专利名称：水稻rr17启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻RR17启动子及其应用，尤其涉及一种具有特异表达启动子 功能的DNA片段及其应用。
背景技术：
植物的根有两个主要的基本功能从土壤中吸收水份、营养和固定作用。通过对拟 南芥模式植物的研究，人们对调控拟南芥等双子叶植物根的遗传因子有了深入的了解。但 水稻等单子叶植物的根系与拟南芥有着本质的区别。双子叶植物的生命中起主要作用的是 由胚胎发育来的主根。而对于水稻，胚胎发育来的主根只在早期起到重要的作用，种子发芽 后的几个星期，茎生根将代替胚胎发育来的主根起主要作用。从起始的机制来讲，茎生根是 胚胎后发育来的，因此不能通过同源比对的方式从拟南芥中找到茎生根起始需要的基因。细胞分裂素是植物的五大经典激素之一，它调控了植物生长发育的各个方面。 主要通过对模式植物拟南芥的研究，对细胞分裂素信号转导途径已有了部分了解。细 胞分裂素的信号转导是由一种类似于细菌和酵母中的双元组份系统(two-component system)介导的，这个系统包括组氨酸激酶(Histidine Kinases, HKs)，磷酸转运蛋白 (Histidine-Phosphotransfer proteins, HPs)禾口反应调节因子(Response Regulators, RRs)。在模式植物拟南芥中，ARR(Arabidopsis Response Regulators)是双元组分系统 的最下游因子，也是其主要功能行使元件。现在已知的拟南芥ARR基因共有24个。根据 它们序列的相似程度，功能结构域以及对细胞分裂素的反应，可以将ARR大致分为三类即 A 型(10 个，包括 ARR3-ARR9, ARR15-ARR17)、B 型(12 个，包括 ARRl，ARR2, ARR10-ARR14， ARR18-ARR21 和 ARR23)以及非典型的 ARR22 和 ARR24。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有特异表达启动子功能的DNA片段及其应用。本发明提供的DNA片段(OsRRl7基因启动子OsRRl7p)，来源于水稻(Oryza sativaL. japonica. cv Nipponbare)，为如下 1)-3)中任一所述的 DNA 分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。序 列1由2455个核苷酸组成。上述严格条件可为在6 X SSC, 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。含有以上任一所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于 本发明的保护范围。所述重组载体具体为将0SRR17P插入在pC1300-GUS_N0S的PstI和SalI识别位 点间获得的重组载体，所述PC1300-GUS-N0S为将pBI121经SmaI和EcoRI酶切后得到的小片段插入PCAMBIA1300双元载体的SmaI和EcoRI识别位点得到的载体。扩增以上任一所述DNA片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对中的一条引物的序列为序列2，另一条引物的序列为序列3。上述DNA片段在使目的基因在植物茎基部节中的表达中的应用也是本发明保护 的范围。上述应用中，所述植物茎基部节为茎生根的起始部位。上述应用中，所述植物为单子叶植物。上述应用中，所述单子叶植物为水稻。上述DNA片段在植物的遗传育种中的应用也是本发明保护的范围。所述植物为单子叶植物；所述单子叶植物优选为水稻。本发明的实验证明，0sRR17基因启动子0sRR17p可以在水稻茎生根起始特异性表 达，可以用来研究及改善植物根系的发育和对不同土壤环境的适应，最终达到提高产量的 目的。对于一些易倒伏的水稻品种，也可以用茎生根特异性表达的启动子来调控抗倒伏基 因的表达，增加水稻的抗倒伏能力，然而对水稻的叶片和种子品质没有影响。启动子的发现 和其表达模式及功能的阐明，在植物发育调控和生物技术育种中均具有重要意义，为今后 在植物茎基部节中特异性表达外源基因提供了新型有效的启动子或顺式元件。本实验的研究结果表明细胞分裂素抑制了茎生根的起始，由于A型ARR基因家族 的功能特异性可能决定了细胞分裂素调控植物生长发育信号途径的专一性，因此通过检测 水稻细胞分裂素反应调节因子OsRR的时空表达模式，发现0sRR17是水稻茎基部节特异表 达的基因，因此从水稻中克隆出0sRR17基因的启动子，并通过⑶S报告基因检测了该启动 子的时空表达模式，发现该启动子在水稻茎生根起始的部位(即茎基部节)特异性表达，因 此该启动子将为植物代谢的精细调控和生物工程提供强有力的工具，具有重要的理论及现
眉、ο
图1为细胞分裂素抑制茎生根的起始图 2 为 OsRRl7 的 RT-PCR 结果图 3 为 pC1300_0SRR17p: GUS-NOS 质粒图谱图4为0sRR17p: :GUS转基因植物的GUS活性
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichia coli)株系 DH5a ；农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 EAH105 ；克隆载体 pGEM-T Easy 和连接 酶(Promega)；限制性内切酶(NEW ENGLAND BioLabs)；质粒 pBI121 (Clontech)，双元载体 pCAMBIA 1300 (Cambia,在T-DNA左右边界区内带有可供植物选择用潮霉素抗性基因)；水 fSnnft H^Hh (Oryza sativa L. japonica. cv Nipponbare)。实施例1、转0sRR17p水稻的构建
1、细胞分裂素抑制水稻茎生根的起始/K禾S 品禾中日本晴(Oryza sativa L. japonica. cv Nipponbare ；Fang J. , Chai C. , Qian Q. , Li C. , Tang J. , Sun L. , Huang Ζ. , Guo Χ. , Sun C. , Liu Μ. , Zhang Y. , Lu Q. , Wang Y. , Lu, C, Han B. , Chen F. , Cheng Ζ. , Chu C. (2008)Mutations of genes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to preharvest sprouting and photo-oxidation in rice,Plant Journal, 54 177-189.公众可从中国科院遗传与发育生 物学研究所获得。)用20%漂白水灭菌20分钟后，用无菌水冲洗3遍。然后在含有蔗 糖的V2MS培养基(Sigma-Aldrich公司，Cat# :M5524)上发芽，植物生长条件为28°C，连 续光照，光照强度为80-120阳ol ·πΓ2. sec—1。4天后观察茎生根的生长(图1A)。通过解剖 发现茎生根起始于茎基部的节(Basal node)(图IB)。当外源施加1 μ M的6-ΒΑ (—种常用 的人工合成细胞分裂素)，可见的茎生根明显减少(图1C)，在含有5μΜ 6-ΒΑ的V2MS培 养基上，完全观察不到茎生根(图1D)。为了检测细胞分裂素是否抑制了茎生根的起始，对 茎基部做了半薄切片。在没有细胞分裂素处理的水稻中，能够清晰可见茎生根的起始(图 IF和G中的红色箭头)，然而5 μ M细胞分裂素处理后，完全没有茎生根的起始(图1Η、I和 J)。图1为细胞分裂素抑制茎生根的起始，其中解剖图片中的标尺为0. 5mm，半薄切片中的 标尺为100 μ m。半薄切片水稻的茎基部固定在含有4%戊二醛的PBS过夜，用Leica historesin 包埋后，使用Leica RM6625切片机得到4 μ m的半薄切片，然后通过甲苯胺兰(0. 1% w/v) 染色，在光学显微镜(Olympus BX51)下观察。2、筛选在茎基部节中特异表达的细胞分裂素反应调节因子OsRR引物序列NameIDPrimer sequenceOsRRl7-F L0C_0s04g28120 AGTTCCTCGAAGCTGCAAGAGTGAOsRRl7-RL0C_0s04g28120 AGGCACTACATGACCATCACCACTRNA 提取TRIzol法参照厂商(Invitrogen)提供的使用说明进行。首先预冷研钵、研杵、 1. 5ml离心管和TRIzoI试剂。分别取水稻品种日本晴叶子、主根、侧根和茎基部节组织各 lOOmg，用液氮快速粉碎，转移至预冷的离心管。加入Iml TRIzol试剂，振荡混勻。室温放置 5分钟，4°C 12000g离心10分钟。取上清移入新离心管，加入200μ 1氯仿，轻摇混勻。室温 放置3分钟，4°C 12000g离心10分钟。取上层水相移入新管，加入250 μ 1异丙醇和250 μ 1 高盐沉淀剂(0. 8Μ柠檬酸钠，1. 2Μ氯化钠)，室温放置3分钟，4°C 12000g离心10分钟，去除 上清。沉淀用Iml 75%乙醇洗涤，4°C 7500g离心5分钟，去除上清。沉淀于室温干燥5_10 分钟，加入适量(50 μ 1左右)DEPC水溶解(为了有利于RNA溶解，可置于50°C水浴10-30 分钟)获得RNA。cDNA 反转录cDNA第一链的合成(1)取上述提取的RNA 1-2 μ g,加DEPC水至10 μ 1 ；(2)加入 1 μ 1 (0. 5g) Oligo (dT) 15 禾口 1 μ 1 IOmM dNTP,混勻；(3)65 °C，5分钟，然后放在冰上，快速加入5Xbuffer 4 μ 1，RNAseinhibitor 1 μ 1,0. IM DTT 2μ l,5U/y 1 反转录酶 H 0. 5 μ 1 ；(4)反转录反应(cDNA第一链合成)在PCR仪上进行，使用如下程序先42°C，50 分钟；再 45°C，10 分钟；再 50°C，10 分钟；再 70°C，15 分钟；(5)反应结束之后快速取出，冰上加入10mg/ml 1μ 1 RNase，然后在37°C放置 30-60分钟，获得cDNA。PCR 扩增PCR 反应体系(20μ 1)模板 DNA 1 μ 1 ； 10Xbuffer 2μ 1 ；2. 5mM dNTP 2μ 1 ； 10 μ M primers 2 μ 1 ；超纯水 12. 8μ 1 ； 5U/y 1 Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ 1。PCR扩增程序为先94°C预变性2min ；再94°C变性30s，58 °C退火30s，72 °C延长 lmin，循环数从22到34不等；然后再72°C延长IOmin ；4°C保存。所用PCR 仪型号为 Whatman Biometra T Gradient 96 禾口 MJ PTC-200。结果见图2，可以看出0SRR17p特异的在茎基部节中表达。3、转0SRR17p水稻的获得提取水稻日本晴幼苗的基因组DNA作为模板，用引物OsRRl7p_F (ctgcagGTGA ATCTCCATCCGTAGTTG,小写字母为 PstI 酶切位点，序列 2)和 0sRR17p-R (gtcgacGTGTCC TACCCTTTGAGCCA，小写字母为SalI酶切位点，序列3)PCR扩增，得到的PCR产物连接到 中间载体PGEM-T Easy上，获得pT_0sRRl7p，经测序，结果为该PCR产物具有序列表中 序列1的核苷酸，大小为2455bp，该PCR产物的基因命名为0sRR17p。同时，用SmaI和 EcoRI对pBI121 (Clontech)双酶切得到的小片段插入pCAMBIA1300 (Cambia)双元载体 的SmaI和EcoRI识别位点间得到pC1300-GUS_N0S。然后用PstI和SalI双酶切上述获 得的pT-0SRR17p得到的小片段插入pC1300-GUS-N0S的PstI和SalI识别位点间，得到 pC1300-0SRR17p: :GUS_N0S，其质粒结构模式如图3所示，其中35S_pro指35S CaMV启动子； Nos-ter为NOS终止子；Hygromycin为潮霉素筛选抗性基因；⑶S为E. coli β -葡萄糖苷酸 酶报告基因。将质粒pC1300-0SRR17p ⑶S-N0S 导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 菌株EAH105 (上海鼎国生物)中，再进行PCR鉴定，引物OsRRl7p_F和OsRRl7p-R，得到 大小为2455bp的片段为含有质粒pC1300-0SRR17p: GUS-NOS的农杆菌，命名为EAH105/ pC1300-0SRR17p: GUS-NOS ；再将 EAH105/pC1300_0SRR17p GUS-NOS 与野生型日本晴的愈 伤组织在共培养培养基上28°C共培养2天后，愈伤组织转移到含有50mg/l的潮霉素抗性筛 选培养基中，28°C暗培养14天后，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。经两轮筛 选后长出的抗性愈伤组织转至含有50mg/l潮霉素的分化培养基上，先暗培养3天，然后转 至15h光照条件下培养，30-40天后分化出小苗。将小苗移到生根培养基上培养两周左右移 土继续生长，此转化共获得5株TO代转0SRR17p:⑶S水稻。以上涉及的培养基配方如下(I)NB基本培养基 (2)水稻愈伤诱导及继代培养基 (3)共培养培养基 (4)抗性筛选培养基 (5)水稻分化培养基
(6)水稻生根培养基 5、鉴定经过抗性筛选，鉴定了 5株阳性TO代转0SRR17p:⑶S水稻。然后对上述获得的5 株阳性 TO 代转 0SRR17p: :GUS 水稻进行 PCR 鉴定，引物为 pl300F (5 ‘ATCGGTGCGGGCCTCTTC) 和 0sRR17p-R(5 ‘gtcgacGTGTCCTACCCTTTGAGCCA)，模板为 5 株阳性 TO 代转 0SRR17p: :GUS 水稻的叶的基因组DNA，得到PCR产物大小为2575bp为阳性植株，又将PCR产物测序分析， 具有序列表中序列1的核苷酸，因此进一步确认获得5株阳性TO代转0SRR17p:⑶S水稻。从阳性TO代转0SRR17p:⑶S水稻收获种子，播种后获得Tl代转0SRR17p:⑶S 水稻，从Tl代转0SRR17P:⑶S水稻上收获种子，播种后获得T2代转0SRR17p:⑶S水稻纯 合系，从T2代转0SRR17p:⑶S水稻上收获种子，播种后获得T3代转0SRR17p:⑶S水稻纯 合系。采用同样的方法将空载体pC1300-GUS-N0S导入野生型日本晴中，获得TO代转空 载体水稻，用上述同样的方法获得T3代转pC1300-GUS-N0S水稻。实施例2、转OSRRl7p:⑶S水稻⑶S染色分析⑶S染色把10天大小的日本晴和编号为5的T3代转0SRR17p:⑶S水稻纯合株 系的整个幼苗浸泡在⑶S染色液中37°C放置6-12小时，70%乙醇脱色后用体视镜(Olympus SZX12)进行拍照。以T3代转pC1300-GUS-N0S水稻水稻和野生型日本晴为对照。GUS 染色液IOOmM 磷酸缓冲液(pH 7. 0)，IOmM EDTA, ImM K4Fe6, ImM K3 (FeCN)6, 0. 1% (v/v) Triton X-100, ImM X-gluc。
结果如图4所示，通过对10天大小的T3代转0SRR17p:⑶S水稻的⑶S染色发现， 只有茎基部节能被GUS染色(图4A和B)；进一步徒手解剖发现GUS染色主要在节的下部， 即茎生根起始的部位(图4C)；当从节上分离一个茎生根时，分离下来茎生根起始部位是能 被⑶S染色的(图4D)。图4为转0sRR17p: :GUS植物的⑶S活性，其中箭头表示有⑶S活 性的部位。图中白色标尺为1mm。对野生型日本晴⑶S染色发现，植株各个组织器官均不能被⑶S染色。综合以上的结果，说明0sRR17的启动子能特异的在茎生根起始的部位中表达，并 调控了根的发育。实施例3、0sRR17启动子顺式作用元件的分析为了更好的了解OsRRl7的启动子功能，将OsRRl7的启动子OsRRl7p在PLACE (aDatabase of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements) ±JJ ζ#fflW析。表2 :0sRR17启动子顺式作用元件。
权利要求
DNA片段，为如下1) 3)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)中所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
2.含有权利要求1中所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.扩增权利要求1中所述DNA片段的引物对。
4.根据权利要求3所述的引物对，其特征在于所述引物对中的一条引物的序列为序 列2，另一条引物的序列为序列3。
5.权利要求1所述DNA片段在使目的基因在植物茎基部节中的表达中的应用。
6.根据权利要求5中所述的应用，其特征在于所述植物茎基部节为茎生根的起始部位。
7.根据权利要求5或6中所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物。
8.根据权利要求5-7中任一所述的应用，其特征在于所述单子叶植物为水稻。
9.权利要求1中所述DNA片段在植物的遗传育种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物；所述单子叶植 物优选为水稻。全文摘要
本发明公开了一种水稻RR17启动子及其应用。本发明提供的DNA片段，为如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明的实验证明，OsRR17基因启动子OsRR17p可以在水稻茎生根起始特异性表达可以用来研究及改善植物根系的发育和对不同土壤环境的适应，最终达到提高产量的目的。
文档编号C12N15/63GK101899442SQ20101023015
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月13日 优先权日2010年7月13日
发明者左建儒, 张健, 梁岩, 谢庆军 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所