的一种黑木 耳菌株分子标记鉴定方法及黑木耳菌株HW5的特异性分子标记引物。本发明黑木耳菌株分子标记鉴定方法按以下步骤实现一、提取选定黑木耳菌株 菌丝体总DNA ；二、ISSR-PCR分析以选定黑木耳菌株菌丝体总DNA为模板，进行ISSR引物 筛选，得到特异分子标记；三、纯化特异分子标记，并设计特异分子标记引物；四、利用特异 分子标记引物对待测黑木耳菌株进行PCR检测，得到阳性条带的黑木耳菌株为选定黑木耳 菌株，未得到阳性条带的黑木耳菌株为其它黑木耳菌株；其中步骤二获得的特异分子标记 存在于选定黑木耳菌株菌丝体的一个细胞核中，而不存在于选定黑木耳菌株菌丝体的另一 个细胞核中。黑木耳菌株冊5的特异性分子标记引物为R1-1和R1-2 ；引物R1-1的核苷酸序列为5 ‘ -GGGTCTGTAATAGTCACTGGATG-3 ‘；引物R1-2的核苷酸序列为 5 ‘ -TCAAGGACTCGCAGTAAACGA-3‘。本发明黑木耳菌株分子标记鉴定方法具有特异引物筛选量小、特异标记易获得的 优点，而且本发明黑木耳菌株分子标记鉴定方法中获得的特异分子标记基因在单核杂交后 代中完整、规律性分布。由于本发明方法中获得的特异分子标记由亲本和单核原生体中筛 选得到，因此确保了所获得的特异分子标记片段的特异性、完整性，并保证了特异分子标记 片段独立存在一个单核中不会因为核的分离而分开。因为本发明方法中所设计的特异分子 标记引物特异性强，可充分验证特异分子标记片段，所以对所选定黑木耳菌株、单核体及杂 交后代具有特异扩增，而对其他菌株无扩增产物。本发明黑木耳菌株分子标记鉴定方法中获得的特异分子标记基因可用于验证特 异分子标记基因片段在减速分裂时的连锁、互换、定位分析通过特异分子标记引物在孢子 和杂交后代的PCR扩增结果和特异分子标记基因片段的阳性表现，可分析出特异分子标记 基因在染色体的位置，以及在进行减速分裂时是连锁的存在于一条染色体上。本发明黑木耳菌株HW5的特异性分子标记引物即根据上述黑木耳菌株分子标记 鉴定方法获得，对于黑木耳菌株HW5具有快速、准确鉴定的作用。
图1是具体实施方式
三中特异分子标记引物对单孢菌株、杂交菌株扩增结果的凝 胶电泳图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式黑木耳菌株分子标记鉴定方法按以下步骤实现 一、提取选定黑木耳菌株菌丝体总DNA ；二、ISSR-PCR分析以选定黑木耳菌株菌丝体总DNA 为模板，进行ISSR引物筛选，得到特异分子标记；三、纯化特异分子标记，并设计特异分子 标记引物；四、利用特异分子标记引物对待测黑木耳菌株进行PCR检测，得到阳性条带的黑 木耳菌株为选定黑木耳菌株，未得到阳性条带的黑木耳菌株为其它黑木耳菌株；其中步骤 二获得的特异分子标记存在于选定黑木耳菌株菌丝体的一个细胞核中，而不存在于选定黑 木耳菌株菌丝体的另一个细胞核中。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中采用植物 基因组DNA提取方法提取选定黑木耳菌株菌丝体总DNA。其它步骤及参数与实施方式一相 同。
具体实施方式
三本实施方式黑木耳菌株分子标记鉴定方法按以下步骤实现 一、提取黑木耳菌株冊5菌丝体总DNA ；二、ISSR-PCR分析以黑木耳菌株冊5菌丝体总DNA 为模板，进行ISSR引物筛选，得到特异分子标记；三、纯化特异分子标记，并设计特异分子 标记引物；四、利用特异分子标记引物对待测黑木耳菌株进行PCR检测，得到阳性条带的黑 木耳菌株为选定黑木耳菌株，未得到阳性条带的黑木耳菌株为其它黑木耳菌株；其中步骤 二获得的特异分子标记存在于选定黑木耳菌株菌丝体的一个细胞核中，而不存在于选定黑木耳菌株菌丝体的另一个细胞核中。本实施方式步骤二 ISSR反应体系为25 ii L 由2. 5 y L10XPCR缓冲液 (Mg2+)、2 ii L 浓度为2. 5mmol/L 的 dNTPs、1 P L 浓度为 10 u mol/L 的 ISSR 通用引物 R1 (5 ‘ -GAGAGAGAGAGAGAGAT-3 ‘ ),0. 3u L 浓度为 5U/ ii L 的 EasyTagDNAPolymerase (北京全 式金生物技术服务有限公司购买)、0. 8 y L浓度为15ng/i! L的基因组总DNA和余量的无菌 双蒸水组成。并以无菌双蒸水代替模板为阴性对照。ISSR反应离心10s，将PCR薄壁管 放入PCR仪中扩增(扩增条件为94°C预变性5min ；94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸 60s，循环35次；72°C延伸7min)，4°C保存。PCR产物电泳PCR产物在含GelRed染色剂的 1. 2%琼脂糖凝胶上用1XTAE缓冲液电泳分析，电压为4 5V/cm，电泳结束后用凝胶成像 系统分析。本实施方式步骤二得到的黑木耳菌株冊5特异分子标记片段大小为637bp (如 SEQIDN0 3 所示)。本实施方式步骤三设计特异分子标记引物为R1-1和R1-2 ；引物R1-1的 核苷酸序列为5 ‘ -GGGTCTGTAATAGTCACTGGATG-3 ‘；引物R1-2的核苷酸序列为 5 ‘ -TCAAGGACTCGCAGTAAACGA-3‘。黑木耳菌株冊5记载于“黑木耳原生质体制备、再生及单核体荧光鉴定”(食用菌 学报，2008年第3期)，可由黑龙江省科学院微生物研究所购买。孢子单核体和杂交菌株菌丝体总DNA提取使用植物基因组DNA提取试剂 盒。特异引物对孢子单核体和杂交菌株验证分析以供试菌株的DNA作为模板，进 行PCR扩增。PCR反应体系(25 ii L)由2. 5 ii L10XPCR缓冲液(Mg2+)、2 y L浓度 为2. 5mmol/L的dNTPs、0. 5 y L浓度为10 y mol/L的上游特异分子标记引物R1-1 (5 ‘ -GGGTCTGTAATAGTCACTGGATG-3 ‘ )、0. 5yL 浓度为 10 ii mol/L 的下游特异分 子标记引物 R1-2 (5 ‘ -TCAAGGACTCGCAGTAAACGA-3 ‘ )、0. 3 ii L 浓度为 5U/ii L 的 EasyTagDNAPolymerase,0. 8uL浓度为15ng/ u L的基因组总DNA和余量的无菌双蒸水组 成。并以无菌双蒸水代替模板为阴性对照。PCR反应体系离心10s后将PCR薄壁管放入PCR 仪中扩增(扩增条件为94°C预变性5min ；94°C变性30s，58°C退火45s，72°C延伸60s，循环 35次；72°C延伸7min)，4°C保存。PCR产物电泳PCR产物在含GelRed染色剂的1. 2%琼脂 糖凝胶上用1XTAE缓冲液电泳分析，电压为4 5V/cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析。 将筛选的特异分子标记在孢子单核体和杂交后代中进行特异分子标记筛选验证，确立该标 记在单核和后代中的遗传稳定性。本实施方式特异分子标记引物对单孢菌株、杂交菌株扩增的结果如图1所示。图 1中“M”泳道标样为Marker，“ 1，，泳道标样为黑木耳菌株HW5单孢菌株(没有特异分子标记 的单孢菌株)，“2”和“3”泳道标样为黑木耳菌株HW5单孢菌株(有特异分子标记的单孢菌 株)，“4”泳道标样为黑木耳8808菌株的1个原生质体单核菌株，“5”泳道标样为黑木耳菌 株黑29的1个原生质体单核菌株，“6”泳道标样为“1”和“4”泳道标样菌株的杂交菌株， “7”泳道标样为“ 1 ”和“3”泳道标样菌株的杂交菌株，“8”泳道标样为“2”和“5”泳道标样 菌株的杂交菌株。黑木耳8808菌株和黑木耳菌株黑29可由黑龙江省科学院微生物研究所购买获 得。试验证明本实施方式方法可有效鉴定黑木耳菌株HW5及阳性单核体种内、种间杂交后代。本实施方式方法同样适用于黑木耳菌株冊5杂交后代的鉴定，具有可验证黑木耳遗传 稳定性，追溯亲源亲缘性分析的功能。本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊 要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使用操作手册。同理本实施方式方法同样适用于黑木耳其它菌株的分子标记鉴定。
具体实施方式
四本实施方式黑木耳菌株冊5的特异性分子标记引物为R1-1和 R1-2 ；引物R1-1的核苷酸序列为5' -GGGTCTGTAATAGTCACTGGATG-3 ‘；引物R1-2的核苷酸 序列为 5' -TCAAGGACTCGCAGTAAACGA-3‘。序列表
<110>黑龙江省科学院微生物研究所
<120>黑木耳菌株分子标记鉴定方法及黑木耳菌株HW5的特异性分子标记引物
<160>3
<210>1 <211>23 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>黑木耳菌株HW5的特异性分子标记引物R1-1 <400>1
GGGTCTGTAATAGTCACTGGATG23
<210>2 <211>21 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>黑木耳菌株HW5的特异性分子标记引物R1-2 <400>2
TCAAGGACTCGCAGTAAACGA21
<210>3 <211>637<212>DNA
<213> 黑木耳(Auriculariaauricula (L. exHook.) Underw.) <220>
<223>黑木耳菌株HW5特异分子标记
<400>3GAGAGAGAGAGAGAGATTGCGCAGGCCATGACGGTGGGTCTGTAATAGTCACTGGATGCC60CGGCGCGCGAGTGCACGTGGTCGAGTTTGGCCGGAGCAGTCCAACAGAGAACAGAGCAGA120AATGTGAACGCGGTAGCAAGAGCCTGGCTCCTTGGAAGACGCCGCCCAGAGACGAAGTGT180ACAGGGGCCCGGGGCTCTACGTTCGGGAAACTGAGCGCGCGCGTCTGCAGGGTAGTTTCC240TTAGTGTCGTGGGAAGGAAGAGAGAGGCGGACGCGGTTCGAAGTCCGATCCCTTACAGCG300AAAGTTGCCCCAAAGAGGTCTTGAGTATGAATACGGTCGGAAAGACGGTGGATTCTATAT360TTCTTTCTGAATCTGTGGTCCCGGGTGTAAATGGCCGAAGTGTTCACAATCTGCTGTTTT420GAGCGGACGGGTAGGCGTAGCTAAGAGTACTCGCCTGAGAAACTGGGTAATGTACTCGAA480TATACAGTACACATGTGCTTCACAATGAAACAGACATCTAAGAACCATGAGCCTGGTACT540AGATGATTCTATTCCCTCAAGGTTCCGCGAGAGTACTAGTGTGGACCGATTTCCCCAGAC600TCGTTTACTGCGAGTCCTTGATCTCTCTCTCTCTCTC637
<210>4 <211>17 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>ISSR通用引物R1 <400>4
GAGAGAGAGAGAGAGAT1权利要求
黑木耳菌株分子标记鉴定方法，其特征在于黑木耳菌株分子标记鉴定方法按以下步骤实现一、提取选定黑木耳菌株菌丝体总DNA；二、ISSR-PCR分析以选定黑木耳菌株菌丝体总DNA为模板，进行ISSR引物筛选，得到特异分子标记；三、纯化特异分子标记，并设计特异分子标记引物；四、利用特异分子标记引物对待测黑木耳菌株进行PCR检测，得到阳性条带的黑木耳菌株为选定黑木耳菌株，未得到阳性条带的黑木耳菌株为其它黑木耳菌株；其中步骤二获得的特异分子标记存在于选定黑木耳菌株菌丝体的一个细胞核中，而不存在于选定黑木耳菌株菌丝体的另一个细胞核中。
2.根据权利要求1所述的黑木耳菌株分子标记鉴定方法，其特征在于步骤一中采用植 物基因组DNA提取方法提取选定黑木耳菌株菌丝体总DNA。
3.黑木耳菌株HW5的特异性分子标记引物，其特征在于黑木耳菌株HW5的特异性分子 标记引物为R1-1和R1-2 ；引物R1-1的核苷酸序列为5' -GGGTCTGTAATAGTCACTGGATG-3‘； 弓丨物 R1-2 的核苷酸序列为 5 ‘ -TCAAGGACTCGCAGTAAACGA-3 ‘。
全文摘要
黑木耳菌株分子标记鉴定方法及黑木耳菌株HW5的特异性分子标记引物，它涉及一种黑木耳菌株鉴定方法及黑木耳菌株HW5的特异性分子标记引物。它解决了目前分子标记黑木耳菌株鉴定方法特异引物筛选量大、特异标记难以获得，且无法鉴定杂交后代和确定其遗传稳定性的问题。鉴定方法一、提取菌丝体总DNA；二、ISSR-PCR分析；三、纯化并设计特异分子标记引物；四、PCR检测。黑木耳菌株HW5的特异性分子标记引物为R1-1和R1-2。本发明黑木耳菌株分子标记鉴定方法具有特异引物筛选量小、特异标记易获得的优点，而且本发明黑木耳菌株分子标记鉴定方法中获得的特异分子标记基因在单核杂交后代中完整、规律性分布。
文档编号C12Q1/68GK101798601SQ201010158529
公开日2010年8月11日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者张丕奇, 张介驰, 韩增华 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所