专利名称：一种胆红素氧化酶固体发酵方法
技术领域：
本发明涉及胆红素氧化酶的发酵，特别是一种胆红素氧化酶固体发酵方法。
背景技术：
胆红素氧化酶(Bilirubin oxidase, EC 1. 3. 3. 5)是一种含铜的多酚氧化酶， 能催化胆红素氧化，氧气是其电子受体。反应过程为胆红素氧化酶催化胆红素生成胆绿素， 后者可进一步氧化最终生成性质还不清楚的无色化合物。利用此反应，测定波长在440nm 或450nm处吸光值的下降，可以用于血清胆红素的测定。自从1981年日本学者发现漆斑菌 属能高产胆红素氧化酶后，临床医学中开始使用该酶来测定胆红素，该方法具有特异性、灵 敏高和操作简便等优点，适用于临床手工或自动化检测。胆红素氧化酶在临床中可用于诊 断黄疸水平，并有望用于新生儿黄疸及高胆红素血症的治疗。近年来，胆红素氧化酶的应用 逐渐拓宽，被用于生物电池的制造、污水处理等方面的研究和应用。由于胆红素氧化酶具有 广泛的用途，对于该酶的需求量也越来越大。但因为胆红素氧化酶生产发酵工艺复杂，成本 高，造成市场上销售的胆红素氧化酶价格昂贵，严重阻碍了胆红素氧化酶的应用，所以对胆 红素氧化酶发酵方法的研究以及如何提高产量成为酶生成产中迫切需要解决的问题。但现行的胆红素氧化酶生产多是采用液体深层发酵通气搅拌的方式获得，所用培 养基以PDB为主，其主要生产菌株是漆斑菌属。液体深层通气发酵需要对培养基进行高温 高压蒸汽消毒，之后对培养基进行降温后接入菌种，然后进行通气搅拌发酵。该方法蒸汽消 耗量大，搅拌和通气培养时间长，能耗高，并且发酵后污水排放量大。到目前为止，还未见到 关于胆红素氧化酶的固体发酵方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本低，生产过程简单，酶提取方便的胆红素氧化酶固体发 酵方法。本发明的技术方案是，一种胆红素氧化酶固体发酵方法，其特征在于(1)从土壤 中分离筛选出露湿漆斑菌，并制出露湿漆斑菌孢子悬浮液；(2)称取3-7重量份的麸皮置于 三角瓶中，然后加入13-17重量份的蒸馏水，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均勻，12广130°C 高压灭菌2(Γ30分钟，冷却后，接入用步骤(1)培养出的广5重量份的孢子悬浮液，在培养 温度为22°C 31°C，培养时间为疒11天后，取出培养后的三角瓶，在三角瓶中加入50-70重 量份的蒸馏水，用摇床振荡浸提2-4小时，用定性滤纸过滤即得胆红素氧化酶粗酶液。所述 步骤(1)中的露湿漆斑菌孢子悬浮液为将其接种在PDA斜面培养基上，培养10天左右，加 上一定量的无菌水，制成孢子量为IX 10^10 X IO8个/ml的露湿漆斑菌孢子悬浮液。所述 步骤(2)当中的13-17重量份的蒸馏水可以被12 18份浓度为0. Γ5毫摩尔/升铜离子。 溶液取代。固体培养基的麸皮，为经过40目筛所得。本发明所用原料来源丰富、易取，生产成本低，酶提取的工艺简便易行，生产过程 节能环保。
具体实施例方式
具体描述实施例
实施例1 麸皮从市场购买后过40目筛。称取3g麸皮置于250ml三角瓶中，然后加入
3蒸馏水13ml，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均勻，121°C高压灭菌20分钟，冷却后，接入Iml浓 度为IX 10^10X IO8个/ml的孢子悬浮液，22°C静置培养11天。取出培养11天后的三角 瓶，在三角瓶中加入50ml的蒸馏水，180r/min振荡浸提2. 5小时，用定性滤纸过滤即得胆红 素氧化酶粗酶液，其酶活力可达25. 4U/克。实施例2:麸皮从市场购买后过40目筛。称取7g麸皮置于250ml三角瓶中，然后 加入蒸馏水17ml，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均勻，125°C高压灭菌25分钟，冷却后，接入 5ml浓度为IX 10^10X IO8个/ml的孢子悬浮液，31°C静置培养7天。取出培养7天后的 三角瓶，在三角瓶中加入65ml的蒸馏水，180r/min振荡浸提3. 5小时，用定性滤纸过滤即得 胆红素氧化酶粗酶液，其酶活力可达26. 2U/克。实施例3:麸皮从市场购买后过40目筛。称取5g麸皮置于250ml三角瓶中，然后 加入蒸馏水15ml，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均勻，130°C高压灭菌30分钟，冷却后，接入 1.5ml浓度为IX IO8 10X IO8个/ml的孢子悬浮液，26°C静置培养9天。取出培养9天后 的三角瓶，在三角瓶中加入60ml的蒸馏水，180r/min振荡浸提3. 5小时，用定性滤纸过滤即 得胆红素氧化酶粗酶液，其酶活力可达27. 6U/克。实施例4:麸皮从市场购买后过40目筛。称取5g麸皮置于250ml三角瓶中，然后 加入12ml浓度为0. 1毫摩尔/升铜离子溶液(铜离子溶液为用分析纯的硫酸铜固体配制而 成)，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均勻，121°C高压灭菌20分钟，冷却后，接入1. 5ml浓度为 1 X IO8^lO X IO8个/ml的孢子悬浮液，22°C静置培养7天。取出培养7天后的三角瓶，在三 角瓶中加入50ml的蒸馏水，180r/min振荡浸提2. 5小时，用定性滤纸过滤即得胆红素氧化 酶粗酶液，其酶活力可达59. 7U/克。实施例5:麸皮从市场购买后过40目筛。称取5g麸皮置于250ml三角瓶中，然后 加入18ml浓度为4. 5毫摩尔/升铜离子溶液(铜离子溶液为用分析纯的硫酸铜固体配制 而成)，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均勻，130°C高压灭菌25分钟，冷却后，接入5ml浓度为 1 X IO8^lO X IO8个/ml的孢子悬浮液，26°C静置培养9天。取出培养9天后的三角瓶，在三 角瓶中加入60ml的蒸馏水，180r/min振荡浸提3. 5小时，用定性滤纸过滤即得胆红素氧化 酶粗酶液，其酶活力可达56. 7U/克。实施例6:麸皮从市场购买后过40目筛。称取7g麸皮置于250ml三角瓶中，然 后加入15ml浓度为5毫摩尔/升铜离子溶液(铜离子溶液为用分析纯的硫酸铜固体配制 而成)，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均勻，125°C高压灭菌25分钟，冷却后，接入4ml浓度为 1 X IO8^IOXIO8个/ml的孢子悬浮液，31°C静置培养11天。取出培养11天后的三角瓶，在 三角瓶中加入70ml的蒸馏水，180r/min振荡浸提4小时，用定性滤纸过滤即得胆红素氧化 酶粗酶液，其酶活力可达55. 4U/克。
权利要求
一种胆红素氧化酶固体发酵方法，其特征在于(1)从土壤中分离筛选出露湿漆斑菌，并制出露湿漆斑菌孢子悬浮液；(2)称取3 7重量份的麸皮置于三角瓶中，然后加入13 17重量份的蒸馏水，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均匀，121~130℃高压灭菌20~30分钟，冷却后，接入用步骤(1)培养出的1~5重量份的孢子悬浮液，在培养温度为22℃~31℃，培养时间为7~11天后，取出培养后的三角瓶，在三角瓶中加入50 70重量份的蒸馏水，用摇床振荡浸提2 4小时，用定性滤纸过滤即得胆红素氧化酶粗酶液。
2.如权利要求1所述的一种胆红素氧化酶固体发酵方法，其特征在于所述步骤(1)中 的露湿漆斑菌孢子悬浮液为将其接种在PDA斜面培养基上，培养10天左右，加上一定量的 无菌水，制成孢子量为IX 10^10 X IO8个/ml的露湿漆斑菌孢子悬浮液。
3.如权利要求1所述的一种胆红素氧化酶固体发酵方法，其特征在于所述步骤(2)当 中的13-17重量份的蒸馏水可以被12 18份浓度为0. Γ5毫摩尔/升铜离子溶液取代。
4.如权利要求1所述的一种胆红素氧化酶固体发酵方法，其特征在于固体培养基的 麸皮，为经过40目筛所得。
全文摘要
本发明公开了一种胆红素氧化酶固体发酵方法，本发明的目的是提供一种成本低，生产过程简单，酶提取方便的胆红素氧化酶固体发酵方法。(1)从土壤中分离筛选出露湿漆斑菌，并制出露湿漆斑菌孢子悬浮液；(2)称取3-7重量份的麸皮置于三角瓶中，然后加入13-17重量份的蒸馏水，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均匀，121~130℃高压灭菌20~30分钟，冷却后，接入用步骤(1)培养出的1~5重量份的孢子悬浮液，在培养温度为22℃~31℃，培养时间为7~11天后，取出培养后的三角瓶，在三角瓶中加入50-70重量份的蒸馏水，用摇床振荡浸提2-4小时，用定性滤纸过滤即得胆红素氧化酶粗酶液。本发明所用原料来源丰富、易取，生产成本低，酶提取的工艺简便易行，生产过程节能环保。
文档编号C12N9/02GK101974496SQ20101052989
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月3日 优先权日2010年11月3日
发明者刘友勋, 张煜, 石如玲, 赵春澎, 黄娟 申请人:新乡医学院