专利名称：一种多级结构固定化酶的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种多级结构固定化酶的制备方法。该 方法将酶固定于氧化铝-氧化硅复合膜的介孔内，再进一步用介孔纳米粒子膜修饰氧化 铝-氧化硅复合膜表面阻止酶流失。该制备方法可获得高活性和高稳定性的固定化酶，具 有普适性。
背景技术：
固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有重要的应用。经过50多年 的研究和发展，酶固定化技术取得了长足的进步，先后开发了多种固定化方法和性能多样 的载体材料。它不仅能稳定酶、实现酶重复利用，而且可以改变酶的专一性、提高酶活力，使 之更符合人类要求。目前实验室研究和工业应用的酶固定方法主要有吸附法，共价偶联法，交联法，和 包埋法四大类。吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的弱相互作用而达到固定目的方 法。常用的载体有高岭土、硅胶、氧化铝、微孔玻璃等无机吸附剂和纤维素、胶原等有机吸附 剂。吸附法制备固定化酶操作简单，可以充分选择不同电荷和不同形状的载体，吸附过程可 能同时达到纯化和固定化。不足之处是由于酶和载体之间结合力不强，在高底物浓度和高 离子强度的工业应用条件下，酶流失问题严重，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；共 价偶联法是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联制备固定 化酶的方法。共价法优点是酶与载体之间的连接键很牢固，使用过程中不会发生酶的脱落， 稳定性较好。不足之处是载体的活化或者固定化操作比较复杂，反应条件也比较剧烈，所以 往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶；交联法即利用双功能或多功能试剂 在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化 酶的方法。常用的交联剂有戊二醛、已二酰亚氨酸二甲酯等。交联法操作简单，但交联反应 往往比较激烈，许多酶易在固定化过程中失效，酶回收率不高；包埋法是将聚合物的单体和 酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的 目的。常用的包埋材料有琼脂、海藻酸钙和丙烯酰胺凝胶等。包埋法均要求底物能自由进 入凝胶内与酶接触发生反应，产物能游离出凝胶，同时酶分子保留在凝胶内。此方法不足之 处是在化学聚合过程中由于自由基的产生、放热以及酶和试剂间可能发生化学反应等，往 往导致酶失活。由此可见，各种固定化酶方法有各自的优点和适合的应用体系，但它们仍然有很 大局限性。如何平衡酶的高活性和牢固的固定化之间的矛盾，一直是固定化酶在催化应用 中难以解决的科学问题之一。针对这个科学难点，我们提出了一种多级结构固定化酶的制 备方法，利用氧化铝_氧化硅_纳米粒子复合形成的多级结构将酶限制于载体的介孔内，同 时允许底物自由通过，酶的活性和稳定性得到最大保留；并且整体式的膜结构方便操作和 控制，适用于各种酶的固定化及催化应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多级结构固定化酶的制备方法，解决了固定化酶体系 中酶的高活性和稳定固定化难以兼得的问题。本发明的多级结构固定化酶的制备方法如下(1)氧化铝-氧化硅复合膜的制备将聚乙烯醚-聚丙烯醚_聚乙烯醚嵌段共聚物(P123)溶于10 60°C的盐酸，乙 醇(EtOH)和水的混合溶液。加入甲苯，搅拌0. 5 5小时，再逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)， 继续搅拌0. 5 5小时，得到氧化硅前体溶液。溶液的各物质摩尔比例为1TE0S 0. 006 0. 06P123 4 12H20 3 103Et0H 0. 001 0. 05HC1 0.01 0.5 甲苯。将阳极 氧化铝膜，浸渍于氧化硅前体溶液，真空条件下挥发0. 2 2小时，溶液形成粘状溶胶；取出 氧化铝膜，室温自然晶化。乙醇回流萃取膜中的嵌段共聚物P123，室温干燥。(2)酶的过滤吸附配制0. lmol/L的磷酸氢二钠和0. lmol/L的磷酸二氢钾溶液，以此配制pH 6 8 的缓冲溶液，或者配制0. lmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液和0. lmol/L盐酸溶液，以此配制 pH 8 9的缓冲溶液；将酶溶于上述两种缓冲溶液之一，配制0. 5 5mg/mL的酶溶液；将 氧化铝_氧化硅复合膜置于膜过滤装置，1 5mL酶溶液在50 IOOOPa压力下通过氧化 铝_氧化硅复合膜；(3)氧化铝-氧化硅-酶-介孔纳米粒子膜多级结构的制备a、将十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶于40 80°C去离子水，加入氨水，再逐滴加入 正硅酸乙酯，剧烈搅拌0. 5 3小时，再转移到水热反应釜中80 150°C晶化10 24小时； 溶液各物质的摩尔比例为1TE0S 0. 004 0. 08CTAB 10 40NH3 500 2000H20 ；所 得固体过滤分离，去离子水洗涤后在60 140°C下干燥；通过400 600°C，2 6小时焙 烧除去CTAB，得到介孔纳米粒子；b、将介孔纳米粒子先用异丙醇超声分散0. 5 2小时，再用水稀释，继续超声分 散0. 5 2小时；介孔纳米粒子悬浊液浓度为0. 4 4wt%，异丙醇和水质量比为1 1 1:5;C、将已经吸附酶的氧化铝-氧化硅复合膜在介孔纳米粒子悬浊液中垂直浸渍提 拉1 5次，每次浸渍1 10分钟，勻速提拉，室温自然干燥后进行下一次提拉，提拉速度 0. 01 0. 3cm/s。步骤(1)的氧化铝-氧化硅复合膜，介孔孔径均一，其大小5 12nm可调。步骤 ⑵中，所选择酶的尺寸应小于介孔孔径的尺寸，酶的固定化量为0. 5 3mg ；步骤(3)在氧 化铝_氧化硅复合膜的上下表面形成1 5 μ m的介孔纳米粒子膜。本发明的优点在于利用介孔氧化硅的高比表面和适合的孔尺寸，具有较高的酶 负载量；酶与氧化硅表面的弱相互作用不影响酶的活性，介孔纳米粒子膜的修饰作用可阻 止酶的流失；该固定化酶不仅具有良好的活性和操作稳定性，同时整体式的膜结构实现反 应的连续操作和产物的直接分离。
具体实施例方式实施例1
(1)氧化铝-氧化硅复合膜的制备将Ig聚乙烯醚-聚丙烯醚_聚乙烯醚嵌段共聚物(P123)室温下溶解于5g乙醇 和1. 2g，0. 2mol/L盐酸的混合液中，加入0. 03g甲苯，搅拌2小时。2. 08g正硅酸乙酯逐滴 加入溶液中，搅拌1小时得到氧化硅前体溶液。将47mm直径，200nm孔径的阳极氧化铝膜， 浸渍于氧化硅前体溶液，真空条件下挥发1小时。取出氧化铝膜，自然晶化1天。ISOmL乙 醇分三次回流24小时萃取嵌段共聚物P123。室温干燥。(2)血红蛋白的过滤吸附取5mL，0. lmol/L的磷酸氢二钠和90mL，0. lmol/L的磷酸二氢钾溶液，配制pH pH 6的缓冲溶液，以此配制2mg/mL的血红蛋白溶液。将氧化铝-氧化硅复合膜置于膜过滤装 置，3mL血红蛋白溶液在300Pa压力下通过氧化铝-氧化硅复合膜。血红蛋白酶的固定量为 3. Omg0(3)氧化铝_氧化硅_血红蛋白_介孔纳米粒子膜多级结构的制备a、将0. 25g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 80°C下溶于250mL去离子水，加入17mL 氨水，再逐滴加入2. 97g正硅酸乙酯，剧烈搅拌1小时，再转移到水热反应釜中100°C晶化 12小时。所得固体过滤分离，去离子水洗涤后在10(TC下干燥。通过550°C，4小时焙烧除 去CTAB，得到介孔纳米粒子。b、将300mg介孔纳米粒子先用3. 6g异丙醇超声分散1小时，再用14. 4g水稀释， 继续超声分散1小时。C、将已经吸附酶的氧化铝-氧化硅复合膜在介孔纳米粒子悬浊液中垂直浸渍提 拉2次，每次浸渍5分钟，由计算机控制勻速提拉，室温自然干燥后进行下一次提拉，提拉速 度 0.15cm/s。d、形成的纳米粒子膜约为2. 6 μ m。(4)性能测试将多级结构固定化血红蛋白进行流失性的测试。取60mL，0. lmol/L的磷酸氢二钠 和40mL，0. lmol/L的磷酸二氢钾溶液，配制pH 7的缓冲溶液。取3mL缓冲液在25°C，IkPa 压力下通过多级结构固定化血红蛋白，循环十次未发现任何流失。作为对比，未经过介孔 纳米粒子膜修饰的氧化铝-氧化硅复合膜，十次循环后约40%的血红蛋白流失。将多级结 构固定化血红蛋白进行活性测试，即催化氧化邻苯二胺，将3mL，6mmol/L底物溶液在25°C， IkPa压力下通过多级结构固定化血红蛋白，活性为0. Oeymol/min，循环十次，活性基本保 持不变。实施例2(1)氧化铝-氧化硅复合膜的制备将Ig聚乙烯醚-聚丙烯醚_聚乙烯醚嵌段共聚物(P123)室温下溶解于5g乙醇 和Ig, 0. 2mol/L盐酸的混合液中，加入0. 15g甲苯，搅拌2小时。2. 08g正硅酸乙酯逐滴加 入溶液中，搅拌1小时得到氧化硅前体溶液。将47mm直径，200nm孔径的阳极氧化铝膜，浸 渍于氧化硅前体溶液，真空条件下挥发1小时。取出氧化铝膜，自然晶化1天。ISOmL乙醇 分三次回流24小时萃取嵌段共聚物P123。室温干燥。(2)肌红蛋白的过滤吸附取10mL，0. lmol/L的磷酸氢二钠和90mL，0. lmol/L的磷酸二氢钾溶液，配制pH 6的缓冲溶液，以此配制2mg/mL的肌红蛋白溶液。将氧化铝-氧化硅复合膜置于膜过滤装 置，3mL肌红蛋白溶液在300Pa压力下通过氧化铝-氧化硅复合膜。肌红蛋白的固定量为 0. 7mg0(3)氧化铝_氧化硅_肌红蛋白_介孔纳米粒子膜多级结构的制备a、将0. 25g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 70°C下溶于250mL去离子水，加入20mL 氨水，温度升至80°C，逐滴加入2. 97g正硅酸乙酯，剧烈搅拌1小时，再转移到水热反应釜 中100°C晶化12小时。所得固体过滤分离，去离子水洗涤后在100°C下干燥。通过550°C， 4小时焙烧除去CTAB，得到介孔纳米粒子。b、将400mg介孔纳米粒子先用3. 6g异丙醇超声分散1小时，再用14. 4g水稀释， 继续超声分散1小时。C、将已经吸附酶的氧化铝-氧化硅复合膜在介孔纳米粒子悬浊液中垂直浸渍提 拉3次，每次浸渍5分钟，由计算机控制勻速提拉，室温自然干燥后进行下一次提拉，提拉速 度 0. 05cm/sod、形成的纳米粒子膜约为4 μ m。(4)性能测试将多级结构固定化肌红蛋白进行流失性的测试。取60mL，0. lmol/L的磷酸氢二钠 和40mL，0. lmol/L的磷酸二氢钾溶液，配制pH 7的缓冲溶液。作为对比，未经过介孔纳米 粒子膜修饰的氧化铝-氧化硅复合膜，十次循环后约40%的肌红蛋白流失。将多级结构固 定化肌红蛋白进行活性测试，即催化氧化邻苯二胺，将3mL，6mmol/L底物溶液在25°C，IkPa 压力下通过多级结构固定化血红蛋白，活性为0. 02 μ mol/min,循环十次，活性基本保持不 变。实施例3(1)氧化铝-氧化硅复合膜的制备将0. 687g聚乙烯醚-聚丙烯醚-聚乙烯醚嵌段共聚物(P123)室温下溶解于4. Sg 乙醇和1. 2g，0. 2mol/L盐酸的混合液中，加入0. Olg甲苯，搅拌2小时。2. 08g正硅酸乙酯 逐滴加入溶液中，搅拌1小时得到氧化硅前体溶液。将47mm直径，200nm孔径的阳极氧化铝 膜，浸渍于氧化硅前体溶液，真空条件下挥发1小时。取出氧化铝膜，自然晶化1天。ISOmL 乙醇分三次回流24小时萃取嵌段共聚物P123。室温干燥。(2)胰蛋白酶的过滤吸附取100mL，0. lmol/L的三羟基氨基甲烷和11.4mL，0. lmol/L的盐酸溶液，配制pH 9的缓冲溶液，以此配制lmg/mL的胰蛋白酶溶液。将氧化铝-氧化硅复合膜置于膜过滤装 置，5mL胰蛋白酶溶液在200Pa压力下通过氧化铝-氧化硅复合膜。胰蛋白酶的固定量为 2. 3mg0(3)氧化铝_氧化硅-胰蛋白酶-介孔纳米粒子膜多级结构的制备a、将0. 25g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 60°C下溶于250mL去离子水，加入17mL 氨水，温度升至80°C，逐滴加入2. 97g正硅酸乙酯，剧烈搅拌1小时，再转移到水热反应釜 中100°C晶化12小时。所得固体过滤分离，去离子水洗涤后在100°C下干燥。通过550°C， 4小时焙烧除去CTAB，得到介孔纳米粒子。b、将200mg介孔纳米粒子先用3. 6g异丙醇超声分散1小时，再用14. 4g水稀释，继续超声分散1小时。C、将已经吸附酶的氧化铝-氧化硅复合膜在介孔纳米粒子悬浊液中垂直浸渍提 拉3次，每次浸渍5分钟，由计算机控制勻速提拉，室温自然干燥后进行下一次提拉，提拉速 度 0. lcm/s。d、形成的纳米粒子膜约为4 μ m。(4)性能测试将多级结构固定化胰蛋白酶，进行活性和稳定性测试，即水解对甲苯磺基-L-精 氨酸甲酯盐酸盐(TAME)。取100mL，0. lmol/L的三羟基氨基甲烷和58. 4mL,0. lmol/L的盐酸 溶液，配制PH 8的缓冲溶液，以此配制5mmol/L的TAME溶液。取3mL的TAME溶液在25°C， IkPa压力下通过多级结构固定化胰蛋白酶，循环十次，活性基本保持不变，说明该固定化酶 具有良好的操作稳定性。当底物浓度小于1 μ mol/min时底物完全转化，实现了产物的直接 分离。
权利要求
一种多级结构固定化酶的制备方法，其特征在于，制备步骤为(1)氧化铝 氧化硅复合膜的制备将聚乙烯醚 聚丙烯醚 聚乙烯醚嵌段共聚物P123溶于10～60℃的盐酸，乙醇EtOH和水的混合溶液；加入甲苯，搅拌0.5～5小时，再逐滴加入正硅酸乙酯TEOS，继续搅拌0.5～5小时，得到氧化硅前体溶液；溶液的各物质摩尔比例为1TEOS∶0.006～0.06P123∶4～12H2O∶3～103EtOH∶0.001～0.05HCl∶0.01～0.5甲苯；将阳极氧化铝膜，浸渍于氧化硅前体溶液，真空条件下挥发0.2～2小时，溶液形成粘状溶胶；取出氧化铝膜，室温自然晶化；乙醇回流萃取膜中的嵌段共聚物P123，室温干燥；(2)酶的过滤吸附配制0.1mol/L的磷酸氢二钠和0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液，以此配制pH 6～8的缓冲溶液，或者配制0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液和0.1mol/L盐酸溶液，以此配制pH 8～9的缓冲溶液；将酶溶于上述两种缓冲溶液之一，配制0.5～5mg/mL的酶溶液；将氧化铝 氧化硅复合膜置于膜过滤装置，1～5mL酶溶液在50～1000Pa压力下通过氧化铝 氧化硅复合膜；(3)氧化铝 氧化硅 酶 介孔纳米粒子膜多级结构的制备a、将十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶于40～80℃去离子水，加入氨水，再逐滴加入正硅酸乙酯，剧烈搅拌0.5～3小时，再转移到水热反应釜中80～150℃晶化10～24小时；溶液各物质的摩尔比例为1TEOS∶0.004～0.08CTAB∶10～40NH3∶500～2000H2O；所得固体过滤分离，去离子水洗涤后在60～140℃下干燥；通过400～600℃，2～6小时焙烧除去CTAB，得到介孔纳米粒子；b、将介孔纳米粒子先用异丙醇超声分散0.5～2小时，再用水稀释，继续超声分散0.5～2小时；介孔纳米粒子悬浊液浓度为0.4～4wt％，异丙醇和水质量比为1∶1～1∶5；c、将已经吸附酶的氧化铝 氧化硅复合膜在介孔纳米粒子悬浊液中垂直浸渍提拉1～5次，每次浸渍1～10分钟，匀速提拉，室温自然干燥后进行下一次提拉，提拉速度0.01～0.3cm/s。
全文摘要
本发明涉及一种多级结构固定化酶的制备方法，属于生物工程技术领域。其制备方法包括(1)制备具有介孔结构的氧化铝-氧化硅复合膜；(2)通过过滤吸附，将酶固定于氧化铝-氧化硅复合膜；(3)在氧化铝-氧化硅复合膜表面修饰一层介孔纳米粒子膜，形成多级结构固定化酶。该方法由于制备条件温和，酶与载体靠物理作用吸附，酶能够保持高活性；介孔纳米粒子膜阻止酶的流失同时不影响底物的通过，使固定化酶具有良好的操作稳定性；同时该制备方法实现固定化酶的连续操作和产物直接分离。
文档编号C12N11/14GK101974509SQ20101028596
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者何静, 卢珊 申请人:北京化工大学