草鱼胸腺素β₁₁基因序列的制作方法

专利名称：草鱼胸腺素β₁₁基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学中的基因克隆领域，尤其涉及草鱼胸腺素β η基因的核苷 酸及氨基酸序列。
背景技术：
β -胸腺素(Thymosin β,Τβ)是一类结功能多样的小肽分子，分子量大小为5KD 左右，等电点介于5 7之间，是细胞中主要的肌动蛋白单体结合蛋白，防止肌动蛋白单体 聚合形成肌动蛋白纤维，维持G-肌动蛋白和F-肌动蛋白的动态平衡，对细胞骨架的稳定起 至关重要的作用。胸腺素β还通过调节末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)的活性促进T细胞 的分化成熟。此外，胸腺素β还具有缓解炎症、抑制细胞凋亡的功能，在肿瘤的发生中起重 要作用。目前NCBI上只能查到较少种类鱼类的T β的全长cDNA，而在淡水经济鲤科鱼类中 克隆到β -胸腺素(Thymosin β，Τβ )尚属首次。目前胸腺素在草鱼基因研究上还属空白。本基因的获得可以进一步研究该基 因在草鱼细胞中的组成及基因结构，并为研究草鱼病害的防治提供新的思路。

发明内容
本发明的目的是以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中β -胸腺素EST序列为模 版设计引物，结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼β-胸腺素基因的全表达序列。上述目地是通过以下技术方案来实现的取出新鲜草鱼肠道组织，采用TRIzol (Invitrogen Corporation) 一步法提取总 RNA,甲醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator (Qenequant)检测总RNA质量。本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到β -胸腺素EST序列，经测序比对后发 现该EST序列具有β-胸腺素的完整3’端，欠缺cDNA序列的5’端。利用cDNA末端快速 扩增技术(RapidAmplification of cDNA ends, RACE)对目的基因的5端进行扩增。根据已知EST序列设计外侧和内侧两个特异引物5 端特异引物 1 5，-GGCAATGCAGGGAAGGGAG-3，5 端特异引物 2 5，-CGCCTGCTTCTCCTGTTCAATG-3，通用引物Long :5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’Short :5， -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，接头引物5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3，5 端核心引物5·，-(T) 25V N-3，(N = A, C, G, or T ;V = A, G.，or C)以接头引物和5端核心引物反转录合成的第一链cDNA为模版进行PCR反应，上游 引物使用通用引物，下游引物使用5端特异引物1。PCR结果琼脂糖凝胶电泳胶回收后用通 用引物和5端特异引物2进行PCR验证。将验证后的序列片段连接到pMDIS-T质粒，转入E. Coli JM109菌株，经质粒酶切验证后用M13通用引物测序。扩增得到片段大小为170bp。再根据5端扩增片段和已知EST序列拼接，对全序列进行调整后获得了完整的草 鱼胸腺素基因序列，既目的基因。草鱼β-胸腺素基因的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因 结构，并为研究草鱼病害的防治提供新的思路。
具体实施例方式下面通过以下具体实施方式
对本发明作进一步阐述，但本发明的内容完全不局限 于此。1.总RNA的提取挑选实验材料——健康雌性草鱼，体长570mm，约1. 5冬龄(18个月)， 2.4kg。取出新鲜草鱼肠道组织，液氮迅速冷冻后保存于-80°C冰箱备用。采用 TRIzol (InvitrogenCorporation) 一步法提取总RNA，甲醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator (Qenequant)检测总 RNA 质量。2. cDNA第一链的合成取草鱼肠道细胞总RNA 5ug与反转录引物(5端核心引物和接头引物)各 Iul (12uM)混合，70°C加热2分钟，立即放置冰上，然后加入5x buffer, IOmM dNTP混合液， 20mM DTT, M-MLV反转录酶，反应体系为10UL。反应过程为42°C 1小时30分钟，之后加入 90ul TE buffer (PH8. 0)，72°C加热7分钟。最后得到IOOul草鱼肠道细胞cDNA模板，放 入-20°C保存备用。3.引物设计依据和合成方法在本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到含有β -胸腺素EST序列的转化子， 送交测序，并将测序结果在GenBank中进行比对，比对结果显示该EST序列含有β -胸腺素 cDNA的完整3’端，欠缺cDNA序列的5’端。以该EST序列为模版设计2个5端特异引物， 其中引物1用于初步扩增胸腺素的5端序列，引物2用于对初步扩增序列进行验证。引 物序列设计后送交Invitrogen Corporation进行合成。5 端特异引物 1 5，-GGCAATGCAGGGAAGGGAG-3，5 端特异引物 2 5，-CGCCTGCTTCTCCTGTTCAATG-3，4.草鱼β -胸腺素基因cDNA全序列的克隆以草鱼β -胸腺素EST序列为模版设计的5端特异引物1和通用引物扩增片段约 为 170bp。4. 1用第一链cDNA末端快速扩增技术进行初步PCR扩增以上述合成的第一链cDNA作为模板，根据已知EST序列设计特异性引物1，利用 cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends,RACE)对目的基因的5，末 端进行扩增。在5’ RACE中，利用末端转移酶和接头引物在cDNA的5’末端加上CCC后，以加 尾后的cDNA作为模板，利用5端特异性引物1和通用引物进行PCR扩增，片段反应体系如 下第一链 cDNA模板 1. 5uL, IOxPCR 反应缓冲液 5uL，25mmol/L MgCl2 3uL，2. 5mmol/L dNTP 2uL，lOumol/L 5端特异引物1和通用引物各IuL, Taq酶1. 25U，用PCR水将反应体系补充至50uL。反应条件如下1个循环，94°C变性2min ；5个循环，94°C变性30s，62°C退火30s， 72°C延伸2min ；5个循环，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min ；25个循环，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 2min ；1 个循环，72°C延伸 IOmin ；4°C保温。所扩增的PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，共得到3条清晰条带，大小 分别为300bp、250bp、150bp，将其分别从凝胶中纯化回收。4. 2用第一链cDNA末端快速扩增技术进行PCR验证扩增分别以4. 1中扩增得到的3个片段为模板，根据已知EST序列设计特异性引物2， 利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)对目的基因的 5’末端进行验证扩增。利用5端特异性引物1和通用引物进行PCR扩增，片段反应体系如下模板 1. 5uL(分别以4. 1中扩增得到的3个片段为模板)，IOxPCR反应缓冲液5uL，25mmol/L MgCl2 3uL，2. 5mmol/L dNTP 2uL, lOumol/L 5 端特异引物 2 和通用引物各 IuL, Taq 酶 1. 25U，用 PCR水将反应体系补充至50uL。反应条件如下1个循环，94°C变性2min ；5个循环，94°C 变性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸2min ；5个循环，94 °C变性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸 2min ；25 个循环，94°C 变性 30s，53 °C 退火 30s，72 °C 延伸 2min ；1 个循环，72 °C 延伸 IOmin ； 4°C保温。所扩增的PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，仅在以250bp片段为模板 的反应体系中得到大小为150bp左右的清晰条带，从凝胶中纯化回收该片段。然后将纯化 的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提 取质粒DNA，经EcoR I和Hind III双酶切验证后，将具有插入片段质粒DNA的转化子送交 InvitrogenCorporation，利用M13通用引物进行双向测序。4. 3用第一链cDNA进行开放阅读框的PCR扩增以上述合成的第一链cDNA作为模板，根据5端扩增片段和已知EST序列拼接所得 结果设计上下游引物对上述操作所的草鱼β _胸腺素基因的开放阅读框进行PCR扩增以验 证所得序列的正确性。利用上下游引物进行PCR扩增，片段反应体系如下模板luL，IOxPCR反应缓冲液 5uL,25mmol/L MgCl2 3uL,2. 5mmol/L dNTP 2uL，10umol/L 上游引物和下游引物各 luL，Taq 酶1. 25U，用PCR水将反应体系补充至50uL。反应条件如下1个循环，94°C变性2min ；30 个循环，94°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸2min ； 1个循环，72°C延伸IOmin ；4°C保温。所扩增的PCR产物用的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到大小为250bp左右的清 晰条带，从凝胶中纯化回收该片段。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大 肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA J^EcoR I和Hind III双酶切验 证后，将具有插入片段质粒DNA的转化子送交Invitrogen Corporation，利用M13通用引物 进行双向测序。将开放阅读框序列的测序结果与5端扩增片段和已知EST序列拼接所得序列进行 比对，对全序列进行调整后获得了完整的草鱼β “胸腺素基因序列，既目的基因。5.草鱼β-胸腺素基因序列的确定将PCR反应所得5端扩增片段和开放阅读框片段分别克隆到PMD-18T载体中，转 化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA J^EcoR I和Hind III双酶
5切验证后，将具有插入片段质粒DNA的转化子送交Invitrogen Corporation,利用M13通用 引物进行双向测序。所得结果用vector NT进行拼接，比对分析，获得一完整的cDNA序列。 将该序列用BLAST软件(http://www. ncbi. nim. nih. gov/blast)进行同源性测定，来确定
为草鱼β-胸腺素基因同源序列。比对结果为
Sequences produclag ^jyillleaat alignments!
.....
NM 3G11243=0.1
6TD57954.1
mm74&2Λ &Τ556857.1 &Τ056449Λ ΒΤ05637Β.Ι &Τ04β298,1 &TD79366.1
onconyn-^us m\Y\ss heranyrro^in (ιOCliKM St)0< 7). mKNA >sir Salrno safar clone ssal-rgf-507-039 Thymosin beta-11 pufcabve mRT Sslmo salar done ssat-rgb2-S26-260 Thymosin beta-ll putative m Salmo salar done ssai-evd-5X4-099 Thymosin beta-ll putative mf Salmo salar clone ssai-rgb2-583-l69 Thymosin beta-il putative m Saftmo saisr done 5sal-evf-538-279 Thymosin beta-it putative mR Saimo saiar done ssai-evd-522-265 Thymosin beta-li ρυ Β νβ nf F Satmo selar done ssei-evd-5331-273 Thymosnn beta-Jl putative mP Esoh iucius clone eluc^khpO02-^35 Thymosin beta-u putative m
权利要求
一种草鱼草鱼胸腺素β11基因，其特征在于具有以下RNA核苷酸及相应的氨基酸序列gctaaagacttcaaactacagtccgtctacgaagcagacaaccaatc47atg tct gac aaa cca aac ctg gat gag gtc77Met Ser Asp Lys Pro Asn Leu Asp Glu Val1015 10acc agc ttt gac aaa acc aag ttg aag aag107Thr Ser Phe Asp Lys Thr Lys Leu Lys Lys2011 15 20act gag aca cag gag aaa aac cca ctg cca137Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro3021 25 30tct aaa gaa acc att gaa cag gag aag cag167Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln4031 35 4Qgcg gcc tcg tga agacacaagctgccatcatgcactgtgcacactcc214Ala Ala Ser4341 43ccttcttttcattcacttcttttagcagtataactttgtaaccaaaatgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcgagggacccatcctcg320。
全文摘要
本发明公开了一种草鱼胸腺素β11的基因，以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中胸腺素β11EST序列为模版设计引物，结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼胸腺素β11基因的全表达序列。对于研究草鱼胸腺素β11基因结构组成，探讨其在草鱼抗病机理的作用和功能区域位置，以及与其他物种的区别都提供了重要的理论依据。本发明对探索建立草鱼基因组计划与草鱼抗病机制的研究之间纽带的方法具有开创性作用。
文档编号C12N15/16GK101948843SQ201010217248
公开日2011年1月19日 申请日期2010年7月5日 优先权日2010年7月5日
发明者吴江, 府跃军, 徐恒, 袁恬, 辜文博, 顾继锐 申请人:通威股份有限公司