专利名称：核酸适体衍生物及其在制备药物载体中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸适体衍生物及其在制备药物载体中的应用。
背景技术：
肝癌是世界上最普遍的和高致命性的癌症之一。目前早期肝癌患者的有效治疗方 法主要是手术切除和肝移植。传统的化疗对肝癌患者效果不好，并且传统药物由于缺乏对 肝癌细胞的特异性，通常会给患者带来致命性的副作用。为了克服这些问题并提高化疗的 选择性，需要研发在肿瘤区域特异性给药的靶向药物。肿瘤细胞靶向给药是提高肿瘤治疗效果减少毒副作用的有效途径。将药物偶联于 肿瘤细胞特异性配体上是靶向给药的主要方法。例如将药物共价结合于细胞表面肿瘤标志 物的单克隆抗体上，这些偶联药物的单抗能选择性结合肿瘤组织，从而提高抗肿瘤药物的 效果，减少毒副作用。这类药物在临床前的试验中取得了很好的效果，目前正在进行相关 的临床实验(Carter, P. J. ；Senter, P. D. Cancer J. 2008，14，154—169. Chari, R. V. J. Acc. Chem. Res. 2008，41，98-107.)。例如人源化的CD33抗体-加里刹霉素偶联物Mylotarg,已 经被批准用于急性骨髓系白血病(AML)的治疗。但是用于药物靶向输送的抗体来源于动物 或融合的单克隆细胞，需通过生物过程产生，其制备繁琐，成本高，稳定性差，难以进行化学 修饰和改造；同时抗体还具有分子量大、组织穿透力弱、易引起免疫反应等问题，限制了其 广泛应用。寻找新的肿瘤细胞特异性识别分子取代抗体是靶向药物治疗的一个重要发展方 向。核酸适体(Aptamer，又称核酸适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某 种生物靶标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是从SELEX(指数富集配基系 统进化)过程中选择出来的。它们通过分子内碱基堆积、疏水相互作用、氢键和静电相互作 用折叠形成独特的三维空间结构，从而与靶分子特异性结合(Breaker R R，Nature 2004， 432，838-845)。核酸适体与靶分子结合的亲和力和特异性与单克隆抗体相似，甚至更强。与 抗体相比，核酸适体具有较低的分子量(15-50bases ；4-15kD)、快速组织通透性、没有免疫 源性和毒性。核酸适体一旦筛选出来，就可以通过自动化的固相化学合成来制备，无需免疫 动物或细胞培养的过程以及后续繁琐的分离纯化过程，价格大大降低。核酸适体很容易进 行结构改造并标记上各种分子，如放射性元素、荧光染料等(Nutiu R & Li Y，Angew Chem Int Ed 2005，44，1061-1065 ；Liu, J. W. & Lu, Y. Angew Chem Int Ed 2006，45，90-94)。核 酸适体稳定性高，可以可逆的变性与复性，可在常温下保存和运输。从靶向老鼠肝癌细胞的核酸适体中曾经筛选得到一条核酸适体序列TLSllajn 序列表的序列 1 所不(Shangguan, Dihua ；Meng, Ling ；Cao, Zehu i Charles ；Xiao, Zeyu ； Fang, Xiaohong ；Li, Ying ；Cardona, Diana ；ffitek, Rafal P. ；Liu, Chen ；Tan, ffeihong, Identification of Liver Cancer-Specific Aptamers Using Whole Live Cells. Analytical Chemistry,2008,80(3)，721-728.。
发明内容
本发明的目的是提供核酸适体衍生物及其在制备药物载体中的应用。本发明提供的核酸适体衍生物为式⑴或式(II)或式(III)所示的单链DNA ；式(I):5，-(CG)n-核酸适体-3，；式(II) :5’ -核酸适体 _(CG)m_3’ ；式(III)5，-(CG)tl-核酸适体-(CG) t2_3，；所述核酸适体如序列表的序列1所示；η = 1-50 ；m = 1-50 ；tl = 1-50 ；t2 = 1-50。n、m、tl和t2均为自然数。还可将所述核酸适体衍生物进行如下改造，也可以达到相同的靶向功能(1)将核酸适体衍生物的骨架部分或全部改造为硫代磷酸酯骨架或对部分或全部 骨架上的糖环进行2’ -F和2’ -NH2修饰；(2)将核酸适体衍生物的部分或全部改造为肽核酸；(3)将核酸适体衍生物中的一个以上核苷酸替换为锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)和/或连接分子，再将抗癌药物通过嵌入形成核酸适体-药物复合物；所述连接 分子为一个以上的六聚乙二醇-ι-磷酸。O=P-O式(工)。
I
0-如式(I)所示，六聚乙二醇-1-磷酸的骨架为6个乙二醇的聚合物，骨架一端的氧 连接一个带负电的磷酸基团。用六聚乙二醇-1-磷酸替代核酸适体中的核苷酸时，通过骨 架两端的氧与两端的核苷酸连接。所述核酸适体衍生物具体可如序列表的序列3、序列4或序列5所示。所述核酸适体衍生物可用于制备药物载体，特别是靶向药物载体。所述药物可为 抗癌药物，所述抗癌药物具体可为抗肝癌药物，如阿霉素。本发明还保护一种治疗癌症的药物，它的活性成分由所述核酸适体衍生物和抗癌 药物组成。所述癌症可为肝癌，所述抗癌药物具体可为抗肝癌药物，如阿霉素。所述活性成 分中，所述抗癌药物嵌入所述核酸适体中，所述核酸适体和所述抗癌药物的配比具体可为 1 25(摩尔比)。所述的核酸适体衍生物可用于制备辅助鉴别肝癌细胞和正常肝细胞的试剂盒。所述肝癌细胞具体可为人体肝癌细胞系LH86。所述正常肝细胞具体可为人体正常 肝细胞Hul082。所述的核酸适体衍生物可用于辅助鉴别肝癌细胞和正常肝细胞。所述肝癌细胞具体可为人体肝癌细胞系LH86。所述正常肝细胞具体可为人体正常 肝细胞Hul082。本发明在核酸适体TLSlla的基础上，进一步发现它能特异结合人的肝癌细胞。 本发明中，将核酸适体的末端分别或同时添加一段延伸序列(如可形成双链的GC重复序 列)，可以得到核酸适体衍生物。抗癌药物可以嵌入到DNA双链的GC碱基对中，形成核酸适 体_药物复合物。核酸适体_药物复合物可制备人体肝癌的靶向药物。抗癌药物与选择性试剂(如抗体，核酸适体)的结合是一种潜在的，可用于增强化疗的效果并降低药物毒性的方法。利用本发明的核酸适体衍生物作为药物载体，可以使药 物特异性结合靶细胞，降低给药剂量，明显降低药物毒副作用、提高治疗效果，具有很高的 潜在应用价值。本发明提供的核酸适体衍生物具有肝癌细胞靶向性，可以作为药物载体，对体内 肝癌细胞进行靶向给药，特异性杀死肝癌细胞，大大降低抗癌药物对机体的毒性。本发明提 供的核酸适体衍生物可大规模化学合成、易于与药物分子连接，成本低，分子量相对较小， 没有免疫活性和毒性，稳定性好，形成的药物复合物稳定。本发明提供的药物复合物(靶向 药物)与肝癌细胞结合力强，能大大降低肝癌化疗中毒副作用，具有很高的应用价值。
图1为核酸适体衍生物与肝癌细胞系LH86、人体正常肝细胞Hul082的亲和力表 征。图2为核酸适衍生物_阿霉素复合物(TLSlla-(GC)29-D0x)示意图。图3为核酸适体衍生物_阿霉素复合物对肝癌细胞的细胞毒性实验结果；横坐标 为浓度，坐标值标注为阿霉素的浓度，TLSlla和TLSlla-(GC)29的浓度均为坐标值标注除以 25。图4为经核酸适体衍生物_阿霉素复合物处理后的老鼠活体实验结果；图4A为老 鼠肿瘤体积；图4B为老鼠体重的降低率。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。人体正常肝细胞Hul082购自美国ATTC公司(Manassas，VA)。人体肝癌细胞系 LH86由美国佛罗里达大学医学院病理系刘晨教授实验室提供，由高分化的肝癌组织切片制 备，制备方法见文献("Hepatitis C virus triggers apoptosis of a newly developed hepatoma cell line through antiviral defense system，，，Zhu H, Dong H, Eksioglu E, Hemming A, Cao M, Crawford JM, Nelson DR, Liu C., Gastroenterology2007,133, 1649-59)；谭蔚泓保证向公众提供。NOD. Cg-Prkdc (scid)IL2型老鼠购自美国Jackson Laboratory (Bar Harber, ME, USA)，在佛罗里达州立大学的动物设施上养殖。洗涤缓冲液含5mM MgCl2,4. 5mg/mL葡萄糖的PBS溶液。结合缓冲液含5mM MgCl2,4. 5mg/mL 葡萄糖，0. lmg/mL yeast tRNA, lmg/mL BSA 的PBS溶液。肝癌核酸适体TLSlla的序列为(序列表的序列1)5，-ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCT G-3，。对照核酸适体TD05的序列为(序列表的序列2)5’ -CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTG-3，。
5
实施例1、核酸适体衍生物与人体肝癌细胞亲和力的表征一、核酸适体及其衍生物的制备人工合成三种核酸适体衍生物，分别在核酸适体TLSlla的5’末端引入1个GC、29 个GC和50个GC0 TLSlla-(GC)1如序列表的序列3所示。TLSlla-(GC)29如序列表的序列 4所示。TLSlla-(GC)5tl如序列表的序列5所示。人工合成三种对照核酸适体衍生物，分别在核酸适体TD05的5’末端引入1个GC、 29个GC和50个GC0 TD05-(GC)工如序列表的序列6所示。TD05-(GC)29如序列表的序列7 所示。TD05- (GC) 50如序列表的序列8所示。人工合成序列表的序列1所示的核酸适体TLSlla和序列2所示的对照核酸适体 TD05。二、核酸适体衍生物的荧光标记用荧光染料PhyCOerythrin-Cy5. 5(藻红蛋白/青色素染料5. 5)标记步骤一合 成的三种核酸适体衍生物、三种对照核酸适体衍生物、核酸适体TLSlla以及对照核酸适体 TD05。三、核酸适体衍生物与人体肝癌细胞亲和力的表征分别检测三种核酸适体衍生物、三种对照核酸适体衍生物、核酸适体TLSlIa和对 照核酸适体TD05与人体肝癌细胞(或人体正常肝细胞Hul082)的亲和力，检测方法如下人体癌细胞LH86采用无酶细胞裂解液(Cellgro)溶解，并用洗涤缓冲液清洗。 在IOOmL结合缓冲液中将肝癌细胞LH86(约IO5个)分别与0. ImL 25nM核酸适体衍生 物(TLSlla-(GC)P TLSlla-(GC)29、TLSlla-(GC)5。、TDOS-(GC)1, TD05_(GC)29、TD05_(GC)5。、 TLSlla或TD05)混合，冰浴下培养0. 5小时。然后用洗涤缓冲液清洗细胞两次并悬浮于 0. 2mL结合缓冲液中，进行流式细胞仪检测。结果见图1 ；A =TLSlla及其三种衍生物；B :TD05及其三种衍生物。结果表明=TLSlla及其衍生物对人体肝癌细胞(LH86)有着显著的亲和力，但是人 体正常肝细胞(Hul082)不与TLSl Ia及其衍生物作用，TLSl Ia及其衍生物与肝癌细胞的结 合力比与正常肝细胞的结合力显著增加，与人体肝癌细胞结合均有较高的特异性和高结合 能力，可以作为区分正常肝细胞和肝癌细胞的探针；TD05及其三种衍生物对人体肝癌细胞 (LH86)和人体正常肝细胞(Hul082)的亲和力没有显著差异。实施例2、核酸适体衍生物_药物复合物的制备一、核酸适体TLSlla和核酸适体衍生物TLSlla-(GC)29的制备为了嵌入较多的阿霉素，在核酸适体TLSlla的5’末端引入一个长的GC序列(由 29个GC依次连接组成)，从而得到一个具有延伸序列的核酸适体衍生物TLSlla-(GC)29。 TLSlla-(GC)29如序列表的序列4所示。人工合成序列表的序列1所示的核酸适体TLSlla。人工合成序列表的序列4所示 的核酸适体衍生物TLSlla-(GC) 29。二、核酸适体衍生物_药物复合物的制备和表征1、核酸适体衍生物_药物复合物的制备在结合缓冲液中，将核酸适体衍生物TLSlla-(GC)29与阿霉素以1 25(摩尔比) 的比例混合，室温搅拌孵育3小时，得到核酸适体衍生物_药物复合物。
2、核酸适体衍生物_药物复合物的纯化步骤1制备的核酸适体衍生物_药物复合物采用HPLC进行纯化。色谱柱柱长为250mm，内径为4. 6mm。填料为silica，粒径为5um。流动相为 This-HCl缓冲溶液(IOmM, ρΗ7· 4)和乙腈(梯度淋洗:0-3min，O %乙腈，3-30min 乙腈浓 度线形增至60 %，30-35min 乙腈浓度线形增至90 %，35_45min乙腈90 %，45min后O % 乙腈)。流速为lmL/min。检测波长为260nm。目标产物核酸适体衍生物-药物复合物 (TLSlla-(GC)29)在 35min 出峰。3、核酸适体衍生物-药物复合物的表征对纯化得到的核酸适体衍生物-药物复合物进行紫外检测。阿霉素浓度由495nm 波长紫外吸收值得到。TLSlla-(GC)29浓度由260nm波长紫外吸收值得到。由于阿霉素在 260nm处有明显的紫外吸收，干扰TLSlla- (GC) 29浓度的测定，为准确测定TLSlla- (GC) 29浓 度，采用紫外光谱仪分别测量495nm、260nm的吸收值。阿霉素在495nm、260nm的紫外吸光 系数分别为ε 495 = WOOOGm-1M-1，ε 260 = 24000^^^ 0通过495nm测得的阿霉素浓度，扣 除阿霉素在260nm处的干扰，最终得到TLSlla-(GC)29的浓度。TLSlla-(GC)29浓度由以下 公式计算得到
A260-(8260X A495/8495)Ua-(CiL)29(M)= ^^A为对应波长的紫外吸收值。
平均每个核酸适体衍生物_药物复合物中，含有1个核酸适体衍生物和25个阿霉
ο核酸适体衍生物-药物复合物(TLSlla-(GC)29-DOX)示意图如图2所示。三、核酸适体_药物复合物的制备和表征1、在结合缓冲液中，将核酸适体TLSlla与阿霉素以1 25(摩尔比)的比例混合， 室温搅拌孵育3小时，得到核酸适体_药物复合物。2、核酸适体-药物复合物的纯化步骤1制备的核酸适体_药物复合物采用HPLC进行纯化。液相色谱参数同步骤
--ο核酸适体-药物复合物的峰在24min时出现。3、核酸适体-药物复合物的纯化步骤2制备的核酸适体_药物复合物采用紫外表征，检测参数同步骤二。结果表明，平均每个核酸适体_药物复合物中，含有1个核酸适体和2个阿霉素。因此，利用核酸适体衍生物能提高载药量。实施例3、核酸适体衍生物_药物复合物对肝癌细胞的影响肝癌细胞LH86对阿霉素或核酸适体衍生物-药物复合物的化学敏感性的测定使 用CellTiter 96* AQueous单溶液细胞增殖分析试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)进行。 CellTiter 96 AQueous式齐[J 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymet hoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,内盐；MTS 和一个电子偶联试剂(乙硫 吩嗪，PES)。具体如下100 μ L肝癌细胞LH86 (约5 X IO4细胞/mL)在96孔板(η = 3)上 接种并37°C放置过夜生长(5% CO2,无FBS的DMEM培养基)，然后分别加入100 μ L下列DNA链(I)TLSlla;设置四个浓度梯度，分别与(4)中核酸适体衍生物-药物复合物中的 TLS1 la- (GC) 29 浓度相同，即分别为 40，100，200，300nM。(2) TLSlla-(GC)29 ；设置四个浓度梯度，分别与(4)中核酸适体衍生物-药物复合 物中的TLS1 la- (GC) 29浓度相同，即分别为40，100，200，300nM。(3)阿霉素；设置四个浓度梯度，分别为1. 0，2. 5，5. 0. 7. 5 μ Μ。(4)实施例2纯化得到的TLSlla-(GC)29-DOX ；设置四个浓度梯度，以阿霉素的浓 度计，浓度分别为 1.0，2. 5,5. 0. 7. 5μ M JgSTLSlla-(GC)29 的浓度分别为 40，100，200， 300ηΜ。1小时后清洗并在新鲜的DMEM培养基(10% FBS)中培养48h。细胞毒性测定中，先除去每个孔中的培养基，然后在每个孔中加入20uL细胞滴定 试剂(CellTiter 96 AQueous单溶液试剂)和DMEM培养基(100 μ L)，培养3h。采用微孔 板报告器(Tecan Safire microplate reader,AG, Swi tzerland)，在490nm下记录吸收值。 通过对比用TLSlla、TLSlla-GC、阿霉素、核酸适体衍生物-药物复合物处理过的细胞与空 白细胞的活性，来计算细胞活性(活细胞数量)。结果见图3。TLSlla-GC与TLSlla对细胞活性没有明显影响，阿霉素和 TLSlla-(GC)29-D0X能明显地降低肝癌细胞活性。结果表明，不同浓度下，核酸适体衍生 物_药物复合物对肝癌细胞具有与阿霉素相近的杀灭能力。实施例4、核酸适体衍生物-药物复合物在活体动物靶向给药中的应用20只NOD. Cg-Prkdc (scid) IL2老鼠，每只注射约7 X IO6个人体肝癌细胞LH86。注 射1天后，小鼠肝部均可以检测到肿块，活体检测肿瘤体积为100-200mm3。将实施例2纯化得到的核酸适体衍生物_药物复合物用生理盐水稀释。将上述得到的小鼠进行为期12天的试验如下(20只小鼠分成三组)第一组(6只)(对照组)每次注射IOOuL生理盐水；第二组(7只)每次注射IOOuL阿霉素溶液，给药剂量为2mg阿霉素/kg体重；第三组(7只)每次注射lOOuLTLSl la-(GC)29-DOX溶液，给药剂量为2mg阿霉素 /kg体重；实验前后，每只老鼠称重，计算各组老鼠的平均值。分别在第1、2、3、4、5、9、10、11 天通过老鼠尾部静脉注射给药并检测老鼠的肿瘤体积。实验结束时，统计各组老鼠的体重 下降率，体重下降率=(实验开始时体重-实验结束时体重)/实验开始时体重X100%。2、核酸适体-药物复合物对老鼠的毒性分析实验过程中，老鼠的肿瘤体积见图4A，实验结束时，各组老鼠的体重下降率见图 4B。实验结果说明TLSlla-(GC)29-D0X与阿霉素对老鼠肿瘤体积的增长均具有较强的抑制 作用。TLSlla-(GC)29-D0X对肝癌细胞生长的抑制作用与阿霉素相近，但是老鼠的体重降低 更少即副作用更少，说明核酸适体和药物结合后，具有细胞膜穿透性的阿霉素对细胞的非 特异性作用得到了抑制，因此核酸适体_药物复合物的非特异性细胞毒性大大降低。结果 表明核酸适体-药物复合物能在体内实现肝癌细胞靶向给药，对肝癌细胞生长的抑制作 用与阿霉素相近，但非特异性细胞毒性比阿霉素大大降低。
权利要求
核酸适体衍生物，是式(I)或式(II)或式(III)所示的单链DNA；式(I)5’ (CG)n 核酸适体 3’；式(II)5’ 核酸适体 (CG)m 3’；式(III)5’ (CG)t1 核酸适体 (CG)t2 3’；所述核酸适体如序列表的序列1所示；n＝1 50；m＝1 50；t1＝1 50；t2＝1 50。
2.如权利要求1所述的核酸适体衍生物，其特征在于所述核酸适体衍生物如序列表 的序列3、序列表的序列4或序列表的序列5所示。
3.权利要求1或2所述核酸适体衍生物在制备药物载体中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述药物为抗癌药物；所述抗癌药物优选为 抗肝癌药物，最优选为阿霉素。
5.一种治疗癌症的药物，它的活性成分由权利要求1或2所述核酸适体衍生物和抗癌 药物组成。
6.如权利要求5所述的药物，其特征在于所述癌症为肝癌；所述抗癌药物为抗肝癌药 物，优选为阿霉素。
7.权利要求1或2所述核酸适体衍生物在制备辅助鉴别肝癌细胞和正常肝细胞的试剂 盒中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述肝癌细胞为人体肝癌细胞系LH86；所 述正常肝细胞为人体正常肝细胞Hul082。
9.权利要求1或2所述核酸适体衍生物在辅助鉴别肝癌细胞和正常肝细胞中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述肝癌细胞为人体肝癌细胞系LH86；所 述正常肝细胞为人体正常肝细胞Hul082。
全文摘要
本发明公开了一种核酸适体衍生物及其在制备药物载体中的应用。式(I)所示的单链DNA；所述核酸适体如序列表的序列1所示；n＝1-50。本发明提供的核酸适体衍生物具有肝癌细胞靶向性，可以作为药物载体，对体内肝癌细胞进行靶向给药，特异性杀死肝癌细胞，大大降低抗癌药物对机体的毒性。本发明提供的核酸适体衍生物可大规模化学合成、易于与药物分子连接，成本低，分子量相对较小，没有免疫活性和毒性，稳定性好，形成的药物复合物稳定。本发明提供的药物复合物(靶向药物)与肝癌细胞结合力强，能大大降低肝癌化疗中毒副作用，具有很高的应用价值。式(I)5’-(CG)n-核酸适体-3’。
文档编号C12Q1/02GK101942445SQ201010230219
公开日2011年1月12日 申请日期2010年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者刘晨, 方晓红, 谭蔚泓 申请人:谭蔚泓