专利名称：Ev-71型病毒蚀斑纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种EV-71型病毒蚀斑纯化的方法。
背景技术：
目前也有蚀斑纯化技术方法的报道，首先将不同稀释度数的病毒液接种于培养器 皿中，吸附1-4小时后，吸弃吸附后的病毒液并用维持液洗去残余的病毒液，加第一营养覆 盖层待凝固后翻面培养数天后加入第二层覆盖层，凝固后同样翻面避光培养1-2天即可观 察蚀斑的形成。但是这种纯化方法可能会造成病毒由蚀斑扩散至琼脂表明，从而污染同一 培养物内的其它蚀斑，这是由于当病毒繁殖后再加入中性红溶液或者第二层琼脂时，就将 病毒分散于琼脂表面，而且中性红燃料的存在会抑制病毒蚀斑的形成并破坏宿主细胞。这 种纯化方法较为复杂，蚀斑形成所需时间较长，所需的实验周期也较长。而且已报道的蚀斑 纯化技术在纯化病毒方面得到广泛的应用，但用原有方法中的低熔点琼脂糖来纯化EV-71 病毒的结果不是很理想。手足口病(Hand-Foot-mouth disease, HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染 病，近年来多爆发于亚太地区的热带区域，以婴幼儿发病为主。引起手足口病的肠道病毒 包括肠道病毒EV71型(肠道病毒71，Enterovirus 71，简称EV-71)和A组的柯萨奇病毒 (CoxA)、埃克病毒(Echo)等。其中EV-71是引起手足口病的主要病原，常导致严重的神经 系统综合症。EV-71是单股正链RNA病毒，分为A、B、C3个基因型，B1-B4及C1-C4共8个 亚型。该病以前虽有报道但多以散发病例出现，而09年在我国的安徽、河南和河北多个 地区呈爆发流行，对婴幼儿健康造成了严重的危害。因此，纯化该病毒，并研究该病毒，了解 该病毒的特性对该疾病的预防和治疗具有重要的指导意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定易操作的病毒蚀斑纯化的方法。本发明所提供的一种EV-71型病毒蚀斑纯化方法，包括下述步骤1)制备单层vero细胞，加入含病毒的样品液，吸附1_2小时；2)将吸附后的细胞表面覆盖一层培养哺乳动物细胞用固体培养基培养至病毒蚀 斑出现；3)挑取病毒蚀斑获得病毒液。所述方法中，所述培养哺乳动物细胞用固体培养基为哺乳动物细胞培养用培养液 添加结冷胶获得的固体培养基，所述结冷胶为SIGMA公司生产的Gelrite Gellan Gum。所述培养哺乳动物细胞用培养液为含有MEM培养基成分的培养液。所述培养哺乳动物细胞用培养液所述培养哺乳动物细胞用培养液由基础培养 液和如下终浓度的物质组成胎牛血清体积百分比1%，2M HEPES 10mL/L，L-谷氨酰胺 2mmol/L, 100XNEAA 10mL/L,青霉素50U/ml，链霉素50U/ml，质量百分含量为7. 5 %的NaHCO3溶液25mL/L ；所述基础培养基为MEM培养液。所述终浓度是在培养哺乳动物细胞用 培养液中的终浓度。注一般市售的青霉素为80万U/瓶，将其溶解于4ml灭菌去离子水中，每升培养 液中加入0. 5ml，其最终浓度为100U/ml ；市售的链霉素为100万U/瓶，将其溶解于5ml灭 菌去离子水中，每升培养液中加入0.5ml，其最终浓度为100U/ml。下面的相同。所述培养哺乳动物细胞用固体培养基中SIGMA公司生产的Gelrite Gellan Gum 的添加量为1. 25g/L。所述方法步骤1)中，所述的吸附条件37°C 5% C02，95%空气，99%湿度，一个大 气压，所述百分含量均为体积百分含量。所述方法步骤2)中，所述的培养条件37°C 5% C02，95%空气，99%湿度，一个大 气压，所述百分含量均为体积百分含量。所述方法步骤3)中，所述挑取蚀斑的方法是用微量移液器插取无菌的微量吸管， 吸取含有2% (体积百分比)胎牛血清的细胞维持液放入无菌的冻存管中，之后用该微量吸 管插入蚀斑部位，垂直吹打后吸出放入上述冻存管中再吸取冻存管中含有病毒的液体插入 上述蚀斑部位反复吹打，吸出即为病毒液。所述方法步骤3)中，还包括将获得的病毒液冻融3次作为待纯化样品再重复步骤 1)-步骤3) 2次，获得进一步纯化的病毒液。所述EV-71型病毒为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)肠道病毒EV71型河南 分离株2CGMCC Ns. 3675或肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)肠道病毒EV71型重庆分离 株 ICGMCC Na · 3674。所述待纯化的样品液为采集的临床手足口病患者血清、粪便、咽拭子或肛拭子用 含体积百分比为0. 2%的牛血清白蛋白、100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素，pH7. 2、 0. 01M/L的PBS溶液洗涤获得的液体，过滤灭菌后接种于Vero细胞，当细胞病变达到95% 时，收获细胞-70°C冻融3次，获得的病毒液。所述含体积百分比为0.2%的牛血清白蛋白、 100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素，ρΗ7. 2、0· 01M/L的PBS溶液是将ρΗ7· 2、0· 01M/L的 PBS溶液中添加体积百分比为0. 2%的牛血清白蛋白、100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉 素获得的，添加的浓度时在PBS溶液中的总浓度。本发明的方法用病毒样品吸附Vero细胞单层，覆盖MEM细胞固体培养基，3-4天可 以看到明显的蚀斑形成，实验证明，经过3轮蚀斑纯化和扩增后，RT-PCR检测和测序表明已 经得到纯化的病毒株。本发明的方法具有稳定、易操作的优点，为纯化EV-71病毒提供了一 种简单可行的方法。本发明的蚀斑纯化方法在病毒纯化方面具有良好的应用前景，不仅可 以快速准确的纯化EV71病毒，而且经初步实验表明，该方法还可以广泛的应用于多种病毒 的纯化。
图1是EV-71型病毒河南分离株2第3次蚀斑纯化时挑取单斑的照片；图2是EV-71型病毒重庆分离株1第3次蚀斑纯化时挑取单斑的照片；图3为Vero细胞阴性对照照片，可以观察到细胞生长状态良好；图4为病毒样品PCR检测结果。
具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、EV-71蚀斑形成方法的建立1、材料和方法1)细胞Vero细胞株(购自Invitrogen公司)，按照常规方法传代培养，取48h内 长成的单层细胞用于实验。2)待纯化样品从河南省采集手足口病患者临床粪便样本3份、从安徽省采集手足口病患者临床 咽拭子样本1份和从重庆市采集手足口病患者临床肛拭子样本3份，粪便样本分别溶于无 菌的pH7. 2、0. 01M/L的PBS溶液(内含2. 5ug/ml的两性霉素B或者40ug/ml的制霉菌素) 中，充分混勻后离心，上清通过0. 22um的滤膜后直接接种于Vero单层细胞；咽拭子和肛 拭子样本采集后将棉拭子折断后放入装有2ml含0.2% (体积百分比)的牛血清白蛋白、 100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素，pH7. 2、0. 01M/L的PBS溶液的无菌小瓶中，之后通 过机械震荡使材料从拭子上洗下，液体通过0. 22um的滤膜后直接接种于Vero单层细胞，当 细胞病变达到95%左右的收获细胞，-70°C冻融3次之后保存备用。3)试剂和培养基含有10% (体积百分比)胎牛血清的营养液的配制方法500ml DMEM液、50ml胎 牛血清、100U的青霉素、100U的链霉素，5ml 100XNEAA (非必需氨基酸)、IOOul 1M/L HEPES, 之后用实验室配制的经过0. 22um滤膜过滤除菌的7. 5% NaHCO3(质量百分比)调节溶液 的PH值至7. 0-7. 2，上述DMEM液、胎牛血清、青霉素、链霉素，100XNEAA (非必需氨基酸)、 HEPES均为GIBCO公司产品。含有2% (体积百分比)胎牛血清的细胞维持液的配制方法500ml DMEM液、IOml 胎牛血清、100U青霉素、100U链霉素，5ml 100X NEAA (非必需氨基酸)和IOOul 1M/L HEPES 混勻，之后用实验室配置的经过过滤除菌的7. 5% NaHCO3(质量百分比)调节溶液的pH值 为7. 0-7. 2 ；上述DMEM、胎牛血清、青霉素、链霉素，100XNEAA (非必需氨基酸)、HEPES均为 GIBCO公司产品。注一般市售的青霉素为80万U/瓶，将其溶解于4ml灭菌去离子水中， 每升培养液中加入0. 5ml，其最终浓度为100U/ml ；市售的链霉素为100万U/瓶，将其溶解 于5ml灭菌去离子水中，每升培养液中加入0. 5ml，其最终浓度为100U/ml。2XMEM培养基的配制方法10XMEM(Invitrogen公司)200mL，去离子水800mL， 2M HEPES 20mL,200mmol/l 1^-61肽31^1^仏-谷氨酰胺)201^，100\陬44(非必需氨基 酸)20mL, 100U/ml的青霉素，100U/ml的链霉素，7. 5% (质量百分浓度)NaHCO3 50mL充分 混勻后用0. 22um滤膜过滤除菌，分装后4°C保存。100XNEAA (非必需氨基酸)、HEPES、青霉 素、链霉素抗生素购自GIBCO公司。2、蚀斑纯化病毒的方法1)细胞单层的制备将75cm2方瓶内长成单层的Vero细胞(Invitrogen公司)先用ρΗ7· 2,0. 01M/L的 无菌PBS溶液洗3次后吸出，加入0. 25% (质量百分比)的胰蛋白酶消化后吸出消化液，用 80ml含有10% (体积百分比)胎牛血清的营养液悬浮细胞制成悬液，按照3ml/孔接种于
56孔板(6孔板属于细胞培养中常见的实验耗材，其面积为IOcm2)中，37°C 5% CO2培养箱培 养，待细胞长成单层时做蚀斑纯化的实验。2)病毒的稀释和感染用含有2% (体积百分比)胎牛血清的细胞维持液将步骤1中的步骤2)所准备的 病毒培养上清液做10倍连续稀释，放置备用。之后吸去6孔板中的原有细胞培养液，每孔 分别加入Iml上述病毒稀释液，每一个稀释度做2个孔，放置CO2培养箱中在37°C、5% (体 积含量)C02，95% (体积含量)空气，99%湿度；一个大气压的条件下吸附1小时，中间轻轻
摇晃一次。3)覆盖培养基培养形成蚀斑待步骤2)中病毒吸附步骤剩余20分钟的时候，准备好2个50ml无菌的离心管，分 别盛有20ml含有2% (体积百分比)胎牛血清的2XMEM培养基和20ml 2. 5g/L的Gelrite 结冷胶溶液放入56°C水浴锅中预热，病毒吸附1小时后，吸去6孔板中的病毒液，用无菌的 PBS溶液(pH7. 2,0. 01M/L)洗细胞2次，之后快速混勻2XMEM培养基和Gelrite结冷胶溶 液后，将混勻的培养基在凝固前按照3ml/孔的量加入孔中，(加入后厚度约为0. 5-0. 7cm) 待加入的培养基冷却凝固后封口继续放置细胞培养箱中在37°C 5% (体积含量)C02，95% (体积含量)空气，99%湿度，一个大气压的条件下培养。同时做不加Gelrite胶的平行处 理加入相同浓度的病毒液吸附1小时后，用无菌的PBS溶液细胞2次后，每孔加入3ml含 有2% (体积百分比)胎牛血清的细胞维持液，封口后继续培养，24小时后观察细胞的生长 状况，不加凝胶组做染色观察。上述凝固后的培养基即为添加体积百分比的胎牛血清，2M HEPES 10mL/L, L-谷氨酰胺2mmol/L，100 X NEAA 10mL/L，青霉素50U/ml，链霉素50U/ml，质量百分含量为 7. 5%的NaHCO3溶液25mL/L的MEM培养液添加SIGMA公司生产的Gelrite Gellan Gum的 添加量为1. 25g/L凝固后的固体培养基。上述Gelrite结冷胶一种结冷胶产品，Gelrite Gellan Gum本身为粉末状物质， 易溶于水，形成浑浊状液体，无粘性，高压灭菌后呈透明状液体保存于4°C冰箱中，使用的时 候取出适量56°C温预，由于离子的存在，当与2XMEM培养液等体积混合降至室温时即形成 固体凝胶状。2. 5g/L的Gelrite结冷胶配方称取2. 5克粉末GelriteGellan Gum加入 0. 9L去离心水中，磁力搅拌器上加热形成混勻液后定容至lL，200mL每瓶分装后121°C高压 灭菌30分钟，待温度下降至室温后放入4°C冰箱保存。GelriteGellan Gum购自SIGMA公 司，Batch# :027K00251o上述经病毒吸附，覆盖Gelrite胶凝糖的单层细胞2_5天可以看到明显的蚀斑形 成，但是蚀斑的大小以及形成明显斑的时间依不同病毒株而有差异，有的斑呈葡萄串型，有 的则呈蜂窝型。4)挑斑和染色次日后持续观察细胞的生长状况，待48-72小时出现蚀斑的时候， 选择病毒蚀斑形态较好(选择病毒蚀斑形态较好的标准首先要求在一个培养孔中蚀斑的 数目不得超过10个，同时距离所近的蚀斑在10毫米以上。最后所挑选的蚀斑部位用显微镜 观察可以看出与周围的细胞有明显的差异。对单斑(见图1和图2所示)进行挑取的方法 用无菌Iml微量移液器吸管吸取500ul含2% (体积百分比)胎牛血清的细胞维持液加入 到无菌的细胞冻存管中，之后用该微量吸管，插入预挑选蚀斑部位(显微镜观察时用记号笔标记出蚀斑的部位，便于以后在工作台中挑取蚀斑)，垂直吹打几次后吸出放入冻存管中 (微量吸管中含有凝胶以及病毒形成的单斑)，用该微量吸管吸取IOOul冻存管中的液体再 反复吹打蚀斑部位，目的是将病毒单斑完全从孔上吹起，将吸出的液体反复冻融3次后(冻 融3次的具体方法放入_70°C冰箱过夜，次日在37°C水浴锅中融化，再重复2次，-70°C处 理无需过夜但是每次的冻融要保证充分冻结或者融化)，在超声仪中超声2min，2000rpm离 心10分钟后取上清作为病毒液重复上述步骤1) -3)的制备蚀斑过程，再重复2次，即可获 得纯化的病毒株。共获得EV71型病毒纯化株7株，其中从河南省采集的样品中分离到三株病毒 EV-71型病毒河南分离株1 (简称EV-71H1)、EV-71型病毒河南分离株2 (简称EV-71H2、 EV-71型病毒河南分离株3(简称EV-71H3)；从安徽省采集的样品中分离到一株名EV_71 型病毒安徽分离株1(简称EV-71 Al)；从重庆采集的样品中分离到三株病毒EV-71型病毒 重庆分离株1(简称EV-71 C1)、EV-71型病毒重庆分离株1(简称EV-71 C2)、EV_71型病毒 重庆分离株1(简称EV-71 C3)。上述其中两个毒株形成的蚀斑见图1、图2、图3。图1和图2分别是EV-71型病毒 河南分离株2和EV-71型病毒重庆分离株1第3轮蚀斑纯化时挑取单斑的照片，由图片可 以看出，病毒已形成蚀斑。蚀斑部位的细胞出现变圆聚集的现象，而其周围的细胞则无任何 变化。图3为Vero细胞阴性对照照片，可以观察到细胞生长状态良好。上述七株病毒经过扩增后保存病毒种子，并进行病毒蚀斑形成检测，病毒基因组 检测和感染性滴度测定。3、蚀斑纯化获得病毒的检测1)蚀斑滴定计数试验按照上述步骤2中的步骤2)-步骤3)的方法，将步骤2中 的步骤4)获得的纯化的病毒株在6孔细胞板单层Vero细胞上进行病毒接种，待细胞单层 上出现明显的蚀斑时，在不加Gelrite胶的细胞板上通过染色计数蚀斑数(PFU/ml)。首先 吸出原细胞孔中的维持液，每孔加入3ml的5% (体积百分比)甲醛溶液固定10-30min，吸 出固定液，用自来水沿细胞孔中间缝隙冲洗固定液，最后加入KVF染色液(KVF染色液配方 每IOOml含0. 85g NaCl、Ig结晶紫、20ml无水乙醇、5ml 37%甲醛溶液，加水补足至100ml, 过滤后避光保存)IOmin用自来水沿细胞孔中间缝隙冲洗染色液，自然晾干后计数。病毒蚀斑形成单位的滴定计算方法，以Iml中所形成的蚀斑数目来表示。用公式A =aXb/v计算，A 每毫升病毒中蚀斑形成单位的数目；a 平均每孔中出现的蚀斑数；b 病 毒稀释倍数；ν 每孔接种的病毒体积。蚀斑滴度和病毒滴结果比较了经过三轮的蚀斑纯化和扩增后的病毒感染力和 以前分离的病毒感染力，首先测定病毒的TCID5tl，之后利用相同的浓度经过蚀斑测定，结果 显示经过蚀斑纯化后的要比之前的高。具体见表1和表2。表1 :EV_71型病毒纯化前后病毒滴定的比较
表
权利要求
EV 71型病毒蚀斑纯化方法，包括下述步骤1)制备单层vero细胞，加入待纯化的样品液，吸附1 2小时；2)将吸附后的细胞表面覆盖一层培养哺乳动物细胞用固体培养基培养至病毒蚀斑出现；3)挑取病毒蚀斑获得病毒液。
2.根据权利1所述的方法，其特征在于所述培养哺乳动物细胞用固体培养基为哺乳 动物细胞培养用培养液添加结冷胶获得的固体培养基，所述结冷胶为=SIGMA公司生产的 Gelrite Gellan Gum0
3.根据权利2所述的方法，其特征在于所述培养哺乳动物细胞用培养液为含有MEM 培养基成分的培养液。
4.根据权利3所述的方法，其特征在于所述培养哺乳动物细胞用培养液由基础培 养液和如下终浓度的物质组成胎牛血清体积百分比1%，2M HEPES 10mL/L，L-谷氨酰 胺2mmol/L，100XNEAA 10mL/L，青霉素50U/ml，链霉素50U/ml，质量百分含量为7. 5%的 NaHCO3溶液25mL/L ；所述基础培养基为MEM培养液。
5.根据权利4所述的方法，其特征在于所述培养哺乳动物细胞用固体培养基中SIGMA 公司生产的Gelrite Gellan Gum的添加量为1. 25g/L。
6.根据权利1-5中任意一项所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述的吸附条 件37°C 5% C02，95%空气，99%湿度，一个大气压，所述5%和95%均为体积百分含量；所 述步骤2)中，所述的培养条件37°C 5% C02，95%空气，99%湿度，一个大气压，所述5%和 95%均为体积百分含量。
7.根据权利1-6中任意一项所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，所述挑取蚀斑 的方法是用微量移液器插取无菌的微量吸管，吸取含体积百分比为2%的胎牛血清的细胞 维持液放入无菌的冻存管中，之后用该微量吸管插入蚀斑部位，垂直吹打后吸出放入上述 冻存管中，再吸取冻存管中含有病毒的液体插入上述蚀斑部位反复吹打，吸出即获得病毒 液。
8.根据权利7所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，还包括将获得的病毒液冻融3 次作为待纯化样品，重复步骤1)“步骤3) 2次，获得纯化的病毒。
9.根据权利1-8中任意一项所述的方法，其特征在于所述EV-71型病毒为肠道病毒 EV71型(Enterovirus 71)肠道病毒EV71型河南分离株2CGMCC Na . 3675或肠道病毒EV71 型(Enterovirus 71)肠道病毒EV71型重庆分离株ICGMCC Na . 3674。
10.根据权利1-9中任意一项所述的方法，其特征在于所述待纯化的样品液为采集的 临床手足口病患者血清、粪便、咽拭子或肛拭子用PH7. 2、0. 01M/L的PBS溶液中添加积百分 比为0. 2%的牛血清白蛋白、100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素获得的溶液洗涤获得的 液体，过滤灭菌后接种于Vero细胞，当细胞病变达到95%时，收获细胞-70°C冻融3次，获 得的病毒液。
全文摘要
本发明公开了一种EV-71型病毒蚀斑纯化的方法。该方法包括下述步骤1)制备单层vero细胞，加入含病毒的样品液，吸附1小时；2)将吸附后的细胞表面覆盖一层MEM固体培养基培养至病毒蚀斑出现；3)挑取病毒蚀斑获得病毒液。本发明的方法用病毒样品吸附Vero细胞单层，覆盖MEM细胞固体培养基，3-5天可以看到明显的蚀斑形成，实验证明，经过3轮蚀斑纯化和扩增后，RT-PCR检测和测序表明已经得到纯化的病毒株。
文档编号C12N7/02GK101948815SQ201010229519
公开日2011年1月19日 申请日期2010年7月12日 优先权日2010年7月12日
发明者吴晓燕, 常国辉, 康晓平, 户义, 李靖, 杨银辉, 林磊, 祝庆余, 罗彦军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所