专利名称：一种pcr微阵列检测多种流感病毒的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种PCR微阵列检测多种流感病毒的试剂盒，该试剂盒利用实时荧光 PCR技术结合微阵列方法，能在同一个反应板上同时进行多种流感病毒核酸检测.。
背景技术：
流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，属于正黏液病毒科。流感病毒侵袭的目标是呼吸道粘膜上皮细胞，感染后会造成急性上呼吸道感染，是高度接触传染性的群发性呼吸道疾病，严重时可累及心肺等人体重要器官。 由于流感病毒可经由空气传播，且会引起大范围的流行，尤其是在免疫力低下的人群中会引起严重症状，如肺炎，心力衰竭等。临床以突发，高热，咳嗽，呼吸困难，衰竭，高发病率，低死亡率为主要特征。根据流感病毒感染的对象，将病毒分为人类流感病毒，猪流感病毒，禽流感病毒等类群。其中人类流感病毒根据其病毒核蛋白的抗原性分为甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，又称A型、B型、C型流感病毒。甲型流感病毒根据其核蛋白抗原的不同分为 Hl H15共15个亚型，人类对15个亚型中的Hl和H3亚型易感。禽流感病毒属于甲型流感病毒，世界各地爆发的禽流感主要由高致病性的H5、H7、H9三种亚型引起的。2009年爆发的甲型Hmi流感是由甲型Hmi流感病毒引起的。流感的爆发已有百年的历史，每次流感疫情均给经济发展和公共卫生带来巨大的损失，因此建立快速检测流感病毒的诊断技术是预防和控制该疾病流行的一个重要保障。目前，作为检测流感病毒的方法主要有以下几种(1)病毒分离鉴定。采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。样本制成悬液接种于10 11日龄鸡胚尿囊腔，4 后收集尿囊液，可再以MDCK细胞培养以收获病毒培养液或进行滴度鉴定。该方法检测时间长且对操作者要求比较高；( 血清学方法，也是病毒鉴定的常规手段，通过血清学鉴定来判断病毒的种属和亚型。但实验过程中常受到非特异性凝集因素、抗体特异性等方面干扰，对抗原的标准化、单克隆抗体制备技术等方面提出更严格的要求。(3)聚合酶链式反应 (PCR)检测方法，具有简便、快速、灵敏度高、特异性好等优点，可广泛应用于流感病毒的核酸检测。针对特异性序列位点设计引物和探针，可同时检测多种病毒核酸，满足高通量快速检测的需求。PCR微阵列反应是利用实时荧光PCR技术结合微阵列的方法来检测多种病毒，可以满足高通量，快速检测的要求。具体的来说，在96或384孔板的各孔中分别加入不同病毒核酸特异性引物和荧光探针制成PCR微阵列反应板，使用时每孔加入等量的PCR反应液， 再将病毒核酸样本加入反应体系中，进行PCR扩增。在同一反应条件下同时进行多管PCR 反应，可同时实现多种病毒核酸的高通量检测。除此之外，每一种待检的病毒分别设置阳性和阴性质控品，进行质量控制和环境监控。按照合理有序，96或384孔板上的排列方式依照不易污染且易于操作的原则。PCR微阵列一次性可检测多种病毒，尤其当需要对临床症状相近病原体进行鉴别或对同种属病原体分型时，PCR微阵列方法可迅速确定病原体，从而节省了在数据分析方面所花费的时间，在更短的时间内得到多种病毒核酸检测的数据信息。在流感病毒的鉴别诊断和监控方面，尤其针对流感疫情病原体快速排查，该技术将发挥巨大优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PCR微阵列方法检测多种流感病毒的试剂盒，该试剂盒可以同时检测包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、季节性流感病毒Hl亚型、H3亚型、甲型 HlNl流感病毒、高致病性禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型8种流感病毒。本发明在对GENBANK上所有已知的流感病毒核酸序列进行比对的基础上，寻找待检流感病毒核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计各病毒靶多核苷酸引物和探针。 这些引物探针在含有逆转录酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNIPs)以及Mg2+等的PCR 反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增，从而达到一次性快速检测多种流感病毒核酸的目的。本发明所涉及的试剂盒中主要包括1)PCR微阵列反应板、PCR反应液，2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。本发明的一个优选实施方案是PCR微阵列反应板由PCR反应板以及加在各反应孔中的引物探针混合液所组成，其中PCR反应板可选择市售的96孔PCR反应板或384孔板 PCR反应板，如Bioplastic公司产品。本发明的一个优选实施方案，引物探针混合液包括引物和探针，其中引物终浓度均为0. 2mmol/L，探针终浓度均为0. lmmol/L。本发明的另一个优选实施方案是各反应孔中的引物探针混合液针对不同病毒的使用相应的引物和探针，其中甲型流感病毒对应的正向引物和反向引物序列为5’ -ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGA -3，(SEQ ID NO :1)和 5，-AATCCCCTTAGTCAGAGGTGACAG-3，(SEQ ID NO :2)，探针序列为 5’-CATCCCGTCAGGCCCCCTCAA-3，(SEQ ID NO :3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM 和荧光淬灭基团BHQl ；乙型流感病毒对应的正向引物和反向引物序列为 5，-GATGGCCATCGGATCCTCA-3，(SEQID NO 4)和 5，-CCGTGACCAGTCTAATTGTCTCC-3，(SEQ ID NO :5)，探针序列为5，-AATTGGGATAAGACTCCCACCGCAG-3，(SEQ ID NO :6)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；甲型Hmi流感病毒对应的正向引物和反向引物序列为 5，-CCTATTTGGGGCCATTGCC-3，(SEQ ID NO 7)和 5，-ATCTCGTCAATGGCATTCTGTG-3，(SEQ ID NO :8)，探针序列为5，-CCGACCTGAAGAGCACACAGAATGC-3，(SEQ ID NO :9)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；禽流感病毒H5亚型对应的正向引物和反向引物序列为 5，-GAAGGGAATTTAATAACTTG-3，(SEQ ID NO 10)和 5，-GTTCAGCATTATAAGTCC-3，(SEQ ID NO :11)，探针序列为5，-CAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTC-3，(SEQ ID NO :1 ，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；禽流感病毒H7亚型对应的正向引物和反向引物序列为5，-GATCAATGTATGGAGAGCAT-3，(SEQ ID NO 13)和 5，-GTATTCTATTCTGCAGTGACTC-3，(SEQ ID N0:14)，探针序列为5，-CAACACTTATGACCATACCCAATACAGAAC-3，(SEQ ID NO :1 ，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；禽流感病毒H9亚型对应的正向引物和反向引物序列为 5，-GCTGTGTGCAACAAATCTGG-3，(SEQ ID NO 16)和 5，-CAACAGTAGATCACAGGAAG-3，(SEQ ID NO 17)，探针序列为5，-CGTCCCCTCATTCTGGACACCTGTACCAT-3，(SEQ ID NO 18)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；人流感病毒Hl亚型对应的正向引物和反向引物序列为 5，-TCCCCAAAGAGAGCTCATG-3，(SEQ ID NO 19)和 5，-CTGCTTTCCCCATTATG-3，(SEQ ID NO: 20)，探针序列为5，-CCCAACCACACCGTAACCGGAGTATCAGC-3，(SEQ ID NO :21)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；人流感病毒H3亚型对应的正向引物和反向引物序列为 5，-CATTCCAAAATGTAAACAG-3，(SEQ ID NO 22)和 5，-CAATTTCAGAGTGTTTTGC-3，(SEQ ID NO :2；3)，探针序列为5，-CACATACGGGGCCTGTCCCAGATAT-3，(SEQ ID NO :24)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl。本发明的一个优选实施方案是PCR反应液由PCR反应缓冲液、PCR反应所需的酶组成，其中 PCR 反应缓冲液由 Tris-HCl (50mmol/L, pH8. 0)、MgC12 (8mmol/L)、KC1 (250mmol/ L)、甲酰胺(5% )和dNIPs (25mmol/L)组成。PCR反应所需的酶包括热启动Taq酶、MMLV, 其中每人份PCR反应液中热启动Taq酶的用量为5U、MMLV用量为3U。热启动Taq酶、MMLV 均可采用市售产品，如Qiagen公司的产品。本发明的另一个优选实施方案是PCR扩增的条件为50°C 15分钟，95°C 15分钟； 940C 15秒，58°C 45秒，40个循环(55°C时收集荧光信号)。检测过程由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。检测结果可用于引起流感的病原体的鉴别诊断和监控。本发明与一般的荧光PCR技术相比，优点为①PCR微阵列反应可同时对多种流感病毒核酸进行检测，可迅速确定病原体，真实反映出待检者流感病毒的感染状况，减少重复检测的工作量和工作时间，有助于疾病的早期诊断和治疗。②PCR微阵列可以根据需求自行设计各种组合，如只包括甲型流感病毒、乙型流感病毒的PCR微阵列或者包括人流感病毒H1、H3亚型、禽流感病毒H5、H7、H9亚型所有亚型或其中几种亚型的PCR微阵列等；③根据需要，PCR微阵列还可以通过增加其他呼吸道病原体特异性的引物探针而实现该种病原体的检测，同时PCR反应板可以96孔扩展为384孔。由于各反应孔之间是独立的，因此这些组合方式以及扩展不会影响试剂盒的检测效果。
图1显示PCR微阵列反应板96孔的排列方式。图2显示PCR扩增的反应条件。图3显示一例甲型流感病毒感染者咽拭子的扩增曲线。图中FAM标记的扩增曲线为标准的S型，说明该样本有甲型流感病毒核酸的扩增，表示样本中存在甲型流感病毒。图4显示一例乙型流感病毒感染者咽拭子的扩增曲线。图中FAM标记的扩增曲线为标准的S型，说明该样本有甲型流感病毒核酸的扩增，表示样本中存在乙型流感病毒。图5显示一例甲型流感病毒Hl型感染者咽拭子的扩增曲线。图中FAM标记的扩增曲线为标准的S型，说明该样本有甲型流感病毒Hl型核酸的扩增，表示样本中存在甲型流感病毒Hl型。图6显示一例甲型流感病毒H3型感染者咽拭子的扩增曲线。图中FAM标记的扩增曲线为标准的S型，说明该样本有甲型流感病毒H3型核酸的扩增，表示样本中存在甲型流感病毒H3型。图7显示一例阳性甲型Hmi流感病毒感染者咽拭子的扩增曲线。图中FAM标记的扩增曲线为标准的S型，说明该样本有甲型Hmi流感病毒核酸的扩增，表示样本中存在甲型Hmi流感病毒。图8显示一例来自禽类的禽流感病毒H5亚型阳性咽喉拭子的扩增曲线。图中FAM 标记的扩增曲线为标准的S型，说明该样本有禽流感病毒H5亚型核酸的扩增，表示样本中存在禽流感病毒H5亚型。图9显示一例来自禽类的禽流感病毒H7亚型阳性咽喉拭子的扩增曲线。图中FAM 标记的扩增曲线为标准的S型，说明该样本有禽流感病毒H7亚型核酸的扩增，表示样本中存在禽流感病毒H7亚型。图10显示一例来自禽类的禽流感病毒H9亚型阳性咽喉拭子的扩增曲线。图中 FAM标记的扩增曲线为标准的S型，说明该样本有禽流感病毒H9亚型核酸的扩增，表示样本中存在禽流感病毒H9亚型。图11显示8例阴性样本检测的扩增曲线。图12显示一例甲型流感病毒感染者鼻拭子样本中病毒核酸扩增情况。图中FAM 标记的扩增曲线为标准的S型，表示样本中存在甲型流感病毒。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1 PCR微阵列检测多种流感病毒核酸试剂盒及其使用1、制备包括下列组成成分的试剂盒96孔PCR微阵列反应板1块，PCR反应液2 管、900 μ 1/管。2、标本的采集、保存和运输2. 1适用标本类型鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物2.2标本采集，保存和运送发病后应尽快采集，具体操作方法如下用灭菌棉拭子取鼻腔或咽喉分泌物，并立即投入装有灭菌生理盐水或fegle液或0. 5%水解乳蛋白Hanks液2mL的小试管中，贴好标签，置冰壶内携至实验室或低温(_20°C -70°C)冻存。标本长途运送采用干冰。3、核酸提取建议使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取试剂盒。按照 QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书进行，最后收集到50 μ 1 RNA溶液，直接进行检测或保存于-20°c。4、实时荧光定量PCR扩增及检测4. 1加样PCR微阵列反应板瞬时离心后，打开管盖，向各PCR反应管中分别加入PCR反应液18μ 1，提取后的RNA溶液5μ 1，盖紧管盖，放入仪器样品槽。4. 2 编辑(ABI Prism 7500 荧光定量 PCR 仪)打开ktup窗口，按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择Add Detector选择R印orter为FAM和 Quencher 为 BHQl 后关闭窗口。在 Passive Reference 中选择(none)。打开 instrument 窗口设置循环条件50°C 15分钟，95°C 15分钟；94°C 15秒，58°C 45秒，40个循环(见附图1)。所有设置完成后保存文件，运行。4. 3结果分析反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Amp plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start :3，stop 10，并打开manual设定Threshold 1.5 士 100000。双击 Rn 坐标上数值打开 Graph settings 窗口，将 Post Run kttings 中 Log 改为 Linear, OK 后打开 Analysis preferences 窗□,在 Analysis 菜单下选择 Analyze 自动分析结果。实施例2应用PCR微阵列检测多种流感病毒核酸试剂盒检测临床样品选取8例经血清学方法检测为流感病毒阴性、9例经血清学方法检测为相应流感病毒阳性的咽拭子标本，核酸提取、PCR扩增及结果分析参照实施例1进行，同时进行阴、阳性质控品的检测。检测结果解释各流感病毒阴性质控品扩增曲线均为不规则曲线或无CT值；阳性质控品的扩增曲线为S型曲线，由待检标本的检测结果可知阳性样本本试剂盒均检测到相应的流感病毒核酸的扩增，阴性样本本试剂盒检测结果均为阴性(见附图3-图12)。本次试验中17例标本的检测结果与ELISA鉴定结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测及区分相应的流感病毒是可行的。本试剂盒操作简便，检测时间短，一次实验可同时筛查多种流感病毒。
权利要求
1.一种PCR微阵列方法检测多种流感病毒的试剂盒，包括1)PCR微阵列反应板、PCR 反应液，幻分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于PCR微阵列反应板由PCR 反应板以及加在各反应孔中的引物探针混合液所组成，引物探针混合液包括针对不同流感病毒的引物和探针，其中引物终浓度均为0. 2mmol/L，探针终浓度均为0. lmmol/L。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于各反应孔中的引物探针混合液针对不同流感病毒使用相应的引物和探针，其中甲型流感病毒对应的正向引物和反向引物序列为5 ’ -ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGA-3 ’和 5，-AATCCCCTTAGTCAGAGGTGACAG-3，，探针序列为5，-CATCCCGTCAGGCCCCCTCAA-3，，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；乙型流感病毒对应的正向引物和反向引物序列为5 ’ -GATGGCCATCGGATCCTCA-3 ’和 5，-CCGTGACCAGTCTAATTGTCTCC-3，，探针序列为5，-AATTGGGATAAGACTCCCACCGCAG-3，，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；甲型Hmi流感病毒对应的正向引物和反向引物序列为5，-CCTATTTGGGGCCATTGCC-3， 和 5，-ATCTCGTCAATGGCATTCTGTG-3，，探针序列为5，-CCGACCTGAAGAGCACACAGAATGC-3，，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；禽流感病毒H5亚型对应的正向引物和反向引物序列为5 ’ -GAAGGGAATTTAATAACTTG-3 ’ 和 5，-GTTCAGCATTATAAGTCC-3，，探针序列为5，-CAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTC-3，， 探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；禽流感病毒H7亚型对应的正向引物和反向引物序列为5 ’ -GATCAATGTATGGAGAGCAT-3 ’ 和 5，-GTATTCTATTCTGCAGTGACTC-3，，探针序列为5，-CAACACTTATGACCATACCCAATACAGAAC-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；禽流感病毒H9亚型对应的正向引物和反向引物序列为5，-GCTGTGTGCAACAAATCTGG-3， 和 5，-CAACAGTAGATCACAGGAAG-3，，探针序列为5，-CGTCCCCTCATTCTGGACACCTGTACCAT-3，， 探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；人流感病毒Hl亚型对应的正向引物和反向引物序列为5’ -TCCCCAAAGAGAGCTCATG-3’ 和 5，-CTGCTTTCCCCATTATG-3，，探针序列为5，-CCCAACCACACCGTAACCGGAGTATCAGC-3，，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ；人流感病毒H3亚型对应的正向引物和反向引物序列为5’ -CATTCCAAAATGTAAACAG-3’ 和 5，-CAATTTCAGAGTGTTTTGC-3，，探针序列为5，-CACATACGGGGCCTGTCCCAGATAT-3，，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR反应液由PCR反应缓冲液、PCR 反应所需的酶组成，其中PCR反应缓冲液由pH值为8.0的50mmol/L Tris-HCl、8mmol/L MgCl2,250mmol/L KC1、5% 甲酰胺和 25mmol/L dNIPs 组成。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR反应所需的酶包括热启动Taq酶、 MMLV，其中每人份PCR反应液中热启动Taq酶的用量为5U、MMLV用量为3U。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的条件为50°C15分钟，95°C 15 分钟；94 °C 15秒，58 °C 45秒，40个循环。
全文摘要
本发明涉及一种PCR微阵列方法检测多种流感病毒的试剂盒。本试剂盒主要包括PCR微阵列反应板、PCR反应液，及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。试剂盒利用实时荧光PCR技术结合微阵列方法，在同一个反应板上同时检测包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、季节性流感病毒H1亚型、H3亚型、甲型H1N1流感病毒、高致病性禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型8种流感病毒，检测结果可用于引起流感的病原体的鉴别诊断和监控。
文档编号C12Q1/70GK102337352SQ20101022951
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者李明, 陈华云, 高秀洁 申请人:中山大学达安基因股份有限公司