单链dna的不依赖模板的连接的制作方法

专利名称：单链dna的不依赖模板的连接的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于使用热稳定的RNA连接酶对单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA) 分子进行不依赖模板的分子内连接(例如，环化)、特别是用于在序列和/或大小未知的 ssDNA分子群体中的ssDNA分子的环化的改进的连接反应混合物和方法，以及由此的试剂盒，和试剂盒的使用方法和应用。
背景技术：
一直以来在本领域中知悉感染大肠杆菌的噬菌体T4RNA连接酶I (toll)具有不依赖模板的分子内连接活性(Gumport和Uhlenbeck，在Gene Amplification and Analysis(基因扩增与分析)，第 II 卷中Analysis of Nucleic Acid Structure by Enzymatic Methods (通过酶方法分析核酸结构)，Chirikjian和 Papas，编 Elsevier North Holland, Inc. ，1980 ；McCoy 禾口 Gumport，Biochemistry 19 :635-642,1980 ；Sugino，A 等人， J Biol Chem 252 1732-1738，1977)，但是这种活性太低并且对于从线性ssDNA分子中产生环状ssDNA分子的实际使用是无效的。不受理论束缚，这至少部分上可通过以下事实解释尽管T4RNA连接酶可使用ssDNA分子的5’ -磷酸化末端作为“连接供体”(或“供体”) 大致与ssRNA分子的5’ -磷酸化末端一样好，但ssDNA分子的3’ -羟基末端用作“连接受体”(或“受体”)远不如RNA的3’ -羟基末端有效。美国专利第7,303,901 号和 Blondal 等人(Nucleic Acids Res 33:135-142， 2005) ( 二者均通过引用并入本文)公开了源自栖热菌属噬菌体TS2U6的热稳定的RNA 连接酶，该酶感染嗜热细菌水管致黑栖热菌(Tgermus scotoductus) 0这种酶在本文也称为“噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶”或“噬菌体TS2U6RNA连接酶”或更简单地称为 "TS2126RNA连接酶”，对具有5’磷酰基和3’羟基的线性ssDNA以及ssRNA底物具有良好的不依赖模板的分子内连接活性。噬菌体TS2U6RNA连接酶的热稳定性显著高于嗜温RNA连接酶如T4RNA连接酶，在高达大约70°C是稳定的。TS2126RNA连接酶活性的温度范围可以大于约40°C，例如，从大约50°C到大约75°C。噬菌体TS2U6RNA连接酶增强的热稳定性允许其在对其他酶禁止的温度条件下使用。例如，由于TS2U6RNA连接酶的热稳定性，它可以在减少不期望的ssDNA或ssRNA 二级结构的较高温度下使用。这种酶已在THERM0PHAGE RNA 连接酶II或THERM0PHAGE ssDNA连接酶的商标名之下从Prokaria公司(Reyjkavik， Iceland)市售六年(到本专利申请的递交日期为止)，并且自2008年12月中旬在来自 Matis (www. mat is. is ；Reyjkavik, Iceland)的 Prokaria 品牌 THERM0PHAGE ssDNA 连接酶的商标名下出售。此外，雇佣本发明申请人的在美国威斯康辛州麦迪逊的公司EPICENTRE Biotechnologies自2004年在商标名CIRCLIGASE ssDNA连接酶之下出售噬菌体连接酶， 并且已投入相当大的努力来研究其特性、反应条件和使用。iTorchia, C 等人(Nucleic Acids Res 36 :6218-6227,2008)公开从嗜热古细菌获得的RNA连接酶(例如，嗜热自养甲烷杆菌RNA连接酶1或“Mthfoil”)在环化线性ssDNA 分子上具有不依赖模板的连接酶活性。使用不依赖模板的连接酶用于ssDNA分子的分子内不依赖模板的连接(即环化)的方法是本领域已知的。例如，美国专利申请第20060240451号公开了使用噬菌体 TS2126RNA连接酶连接由mRNA的5’端片段制备的线性第一链cDNA分子并随后通过滚环复制(RCR)或滚环转录(RCT)扩增环状第一链cDNA分子的方法。美国专利申请第20040197802号公开了包含5，端部分和3，端部分的正义启动子引物，其中该5’端部分显示正义RNA聚合酶启动子序列并且该3’端部分显示与生物样品中的靶核酸序列互补的序列。他们还公开了一种方法，包括通过使用噬菌体TS2U6RNA连接酶的不依赖模板的分子内连接使包含线性正义启动子的第一链cDNA环化。在一些实施方案中，该方法还包括产生环状转录底物并转录该环状转录底物。这种方法可用于扩增生物样品中的mRNA分子。Polidoros 等人(BioiTechniques 41 :35-39,2006)描述了使用不依赖模板的 T S2126RNA连接酶(CIRCLIGASE ssDNA连接酶(EPICENTRE Biotechnologies,Madison,WI, USA)作为在扩增cDNA末端用于随机扩增cDNA末端(RACE)的方法中的步骤。Gunderson KL和Meemers，F的美国专利申请第20080242560号公开了在包括如下步骤的方法中CIRCLIGASETMssDNA连接酶(EPICENTRE)的使用制备数字DNA球(例如， 在美国专利申请第20080M2560号中的图8)；和/或DNA诸如基因组DNA的基因座特异性切割和扩增，对于扩增包括通过多重置换扩增或全基因组扩增(例如，该专利申请中的图 17)或通过超分支RCA(例如，该专利申请中的

图18)以用于产生扩增的核酸阵列(例如， ILLUMINA BeadArrays ；ILLUMINA, San Diego CA, USA)。Drmanac 等人的美国专利申请第 20090011943 号；20090005252 号；20080318796 号；20080234136 号；20080213771 号；20070099208 号；和 20070072208 号公开了使用 CIRCLIGASE ssDNA连接酶(EPICENTRE)产生用于大规模平行的DNA测序的环状ssDNA 模板；例如，美国专利申请第20090011943号公开了连接反应混合物用于不依赖模板的连接(即环化)的用途，该连接反应混合物包含的终浓度如下每微升10单位CIRCLIGASE ssDNA连接酶，50mM M0PS，pH 7. 5, IOmM KCl, 5mMMgCl2, ImM DTT,25yM ATP, 1. 25mM MnCl2, 10% PEG4000以及每微升0. 5-10皮摩尔ssDNA。Nunez, AN 等人(Nunez, AN, Kavlick, MF, Robertson, JM,禾口 Budowle， B, " Application of Circular Ligase to Provide Template for Rolling Circle Amplification of Low Amounts of Fragmented DNA(应用环状连接酶提供模板以用于少量断裂DNA的滚环扩增)〃，第19届人类鉴识国际会议(19th International Symposium on Human Identification)，2008 年 10 月 13-16 日 Hollywood，California)还描述了使用在 http://www. promega. com/geneticidproc/ussympl9proc/oralpresentations/Nunez, pdf中的CIRCLIGASE ssDNA连接酶(EPICENTRE)产生的ssDNA分子的另一用途。联邦调查局的这些研究者公开了包括如下步骤的方法使降解的DNA样品变性以获得ssDNA片段； 用CIRCLIGASEssDNA连接酶连接该线性ssDNA片段以获得环状ssDNA片段；并随后使用简并引物和phi29DNA聚合酶通过RCA扩增该环状ssDNA片段。这种方法具有通过RCA机制对降解的DNA样品进行全基因组扩增(WGA)的潜力，可为受损的生物证据的法医分析或其他应用提供显著益处。研究人员发展了他们认为使线性ssDNA分子环化最适的条件并且为之前不能分型的降解的DNA样品的分型打下基础。然而，即使对于他们认为最适的反应条件，他们注意到连接的产物的量是可变的并且似乎依赖于序列，因为他们观察到具有连接的5’ G和3’ T的寡核苷酸在相同连接条件下显著好于其具有5’ A和3’ C的互补寡核苷酸。因此，尽管噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶(由Prokaria，Matis和Prokazyme， Reyjkavik, Iceland 在 THERMOPHAGE RNA 连接酶 II 或 THERMOPHAGE ssDNA 连接酶的商标名下销售，以及由 EPICENTRE Biotechnologies, Madison, Wisconsin, USA 在商标名 CIRCLIGASE ssDNA连接酶下销售)是已知用于ssDNA分子的不依赖模板的分子内连接的最有效的连接酶(基于本文讨论的引证和本申请人及其同事的个人观察)，在若干年中一个持久的直到现在都难以解决的问题是该酶对具有不同序列和大小的线性ssDNA分子的分子内连接效率不同。因此，本发明申请人及其在EPICENTRE的同事以及其他研究人员像以上讨论的Nimez等人观察到具有线性ssDNA底物的寡脱氧核糖核苷酸的十分不同的分子内连接水平，所述线性ssDNA底物的大小相同或非常相似，但具有甚至较小的核苷酸序列差异，或具有不同的大小，大小范围在小于100个碱基到数千碱基的多核苷酸。例如， 在一些情况中，即使寡脱氧核糖核苷酸序列的单个核苷酸差异也能导致分子内连接效率的大的差别。如果更高比例的不同线性ssDNA分子可以被分子内连接并且它们可被连接到相同的相对程度，那么将获得更好的实验结果并且可以作出更好的结论。因此，自从发现噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶，本领域非常需要的是允许更高水平的线性ssDNA 分子被分子内连接并且允全部的线性ssDNA分子在相同的相对程度上被分子内连接而不考虑其对应的核苷酸序列或大小的新的改进的连接方法、连接反应混合物和试剂盒。如果可以发现这种改进的连接方法、连接反应混合物和试剂盒，进一步需要的是利用改进的连接方法、连接反应混合物和试剂盒作出如下改进方法的新方法通过定量终点PCR或实时PCR来扩增用于基因表达分析的核酸分子方法，或通过与阵列或微阵列杂交或通过使用大规模DNA测序(即，所谓的“下一代” DNA测序)进行相对基因表达分析的方法， 或由Polidoros等人(以上讨论的)所述的RACE的方法，或通过Nunez等人(以上讨论的)所述的RCA-WGA进行的基因组DNA扩增方法，或由Gunderson KL和Meemers，F以及由Drmanac等人(均在以上讨论)所述的基因组DNA扩增(包括基因座特异性扩增) 和/或测序的方法，或利用ssDNA或得到的环状ssDNA分子的分子内连接的任何其他应用的方法。例如，其中利用CIRCLIGASEtmssDNA连接酶的一些其他应用和方法由Shroff， H 等人(Nano Letters 5 1509，2005 ；和 Biophysical Journal 94 :2179,2008) ；Lin, C 等人(Angewandte Chemie 118 :7699,2006) ；Korlach, J 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 :1176,2008) ；McArthur，M 和 Bibb，MJ (Proc. Natl. Acad. ki. USA 105 :1020,2008)；禾口 Kuhn，H 和 Frank-Kamenetskii，MD (Nucleic Acids Res 36:e40，2008)提供。允许更高效的分子内连接并且允许所有的ssDNA分子被分子内连接至相同的相对程度的新的改进的连接反应混合物、改进的连接反应条件和方法被需要并且将对所有这些方法有益。简而言之，需要的是允许使用热稳定的RNA连接酶诸如噬菌体TS2U6RNA连接酶对不同序列和大小的ssDNA分子的高水平和一致水平的分子内连接的改进的连接反应混合物和方法。本申请公开了解决这一长期存在的问题的新的改进的连接反应混合物和方法，以及利用这些新的改进的不依赖模板的分子内连接反应混合物和方法的新工艺。
发明概述本发明的一个实施方案是用于线性ssDNA分子的不依赖模板的分子内连接的连接反应混合物，该连接反应混合物包括(a)具有5，-磷酰基和3，-羟基基团的线性ssDNA分子；(b)热稳定的RNA连接酶分子的组合物，其中高比例的所述热稳定的RNA连接酶分子为腺苷酸化的并且其中在所述连接反应混合物中腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶分子的浓度等于或超过所述ssDNA分子的摩尔浓度；(c)将最终的pH保持在大约pH 6. 5至大约pH 8. 0之间的缓冲液；知(d)处于对热稳定的RNA连接酶最适的浓度的锰盐，其中在所述连接反应混合物中的Mn2+阳离子的终浓度在0. 5mM至大约IOmM ；其中，ATP在所述反应缓冲液中不存在，或者以比所述热稳定的RNA连接酶的非腺苷酸化形式的浓度小的摩尔浓度存在。在一些优选的实施方案中，没有向所述连接反应混合物添加ATP。在一些优选的实施方案中，所述连接反应混合物另外包括终浓度在0. 25M到2M的甜菜碱(两性离子的三甲基甘氨酸)。在一些优选的实施方案中，所述连接反应混合物中的甜菜碱的浓度为大约1M。在一些优选的实施方案中，没有向所述连接反应混合物添加Mg2+阳离子。本发明还包括使用所述改进的连接反应混合物用于线性ssDNA分子的不依赖模板的分子内连接来使用热稳定的RNA连接酶合成环状ssDNA分子的方法。例如，一种方法包括1.制备连接反应混合物，所述连接反应混合物包括(a)具有5’-磷酰基和3’-羟基基团的线性ssDNA分子；(b)热稳定的RNA连接酶分子的组合物，其中高比例的所述热稳定的RNA连接酶分子为腺苷酸化的并且其中在所述连接反应混合物中的腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶分子的浓度等于或超过所述ssDNA分子的摩尔浓度；(c)将最终的pH保持在大约pH 6. 5至大约pH 8. 0之间的缓冲液；和(d)处于对热稳定的RNA连接酶最适的浓度的锰盐，其中在所述连接反应混合物中的Mn2+阳离子的终浓度在0. 5mM至IOmM ；其中，ATP 在所述反应缓冲液中不存在，或者以比所述热稳定的RNA连接酶的非腺苷酸化形式的浓度小的摩尔浓度存在；和2.在大约40°C至大约70°C的反应温度孵育所述连接反应混合物中的线性ssDNA 分子持续足够的时间，其中合成了环状ssDNA分子。在所述方法的一些优选的实施方案中，没有向所述连接反应混合物添加ATP。在所述方法的一些优选的实施方案中，所述连接反应混合物另外包括终浓度在 0.25M到2M的甜菜碱(两性离子的三甲基甘氨酸)。在一些优选的实施方案中，所述连接反应混合物中的甜菜碱的浓度为大约1M。在所述方法的一些优选的实施方案中，没有向所述连接反应混合物添加Mg2+阳
1 子。在所述方法的一些优选的实施方案中，所述不依赖模板的热稳定的RNA连接酶选自由以下组成的组栖热菌属(Thermus)噬菌体RNA连接酶；噬菌体TS2U6RNA连接酶；古细菌RNA连接酶；嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautorophicum)RNA连接酶1。在一个优选的实施方案中，所述方法包括1.制备连接反应混合物，该连接反应混合物包括(a)具有5，-磷酰基和3，-羟基基团的线性ssDNA分子；(b)噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶的组合物，其中彡60%的所述热稳定的 RNA连接酶分子为腺苷酸化的并且以如下的量存在其中在所述连接反应混合物中的腺苷酸化的RNA连接酶分子的摩尔浓度等于或超过所述线性ssDNA分子的摩尔浓度(例如，所述腺苷酸化的RNA连接酶分子大约IyM的浓度，所述线性ssDNA分子大约0. 5μΜ的浓度)； 加(c)缓冲剂(例如，在该连接反应混合物中最终ρΗ为大约ρΗ7. 8的TRIS醋酸盐)；(d)提供大约0. 5mM至IOmM终浓度的Mn2+阳离子的锰盐(例如，终浓度大约2. 5mM 的Mn2+阳离子)；和2.在大约40°C到大约70°C的温度(例如，大约55°C到大约65°C ；例如大约60°C ) 孵育该连接反应混合物持续足够的时间，其中从该线性ssDNA分子产生环状ssDNA分子。在该方法的一些优选的实施方案中，所述连接反应混合物另外包含终浓度在0. 25M到2M的甜菜碱(两性离子的三甲基甘氨酸)。在任何上述方法的一些实施方案中，用于分子内连接的具有5 ’ -磷酰基和3 ’ -羟基基团的线性ssDNA分子包括线性ssDNA分子的群体，或由线性ssDNA分子的群体组成，其中5’端或3’端的核苷酸序列是未知的和/或其中该线性ssDNA分子大小不同。在所述方法的一些优选的实施方案中，分子内连接方法中使用的具有5’ -磷酰基和3，-羟基基团的线性ssDNA分子包括线性第一链cDNA分子的群体或由线性第一链cDNA 分子的群体组成，所述线性第一链cDNA分子是通过使用DNA聚合酶延伸与由生物样品中的一个或多个靶核酸分子展示的互补序列退火的一个或多个第一链cDNA合成引物而产生。在一些优选的实施方案中，通过延伸一个或多个第一链cDNA合成引物产生的所述线性第一链cDNA分子通过如下方式进一步纯化通过使用特异性消化所述靶核酸分子但不消化所述线性第一链cDNA分子的核酸酶除去所述靶核酸分子，或者通过将亲和标签掺入所述线性第一链cDNA分子中并使用与所述亲和标签形成特异性结合对的亲和性结合物质将所述线性第一链cDNA分子拉出，来从所述靶核酸分子中选择性纯化所述线性第一链cDNA分子，所述亲和性结合物质与表面相连。例如，在其中从生物样品中的RNA分子产生用于该方法的线性第一链cDNA分子的方法的一些实施方案中，特异性消化所述靶核酸分子但不消化所述线性第一链cDNA分子的核酸酶选自RNA酶H以及RNA酶I和RNA酶III 二者的组合。在其中从生物样品中的 DNA分子产生用于该方法的线性第一链cDNA分子的一些实施方案中，特异性消化所述靶核酸分子但不消化所述线性第一链cDNA分子的核酸酶是例如只特异性消化DNA靶核酸分子的单链特异性DNA酶。在包括将亲和标签掺入线性第一链cDNA分子并且使用亲和性结合物质将引物延伸产物拉出的方法的一些实施方案中，该亲和标签包括生物素部分(例如，与该第一链 cDNA分子中的一个或多个核苷酸连接的生物素部分)并且该亲和性结合物质包括与表面连接的链霉抗生物素蛋白。
在其中通过延伸一个或多个第一链cDNA合成引物制备用于分子内连接的线性 ssDNA分子的方法的一些优选的实施方案中，所述一个或多个第一链cDNA合成引物中的每一个包含包含如下标签或由如下标签组成的5’ -端部分，所述标签显示基本上不与靶核酸分子中的序列互补的序列；和显示与来自生物样品的至少一个靶核酸分子所显示的序列互补的序列的3’ -端部分；并且合成加标签的环状ssDNA分子。通过陈述“显示与来自生物样品的至少一个靶核酸分子所显示的序列互补的序列的3’ -端部分”，我们在此表示该 3’_端与该靶核酸分子本身所显示的序列或与连接至该生物样品的靶核酸分子的3’-端的序列互补(例如使用体外核酸修饰反应例如使用聚腺苷酸聚合酶添加到靶核酸分子的聚腺苷酸或其他同聚尾)。例如，在一些实施方案中，从生物样品中的目标核酸分子制备用于该方法的分子内连接的线性ssDNA分子，其中所述目标核酸分子已被修饰(例如，通过用聚核苷酸聚合酶对RNA的聚核苷酸加尾，或用末端脱氧核苷酸基转移酶对DNA的加尾，或衔接子寡核苷酸与目标DNA或RNA分子3’ -端的连接，或使用通过引用并入本文的美国专利申请第20050153333号或第20090227009号中公开的末端加标签方法添加3，-端序列到目标 DNA或RNA分子)。因此，该方法还包括在该方法中使用从已被修饰的生物样品核酸制备的线性ssDNA分子。在其中所述一个或多个第一链cDNA合成引物包括5’ -端部分中的标签或由 5’ -端部分中的标签组成的一些优选的实施方案中，该标签包括一个或多个标签域或者由一个或多个标签域组成，所述标签域选自由以下组成的组显示正义启动子序列的RNA聚合酶启动子标签域；切割位点标签域；测序仪特异性测序标签域；捕获标签域；扩增标签域；检测标签域；和地址标签域。第一链cDNA合成引物的5’ -端部分中的标签可包含任何期望的标签域并且可用于任何期望目的显示任何期望的序列。例如，在一些实施方案中，该5’部分包含如下标签 所述标签包含显示Roche 4FLX 54A和454B测序标签的序列的一个至多个测序标签域，并且在分离处于期望大小范围内的片段后，所述测序标签域用作利用Roche妨4基因组测序仪FLX系统的下一代的模板。类似地，在其他的实施方案中，5’和3’加标签的DNA片段， 在分离处于期望大小范围内的那些片段后，被用作使用另一测序平台的下一代的模板(例如，使用 ROCHE 妨4 测序平台、ILLUMINA SOLEXA 测序平台、LIFE TECHNOLOGIES/APPLIED BI0SYSTEMS 的 SOLID 测序平台、PACIFIC BIOSCIENCES 的 SMRT 测序平台、P0LL0NAT0R Polony 测序平台、COMPLETE GENOMICS 测序平台、INTELLIGENT BI0SYSTEMS 的测序平台、或 HELIC0S测序平台)。在一些优选的实施方案中，使用这种方法从包括细胞或生物的全基因组的靶DNA中产生5，和3，加标签的DNA片段。在一些实施方案中，在5’端用亲和性结合分子(例如，生物素)或用可检测的分子(例如，荧光染料)对测序标签进行标记，所述亲和性结合分子或可检测的分子允许用该亲和性结合分子或该可检测的分子对具有标签的5’和3’加标签的DNA片段进行捕获(例如，使用链霉抗生物素蛋白结合的表面捕获生物素化的分子)或检测。在其中该第一链cDNA合成引物的5’端部分包括含不同标签域的标签或者由含不同标签域的标签组成的方法的一些优选的实施方案中，一个或多个第一链cDNA合成引物各自包含在所述标签域之间的切割位点，并且该方法还包括如下步骤使该环状第一链 cDNA分子在切割位点处线性化以获得各自在5’端显示所述第一链cDNA合成引物的3’端部分的序列和在3’端显示所述第一链cDNA合成引物的5’端部分的序列的线性第一链cDNA 分子。例如，在一些实施方案中，切割位点包括一个或多个2'-脱氧尿苷一磷酸(dUMP) 部分或8-氧鸟嘌呤-2'-脱氧核糖基-一磷酸(8-氧-dGMP)部分或者由一个或多个 2'-脱氧尿苷一磷酸(dUMP)部分或8-氧鸟嘌呤-2'-脱氧核糖基-一磷酸(8-氧-dGMP) 部分组成，并且使环状第一链cDNA分子在该切割位点处线性化以产生各自在5’端显示所述第一链cDNA合成引物的3’端部分的序列和在3’端显示所述第一链cDNA合成引物的5’ 端部分的序列的线性第一链cDNA分子的步骤包括使该环状第一链cDNA分子分别与尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG ；EPICENTRE)或8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(Fpg ；EPICENTRE)接触，产生包含一个或多个无碱基位点的环状第一链cDNA分子，并随后孵育该包含一个或多个无碱基位点的环状第一链cDNA分子，所述孵育是在其中环状第一链cDNA分子在该无碱基化位点处或在该无碱基化位点附近被线性化的条件下诸如通过在碱性溶液或在包含内切核酸酶如内切核酸酶IV的溶液中孵育而进行。在所述方法的一些优选的实施方案中，第一链cDNA合成引物包括在5’端部分中的标签或由在5’端部分中的标签组成，所述标签包括两个测序仪特异性测序标签域或由两个测序仪特异性测序标签域组成，并且使环状第一链cDNA分子在该切割位点处线性化以产生各自在5’端显示所述第一链cDNA合成引物的3’端部分的序列和在3’端显示所述第一链cDNA合成引物的5’端部分的序列的线性第一链cDNA分子的步骤产生在5’端和3’ 端各具有一个测序标签域的线性ssDNA测序模板(例如，加双标签的测序模板)。在一些优选的实施方案中，所述在5’端和3’端各具有一个测序标签域的线性ssDNA测序模板用作针对所述测序标签域的下一代测序仪上测序的模板。在包括使环状第一链cDNA分子在切割位点线性化的方法的一些优选的实施方案中，所述第一链cDNA合成引物的5’端部分包括如下标签或由如下标签组成所述标签包含显示正义启动子序列的RNA聚合酶启动子标签域和位于该正义启动子序列3’的切割位点， 并且在使该环状第一链cDNA分子在该切割位点线性化的步骤后，该方法还包括如下子步骤(i)使显示反义启动子序列的寡脱氧核糖核苷酸与从所述线性化产生的每个线性第一链cDNA分子3’端的正义启动子序列退火以产生转录底物；并随后(ii)使用结合双链RNA 聚合酶启动子并由此启动转录的RNA聚合酶转录该转录底物。在所述方法的一些优选的实施方案中，在转录该转录底物的子步骤之前，所述方法还包括通过使用DNA聚合酶延伸显示反义启动子序列的所述寡脱氧核糖核苷酸产生双链cDNA的子步骤。附图简述下面的图形成本说明书的一部分并且被包括来进一步展示本发明的某些方面。通过结合本文提供的具体实施方案的详述参考这些图中的一个或多个，可以更好地理解本发明。图1显示从噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶(也称为CIRCLIGASE ssDNA连接酶，EPICENTRE)的新克隆获得的纯化蛋白的SDS-PAGE凝胶，相比于从旧克隆获得的 TS2U6RNA连接酶的纯化制备物中的腺苷酸化的酶的水平(估计约30% )，该新克隆显示预想不到的高水平的TS2U6RNA连接酶的腺苷酸化形式(估计约70% )。蛋白样品被变性、还原并且被10% SDS-PAGE分辨。蛋白通过银染色显影。泳道1显示分子量标准品(97、66、45、30、20. 1、14. 4kDa)。泳道2显示CIRCLIGASE。空心三角指示腺苷酸化的酶。实心三角指示非腺苷酸化的酶。图2显示使用所比较的新克隆获得的高腺苷酸化的TS2U6RNA连接酶(也称为 CIRCLIGASE ssDNA连接酶)和使用旧克隆获得的低腺苷酸化的酶的分子内连接活性的 PAGE分析。预想不到地，高腺苷酸化的酶在标准连接反应混合物中的线性ssDNA的分子内连接上的活性比低腺苷酸化的酶小得多。1 μ g的每种CIRCLIGASE酶用于在如下标准连接反应条件下连接与CIRCLIGASE ssDNA连接酶(EPICENTRE) —起供应的10皮摩尔55-核苷酸的对照寡核苷酸(50mM MOPS pH 7. 5, IOmM KCl,5mM MgCl2，ImM DTT,2. 5mM MnCl2, 禾口 50 μ M ATP在60°C持续1小时)。通过添加终止/上样缓冲液(95%甲酰胺，IOmM EDTA, 0. 01%二甲苯蓝，0.01%溴酚蓝)并且在70°C加热5min终止反应。反应产物在含8M尿素的20%聚丙烯酰胺凝胶中分辨并且通过SYBR 金染色来显影。泳道1，LMW DNA大小标准品(核苷酸)(97、77、50、40、35、30、25、20、15)；泳道 2，无 CIRCLIGASE 阴性对照；泳道 3，来自旧克隆的CIRCLIGASE ；泳道4，来自新克隆的CIRCLIGASE (第1批次)；泳道5，来自新克隆的CIRCLIGASE (第2批次)；以及泳道6，LMW DNA大小标准品。图3显示在连接反应混合物中存在和不存在ATP的情况下高腺苷酸化的 TS2126RNA连接酶(CIRCLIGASE )的分子内连接活性的PAGE分析。出人意料地，当ATP没有用在连接反应混合物中时高腺苷酸化的酶的活性大得多。外切核酸酶I (Exo I)消化线性ssDNA但不消化环状ssDNA。在60°C孵育1小时后，终止反应，并且根据指示，将反应与 20U的外切核酸酶I在37°C孵育15min。通过添加终止/上样缓冲液并且在70°C加热5min 终止反应。反应产物在含8M尿素的20% PAGE凝胶中分辨并且用SYBR 金染色。泳道1， LMW DNA大小标准品(97、77、50、40、35、30、25、20、15个核苷酸)；泳道2_3，无酶对照；泳道 4-5，具有50 μ M ATP的高腺苷酸化的CIRCLIGASEssDNA连接酶；泳道6_7，没有ATP的高腺苷酸化的CIRCLIGASEssDNA连接酶；泳道8，LMW DNA大小标准品。图4是显示来自新克隆的高腺苷酸化的TS2U6RNA连接酶(CIRCLIGASE )在连接反应混合物中存在和不存在ATP的情况下对多种线性ssDNA底物的分子内连接活性相比于来自旧克隆的低腺苷酸化的酶在标准连接反应混合物中对相同线性ssDNA底物的分子内连接活性的PAGE分析结果的表。这些结果显示，在连接反应混合物中不存在ATP的情况下，高腺苷酸化的TS2U6RNA连接酶有效地环化许多不被标准连接反应混合物中的低腺苷酸化的酶连接或被其低效连接的线性ssDNA底物。用高腺苷酸化的酶产生的这些改进的分子内连接结果显示之前分子内连接较差或根本不能连接的某些底物可被连接，这鼓励申请人继续测试另外的连接反应条件以便更进一步改进结果。图5显示在连接反应混合物中使用Mn2+阳离子改进高腺苷酸化的TS2U6RNA连接酶(CIRCLIGASE )在不存在ATP的情况下对非常难以连接的线性ssDNA底物的分子内连接活性。注意，当添加Mn2+阳离子时，用于标准连接反应混合物中的Mg2+阳离子没有添加到连接反应混合物中。1 μ g的高腺苷酸化的CIRCLIGASETMssDNA连接酶与10皮摩尔线性 pYRTP. 5ssDNA 底物在 33mM Tris 醋酸盐 pH 7. 6、66mM K0Ac、0. 5mMDTT 和 0、1、2、5 或 IOmM 皿11(12或1%((^(3)2中在60°C下孵育1小时。然后，用18U的外切核酸酶I和20U的外切核酸酶III处理一部分连接反应混合物以降解未连接的线性底物。环状ssDNA连接产物在含 8M尿素的20%聚丙烯酰胺凝胶中分辨并且通过SYBR 金染色来显影。通过目视检查估计耐外切核酸酶的环状ssDNA连接产物的量。图6显示在将IM两性离子的三甲基甘氨酸(甜菜碱)加入至包含Mn2+阳离子 (为2. 5mM MnCl2)但没有ATP和添加的Mg2+阳离子的连接反应混合物时，高腺苷酸化的 TS2U6RNA连接酶(CIRCLIGASE )在环化非常难以连接的线性ssDNA底物上的分子内连接活性的PAGE分析。出人意料且预想不到的是，甜菜碱添加至连接反应混合物导致这种非常难以连接的线性ssDNA底物的近似100%的环化，相比之下，在标准连接反应混合物中的低腺苷酸化的酶对这种底物产生彡5%的环化。1 μ g的高腺苷酸化的CIRCLIGASETMssDNA连接酶与10皮摩尔线性pYRTP. 5ssDNA底物在33mM Tris醋酸盐pH 7. 6、66mM KOAc,0. 5mM DTT和2. 5mMMnC12中在有或没有IM甜菜碱的情况下在60°C下孵育16小时。然后，用18U 的外切核酸酶I和20U的外切核酸酶III处理一部分连接反应混合物以降解未连接的线性底物(泳道1和泳道4)。环状ssDNA连接产物在含8M尿素的20%聚丙烯酰胺凝胶中分辨并且通过SYBR 金染色来显影。通过目视检查估计耐外切核酸酶的环状ssDNA连接产物的量。泳道1-2，无酶阴性对照；泳道3-4，加IM甜菜碱；泳道5，LMW DNA大小标准品。图7显示在含有IM甜菜碱的改进的连接反应混合物中，高腺苷酸化的TS2U6RNA 连接酶(CIRCLIGASE )在环化Alu I消化的小牛胸腺ssDNA片段上的分子内连接活性的 PAGE分析。该结果指示，对于高达约6000个核苷酸的线性ssDNA片段，似乎不存在基于大小或序列组成的总底物偏倚。200ng变性Alu I消化的小牛胸腺DNA在由33mM Tris醋酸盐 pH 7. 6、66mM K0Ac、0. 5mM DTT、2. 5mM MnC12、IM 甜菜碱和 1 μ g、2 μ g 或 4 μ g 的高腺苷酸化的CIRCLIGASETMssDNA连接酶组成的改进的连接反应混合物中在60°C下16小时并且用18U的外切核酸酶I和20U的外切核酸酶III处理以降解线性ssDNA底物。反应产物在含8M尿素的20%聚丙烯酰胺凝胶中分辨并且通过SYBR 金染色来显影。泳道1，LMWDNA 大小标准品；泳道2-3，无CIRCLIGASE阴性对照；泳道4-5,1 μ gCIRCLIGASE ；泳道6-7,2 μ g CIRCLIGASE ；泳道8_9，4 μ g CIRCLIGASE ；泳道10，Kb阶梯DNA大小标准。外切核酸酶被添加至泳道3、5、7和9。应注意，CIRCLIGASE预期在不存在ATP的情况下以化学计算的方式起作用；因此，200ng输入量的变性断裂的ssDNA中只有10%被环化并不奇怪。定义除非在本文别处具体限定或不同地描述，否则以下与本发明有关的术语和描述应按照下面给出的来理解。当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该” 和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在权利要求的上下文中)使用应被解释成涵
盖单数和复数。本文的“亲和性结合物质”或“亲和性结合分子”或“亲和性分子”或“亲和标签” 表示对于彼此具有亲和力并且在称为“结合条件”的某些条件下彼此“结合”形成“特异性结合对”的分子。例如，生物素和链霉抗生物素蛋白，生物素和抗生物素蛋白，或者洋地黄毒苷和结合洋地黄毒苷的特异性抗体是“特异性结合对”的实例，其中每个特异性结合对的成员包括“亲和性结合分子”或“亲和性结合物质”或“亲和性分子”。可使用本领域已知的方法将亲和性结合分子(例如，生物素和/或链霉抗生物素蛋白)与其他分子(例如，与RNA或DNA)或与固体表面共价地连接或轭合，或非共价地结合(例如，使用D. Savage等人，Pierce Chemical Company, 1992 的 Avidin-Biotin Chemistry A Handbook(抗生物素蛋白-生物素化学手册)和在 R. P. Hoagland，Molecular Probes, Inc.的 Handbook of Fluorescent Probes and Research Products (荧光探针和研究产物手册)，第九版，以及在 Academic Press, Inc.，San Diego, CA, 1996 出版的 Greg Τ. Hermanson 的 BIOCONJUGATE Techniques (生物轭合技术)中所述的试剂和方法)。与DNA或RNA轭合的亲和性分子也可以使用寡核苷酸合成仪使用本领域中已知的试剂和方法来合成。根据本发明的术语“结合”表示由于非共价键造成的亲和性分子和亲和性结合物质之间的相互作用，所述非共价键诸如但不限于氢键、疏水相互作用、范德华键和离子键。 不希望受理论限制，在本领域中相信这些种类的非共价键导致结合，部分上是由于特异性结合对中包含的分子的互补形状或结构。基于“结合”的定义和种类繁多的亲和性结合分子或特异性结合对，很显然结合条件对于不同的特异性结合对是不同的。本领域技术人员可容易地发现或确定样品中在亲和性结合分子之间发生结合所凭借的条件。具体而言，本领域技术人员可容易地确定可使本领域中被认为是“特异性结合”的亲和性结合分子之间的结合发生所凭借的条件。如本领域中所了解的，这种特异性通常是由于在亲和性结合分子之间的亲和性比对样品中的其他物质和组分(例如，容器壁、固体支持体)的亲和性高。 在某些情况下，特异性还可能包括或可能由于，亲和性结合分子的缔合比与样品中的其他物质或组分的缔合显著更快。本文的术语“扩增核酸”表示增加核酸序列或其互补序列的拷贝数。扩增的核酸可以是包含DNA或RNA或DNA和RNA的混合物、由DNA或RNA或DNA和RNA的混合物组成的、或者衍生自DNA或RNA或DNA和RNA的混合物的DNA，包括修饰的DNA和/或RNA。从一种或多种核酸分子的扩增产生的产物(即“扩增产物”)可以是DNA或RNA，DNA和RNA核苷或核苷酸的混合物，而不论起始核酸是DNA、RNA或是DNA和RNA 二者，或者这些产物可以包括修饰的DNA或RNA核苷或核苷酸。“拷贝”不一定表示对靶序列的完美序列互补性或同一性。例如，拷贝可包括核苷酸类似物诸如脱氧肌苷或脱氧尿苷，有意的序列变更(诸如通过包含可与靶序列杂交但不互补的序列的引物和/或扩增过程中出现的序列错误引入的序列变更。如本文所用，在提到核酸或核酸反应时使用的术语“扩增，，或“扩增的”、“扩增了，， 是指制备特定核酸诸如靶核酸或例如按照本发明的实施方案产生的加标签的核酸的拷贝的体外方法。扩增核酸的许多方法是本领域已知的，并且扩增反应包括聚合酶链反应、连接酶链反应、链置换扩增反应、滚环扩增反应、转录介导的扩增方法诸如NASBA(例如，美国专利第5，409，818号)、环介导的扩增方法(例如，使用成环序列的“LAMP”扩增，例如，在美国专利第6，410，278号中所述)。术语“使退火”或“使杂交”以及“退火”或“杂交”是指具有经由沃森-克里克碱基配对形成复合物的充分互补性的核苷酸序列之间形成复合物。就本发明来说，彼此之间 “对其互补”或“与之互补”或与其“杂交”或“退火”的核酸序列应该能形成或形成服务于预定目的的足够稳定的“杂交体”或“复合物”。杂交或退火以及杂交强度(即，核酸链之间的缔合强度)受本领域中公知的许多因素影响，包括在核酸之间的互补性程度，受诸如盐浓度影响的所涉及的条件的严格度，形成的杂交体的Tm (解链温度)，其他组分的存在(例如，存在或不存在聚乙二醇或甜菜碱)，杂交链的摩尔浓度以及核酸链的G:C含量。在一些实施方案中，“cDNA”或“cDNA分子”是指使用感兴趣的RNA分子的至少一部分作为模板通过RNA依赖性DNA聚合酶或反转录酶催化的与该感兴趣的一种或多种RNA 分子退火的引物的延伸而合成的“互补的DNA”’(该过程也称为“反转录”)。在所述方法的一些优选的实施方案中，通过使用反转录酶和从生物样品获得作为模板的感兴趣的RNA分子诸如信使RNA(mRNA)分子的反转录合成第一链cDNA分子，并且该第一链cDNA分子与该 mRNA互补。在一些实施方案中，“第一链cDNA分子”是指通过任何感兴趣的RNA分子的反转录而合成的cDNA分子，即使该感兴趣的RNA分子不是mRNA。在一些实施方案中，使用术语“第一链cDNA合成引物”和“第一链cDNA分子”，即使没有使用第二链cDNA合成引物并且没有合成第二链cDNA分子；因此即使在所述方法导致只合成与所述感兴趣的RNA分子互补的单链cDNA时也使用术语“第一链cDNA”或“第一链cDNA分子”。更进一步，在一些实施方案中，本文的术语“cDNA”是指使用感兴趣的DNA分子的至少一部分作为模板通过DNA 聚合酶催化的与一种或多种该感兴趣的DNA分子退火的引物的延伸而合成的互补DNA。所合成的cDNA分子与该模板的至少一部分“同源”或“碱基配对”或“形成复合物”。如本文所用，“DNA聚合酶”是指催化脱氧核糖核苷酸聚合成DNA链的酶。“依赖 DNA的DNA聚合酶”是通过延伸与DNA模板退火的引物来合成互补的DNA( “cDNA”)拷贝的酶。一些依赖DNA的DNA聚合酶还可以从RNA模板合成互补的DNA拷贝，这一过程也称为 “反转录”。可反转录的DNA聚合酶也可以称为“反转录酶”。除了合成DNA聚合物外，DNA聚合酶可包括其他特征或活性。例如，DNA聚合酶可具有或缺乏5’到3’外切核酸酶活性(也称为5’外切核酸酶或5’核酸酶活性)，3’到5’ 外切核酸酶活性，链置换活性，并且可以就它们持续(processive)的程度对其进行表征。 在一些实施方案中，使用缺乏5’到3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。例如，在一些实施方案中，缺乏5’到3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶组合物用于DNA测序。例如，在一些其他实施方案中，缺乏5’到3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶组合物用于全基因组扩增。一些DNA聚合酶能够将与模板链互补的链置换为由该聚合酶合成的新DNA链。这一过程称为“链置换”并且具有这种活性的DNA聚合酶在本文称为“链置换DNA聚合酶”。 用于链置换DNA合成的模板可以是线性或环状的单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)。如果DNA模板是单链环，那么引发的DNA合成绕该环一圈又一圈进行，链的连续置换早于复制链，这一过程称为“滚环复制”。滚环复制导致环状模板的串联拷贝的合成。一般来说， 优选的是，用于本发明的方法的DNA模板特异性DNA聚合酶有效率地合成具有适合长度的 DNA用于预定目的而不从模板上“脱落”(或终止DNA的合成)，这称为酶的持续合成能力 (processivity)。DNA聚合酶的链置换能力可使用该聚合酶在由Fire和Xu(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :4641-4645,1995)所述的滚换复制测定中容易地确定。链置换和DNA聚合酶持续合成能力还可以使用Kong等人(J. Biol. Chem. 268 1965-1975，1993)描述的方法来测定。可使用的链置换DNA聚合酶的实例包括但不限于R印1 iPHI phi29DNA聚合酶、 DisplaceAce DNA 聚合酶、rGka DNA 聚合酶、kquiThermTMDNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、 Tfl DNA 聚合酶、和 MMLV 反转录酶(全部可从 EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI, USA获得)。在一些实施方案中，缺乏3’到5’外切核酸酶校正活性的DNA聚合酶与具有这种活性的DNA聚合酶诸如FAILSAFE DNA聚合酶的掺合物用作链置换DNA聚合酶。酶掺合物在一些实施方案中是有用的，因为它在DNA合成过程中显示改善的保真度(S卩，它合成具有较少的不与模板互补的核苷酸的DNA)。许多DNA聚合酶在特定条件下的保真度和/或错误率是已知的，测量保真度的方法(例如，通过测序)也是已知的。—般来说，在本发明的链置换扩增方法中期望该方法中使用的链置换DNA聚合酶的量尽可能高但不抑制或不利地影响反应。例如，REPLIPHI phi29DNA聚合酶(EPICENTRE) 在20微升反应中能够以大约一微克蛋白使用，并且DISPLACE DNA聚合酶(EPICENTRE)在 50微升反应中能够以大约50单位到大约300单位使用。因为单位的定义对于不同的DNA 聚合酶以及甚至对于不同卖家或来源的相似DNA聚合酶来说都是不同的，并且还因为每种酶的活性在不同的温度以及在不同的反应条件下是不同的，所以期望针对使用的每种DNA 模板和引物优化链置换DNA聚合酶的量以及反应条件。“核酸”或“多核苷酸”表示包含一系列也称为“核苷”的“单核苷”的聚合物分子， 其中一个核苷的戊糖的3’位置通过核苷间连接诸如但不限于磷酸二酯键与下一个核苷的戊糖的5’位置相连接。与磷酸基团相连接的核苷称为“核苷酸”。与该系列中的下一个核苷酸的5’位置连接的核苷酸称为“5’的”或“5’核苷酸”，而与该5’核苷酸的3’位置连接的核苷酸称为“3’的”或“3’核苷酸”。如本文所用，术语“5’ -”和“3’ -”是指在核酸单链内特定的化学基团、核苷酸、核苷酸的序列或遗传元件(例如，RNA聚合酶启动子序列)相对于另一个化学基团、核苷酸、核苷酸的序列或遗传元件的位置或方向。如果在一条链上第一核酸序列在第二序列的3’ _，那么在互补链上该第一序列的互补序列将在该第二序列的互补序列的5’。本发明的描述将根据特定的核酸链内序列或遗传元件的相对5’或3’位置和方向来理解。称线性核酸分子具有“5’ -末端”(5’ -端)和“3’ -末端”(3’ -端)，因为核酸的磷酸二酯连接在取代的单核苷酸的糖部分的5’碳和3’碳处出现。将与5’碳连接的新连接之处的多核苷酸的末端是其5’末端核苷酸。将与3’碳连接的新连接之处的多核苷酸的末端是其3’末端核苷酸。如本文所用的末端核苷酸是在3’末端或5’末端的端位置的核苷酸。核酸的戊糖可以是核糖，在这种情况下，核酸或多核苷酸被称为“RNA”，或者核酸的戊糖可以是2'-脱氧核糖，在这种情况下，核酸或多核苷酸被称为“DNA”。可选地，特别是如果核酸以化学方式合成，那么核酸可由DNA单核苷酸和RNA单核苷酸组成。在RNA和 DNA中，每种戊糖被共价地连接至四种常见的或“规范的”核酸碱基(每种也称为“碱基”) 之一。与糖连接的主要的天然存在的碱基中的三种(腺嘌呤、胞苷和鸟嘌呤)对于DNA和 RNA是共同的，而一种碱基是不同的；DNA具有额外的碱基胸腺嘧啶，而RNA具有额外的碱基尿苷。在一些情况下，尿苷可作为DNA中的碱基存在。本领域技术人员通常将小的多核苷酸看作“寡核苷酸”。将如本文所用的术语“寡核苷酸”定义为包含两个或更多个脱氧核糖核苷酸(在这种情况下，可将其称为“寡脱氧核糖核苷酸”)或核糖核苷酸、优选大约6到 100个核苷酸的分子，但是对寡核苷酸的长度没有确定的限制。确切大小取决于许多因素， 而这些因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。同样，出于多种原因，本发明的核酸或多核苷酸可包括一种或多种修饰的核酸碱基、糖部分或核苷间连接。作为例子，使用包含修饰的碱基、糖部分或核苷间连接的核酸或多核苷酸的一些原因包括=(I)Tm的改变；( 改变多核苷酸对一种或多种核酸酶的敏感性；(3)提供切割位点，诸如被尿嘧啶-N-糖基化酶加碱性条件或内切核酸酶例如内切核酸酶IV切割的dUMP残基，或诸如被8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(也称为fapy-DNA糖基化酶或Fpg)加碱性条件或内切核酸酶例如内切核酸酶IV切割的8-氧-dGMP残基；(4)提供用于连接标记或亲和标签的部分；(5)提供标记或标记猝灭剂；或(6)提供诸如生物素的部分作为用于连接溶液中或结合于表面的另一种分子的标签。就本发明的核酸或多核苷酸来说，糖部分中的一个或多个可包括2'-脱氧核糖， 或者可选地，糖部分中的一个或多个可以是某种其他糖部分，诸如但不限于提供对一些核酸酶的抵抗力的核糖或2'-氟代-2'-脱氧核糖或2' -0-甲基-核糖，或可通过与可见的、荧光的、红外荧光的或其他可检测的染料或具有亲电子的、光反应性的、炔基或其他反应性化学部分的化学物质进行反应而标记的2'-氨基2'-脱氧核糖或2'-叠氮基-2'-脱氧核糖。本发明的核酸或多核苷酸的核苷间连接可以是磷酸二酯键连接，或者可选地，核苷间连接中的一种或多种可包括修饰的连接，诸如但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、 硒代磷酸酯(phosphoroselenate)、或二硒代磷酸酯(phosphorodiselenate)连接，它们对一些核酸酶具有抵抗力。当提及显示“随机序列”的寡核苷酸或寡核苷酸的部分时，我们表示，对于该随机序列部分内的每个核苷酸位置而言，使用等量的所有四种规范的核苷酸碱基(A、G、C以及T 或U)合成(例如，使用寡核苷酸合成仪)该寡核苷酸或其部分。这种方法导致包含0的 η次方)+1种不同寡核苷酸的寡核苷酸混合物的合成，其中“η”等于随机序列部分内的核苷酸位置的数目。因此，在这些实施方案中，寡核苷酸包括代表随机序列部分的所有可能序列的许多不同寡核苷酸的混合物。当提及显示“半随机序列”的寡核苷酸或寡核苷酸的部分时，我们表示合成半随机寡核苷酸或部分(例如，使用寡核苷酸合成仪)，其中使用等量的所有四种规范的核苷酸碱基(A、G、C以及T或U)合成一些核苷酸位置(即那些位置如以上所述是“随机的”)，但是只使用规范的碱基核苷酸(即Α、C、G以及T或U)中的一种、 两种或三种而不是所有四种来合成半随机部分内的一个或多个其他位置。在一些实施方案中，寡核苷酸包括具有“简并碱基”的一个或多个核苷酸，用“简并碱基”我们表示能够与除根据A与T或U配对和G与C配对的标准碱基配对法则之外的一种或多种核酸碱基进行碱基配对的核酸碱基，并且“简并核苷酸”是包含简并碱基的核苷酸。本文可互换使用的多核苷酸或寡核苷酸(包括引物)的“部分”或“区域”是2个碱基或更多个碱基的连续序列。 在其他实施方案中，区域或部分为至少约1个、2个、3个、5个、10个、15个、20个、25个、50 个、75个或甚至更多连续的核苷酸中的任何一种。如果随机或半随机序列包括寡核苷酸中的所有核苷酸，它可以分别被称为“随机寡核苷酸”或“半随机寡核苷酸”。“引物”是可以被核酸聚合酶延伸的一般具有游离的3’ -OH基团的寡核苷酸 (“oligo”)。对于依赖模板的聚合酶而言，一般至少引物寡核苷酸的3’部分与模板核酸的部分互补，该寡核苷酸通过氢键合和其他分子力与模板“结合”(或“复合”、“退火”或“杂交”)以给出引物/模板复合物用于启动DNA聚合酶进行的合成，并且通过添加与DNA合成过程中的模板互补的在3’端连接的共价键合的碱基延伸引物(即，“引物延伸的”)。结果是引物延伸产物。依赖模板的DNA聚合酶(包括反转录酶)一般需要寡核苷酸引物与单链模板的复合以启动DNA合成(“引发”)，但对于与DNA模板互补的RNA的合成(转录)，RNA 聚合酶一般不需要引物。本文的“热稳定的RNA连接酶”表示多肽，其中所述多肽的腺苷酸化形式在大约 40°C至大约70°C的反应温度在反应混合物中催化具有5’ -磷酰基和3’ -羟基基团的线性 ssDNA分子不依赖模板地环化成环状ssDNA分子，所述反应混合物包括将pH保持在大约pH 6. 5到pH 8之间的pH的缓冲液，浓度在大约0. 5mM到IOmM的Mn2+阳离子，并且其中ATP在反应缓冲液中不存在或者以小于所述多肽的非腺苷酸化形式浓度的摩尔浓度存在。本发明优选的热稳定的RNA连接酶是由通过引用并入的美国专利第7，303，901号的权利要求所描述和涵盖的噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶。然而，热稳定的RNA连接酶可包括在连接反应混合物中并且在本文所述的反应条件下从线性ssDNA分子合成环状ssDNA分子中有活性的任何RNA连接酶。热稳定的RNA连接酶可来自天然蛋白或重组蛋白。术语“天然蛋白”在本文用来指从天然存在(即，非重组)的来源分离的蛋白。如本文所用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指从重组DNA分子表达的蛋白分子。分子生物学技术可用于产生具有与蛋白的天然形式相同或相似特性的蛋白的重组形式。还可以制备天然序列的变体以例如改进多肽的表达、纯化或其他期望的特性。为重组蛋白的热稳定的RNA连接酶可以是融合蛋白。如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含与外源蛋白片段(例如，包含非TS2U6RNA连接酶蛋白的融合配偶体)连接的目标蛋白(例如，TS2U6RNA连接酶或其片段)的嵌合蛋白。融合配偶体可增强表达在宿主细胞中的热稳定的RNA连接酶蛋白的可溶性，可提供允许重组融合蛋白从宿主细胞或培养上清液纯化的亲和标签，或二者皆可。如果期望，可通过本领域已知的各种酶促或化学手段将融合蛋白从目标蛋白(例如，TS2126RNA连接酶或其片段)中除去。在本发明优选的实施方案中，热稳定的RNA连接酶组合物包含纯化的蛋白。如本文所用，术语“纯化的”或“以纯化”表示从目标组分如蛋白除去某种污染物的任何过程的结果。例如，通过除去其他污染的不期望蛋白、核酸、糖类、脂质和/或小生化分子来纯化特定的期望蛋白(例如，TS2126RNA连接酶)。污染物的去除导致期望蛋白占组合物的百分比提高。例如，在优选的实施方案中，纯化热稳定的RNA连接酶组合物以使其不含污染的核酸和对核酸具有活性的酶。在一些优选的实施方案中，通过在大肠杆菌细胞中复制和表达的质粒或其他载体中表达热稳定的RNA连接酶基因(和/或其功能变体及同源物)来获得热稳定的RNA连接酶，因为从这种重组来源获得的热稳定的RNA连接酶具有较高纯度、不含污染的酶的活性， 并且一般比从非重组来源获得的酶浓度更高。如本文所用的术语“基因”是指包含对于生成编码多肽或蛋白前体(例如，TS2U6RNA连接酶)必要的控制序列和编码序列的DNA序列。多肽可以由全长编码序列或由该编码序列的任何部分编码，只要保留期望的蛋白活性。在本发明优选的实施方案中，称热稳定的RNA连接酶是“稳定的”，我们表示该热稳定的RNA连接酶是足够纯的蛋白酶并且不含有助于降解和酶活性的丧失的其他污染物， 并且被提供在-20°C储存至少6个月没有显著的活性丧失的酶储存缓冲液的制品中。用于提供稳定的热稳定的RNA连接酶(例如，TS2U6RNA连接酶)的一种适宜的酶储存缓冲液包括含 50mM Tris-HCKpH 7. 5) UOOmM NaClUOOmM EDTAUmM DTTiPO. 的非离子去污剂Triton X-100的50%甘油溶液。除非另外指明，否则如本文所用的术语“热稳定的RNA 连接酶”可以指蛋白或基因的变体。此外，热稳定的RNA连接酶的变体形式也被考虑为等同于本文详细列出的那些肽和DNA分子。例如，预期独立地用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、 用丝氨酸取代苏氨酸、或用结构相关的氨基酸类似地取代氨基酸(即，保守突变)将不会对得到的分子的生物活性具有重大影响。据此，本发明的一些实施方案提供包含保守取代的热稳定的RNA连接酶(例如，TS2U6RNA连接酶)的变体。保守取代是发生在与其侧链相关的氨基酸家族内的取代。基因编码的氨基酸可被分成四个家族(1)酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；( 碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；C3)非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；和(4)不带电的极性氨基酸 (甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被联合地归为芳香族氨基酸。以类似方式，所有氨基酸可被分组为(1)酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；( 碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；C3)脂肪族氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，其中丝氨酸和苏氨酸任选被分别归为脂肪族-羟基氨基酸；(4)芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；( 酰胺氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺)；和(6)含硫氨基酸(半胱氨酸和甲硫氨酸)(例如，Stryer编， Biochemistry, pg. 17-21，第 2 版，WH Freeman and Co.，1981)。通过评估变体多肽以与野生型蛋白类似的方式起作用的能力可容易地确定肽的氨基酸序列改变是否产生功能多肽。 具有多于一个取代的肽可以相同方式容易地测试。更罕见地，变体包括“非保守”改变(例如，用色氨酸取代甘氨酸)。类似的微小变化还可包括氨基酸缺失或插入，或二者兼有。可使用计算机程序(例如，LASERGENE软件，DNASTAR Inc.，Madison, WI)发现在确定哪些氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不消除生物活性上的指导。可通过诸如定向进化的方法或其他用于产生变体以及截短突变体的组合文库的技术来产生变体。在一些实施方案中，从简并寡核苷酸序列产生同源物和变体，所述简并寡核苷酸序列例如通过在自动DNA合成仪中化学合成简并基因序列而制备并随后连接组装用于表达的适当基因。在一些实施方案中，通过随机诱变进行人工进化(例如，通过利用易错PCR将随机突变引入给定的编码序列中)。在连续轮次的诱变和选择过程中，在诱变后，根据预期活性筛选得到的克隆(例如，筛选热稳定的RNA连接酶活性)，然后有用的突变被转至下一轮诱变。在本发明的其他实施方案中，本发明的多核苷酸用于基因改组或有性 PCR(sexual PCR)程序(例如，Smith，Nature, 370 :324,1994 ；美国专利第 5837458 号；5830721号；5811238号；5733731)。多个循环的选择和改组导致几种酶的功能增强 (Stemmer, Nature, 370 398,1994 ；Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 :10747,1994 ； Crameri 等人，Nat. Biotech. ，14 315,1996 ；Zhang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 4504，1997 ；和Crameri等人，Nat. Biotech.，15 :436，1997)。还可以使用本发明的核酸和蛋白的片段，只要这些片段编码或拥有期望的酶活性。“单链特异性DNA酶”表示特异性消化单链DNA但不消化单链RNA或与互补的RNA 或DNA退火或复合的RNA或DNA的DNA酶，不论所述互补的RNA或DNA是另外的核酸分子的一部分(例如，通过分子间碱基配对)还是相同核酸分子的一部分(例如，通过分子内碱基配对)。单链特异性DNA酶可以是内切核酸酶或外切核酸酶，只要它具有将单链DNA特异性消化为单体或短的寡脱氧核糖核苷酸的活性。在一些优选的实施方案中，将包括引物在内的寡脱氧核糖核苷酸在利用它们的方法的步骤之后通过用单链特异性DNA酶消化而从反应混合物中移除。外切核酸酶I、外切核酸酶VII和RecJ外切核酸酶是示例性单链特异性DNA酶。本文的“T7型RNA聚合酶”(RNAP)表示T7RNA聚合酶(例如，参见由Goeddel， DV, Academic Press，1990 编辑的 Methods in Enzymology (酶学方法)，第 185 卷中的 Studier, Fff等人，第60-89页)或从“T7型”噬菌体获得的RNAP，T7型噬菌体表示具有与噬菌体T7的遗传结构相似的遗传结构的噬菌体。在一些实施方案中，RNA聚合酶启动子可以是单链的，诸如假启动子(例如，Ohmichi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 =54-59, 2002)或MvRNAP启动子，在这种情况下，利用包含MvRNAP (称为“小vRNAP”，EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI, USA)的转录活性的1，106-氨基酸结构域(对应于氨基酸 998-2103)的截短的蛋白(Kazmierczak, K. Μ.，等人，EMB0J. ,21 :5815-5823,2002)。如本文所用，“DNA片段”表示从较长DNA分子上切割或释放或断裂以致不再与母体分子相连的较长DNA分子的部分或碎片(piece)或区段，或为仅该较长DNA分子的部分的互补拷贝的ssDNA分子，在后一种情况下，通过使用DNA聚合酶延伸与该较长DNA分子退火并使用该较长DNA分子作模板的引物来合成该互补拷贝。在一些优选的实施方案中，所述方法用于产生包含加标签的DNA片段的集合或群体的“DNA片段文库”。“模板”是被核酸聚合酶诸如DNA聚合酶拷贝的核酸分子。不论该核酸分子包含两条链(即，为“双链的”)还是只包含一条链(即，为“单链的”)，用于指定由合成的核酸所显示的核苷酸序列的所述核酸分子的链是“模板”或“模板链”。由该核酸聚合酶合成的核酸与该模板互补。RNA和DNA总是以5’到3’方向合成，开始于模板链的3’端，并且核酸双链体的两条链总是对齐，使得这两条链的5’端处于该双链体的相对端(并且，必然地，3’ 端也是如此)。RNA和DNA模板需要引物来启动DNA聚合酶的合成，但是启动通过依赖DNA 的RNA聚合酶的合成不需要引物，所述依赖DNA的RNA聚合酶通常被简称为“RNA聚合酶”。如本文所用，“标签(tag) ”是指提供与它连接的核酸片段的寻址手段的非靶核酸组分，一般为DNA。例如，在优选的实施方案中，标签包括允许与标签相连的DNA的鉴定、 识别和/或分子操作或生物化学操作的核苷酸序列(例如，通过提供用于使寡核苷酸退火的位点，所述寡核苷酸诸如用于DNA聚合酶延伸的引物或者捕获反应或连接反应的寡核苷酸)。将标签与DNA分子连接的过程有时在本文称为“加标签”并且经历加标签或含标签的 DNA称为“加标签的”(例如，“加标签的DNA”)。标签可具有一个或多个标签部分或标签域。如本文所用，“标签部分”或“标签域”表示显示用于期望的预定目的或应用的序列的标签的部分或结构域。在其中第一链cDNA合成引物在其5’端部分中显示不与靶核酸序列互补的一种或多种核苷酸序列的一些实施方案中，标签在所述5’部分中也具有一种或多种“标签域”，标签域中的每一种为任何期望的目的而提供。例如，在一些实施方案中， 标签包括一个或多个标签域或者由一个或多个标签域组成，所述标签域选自切割位点标签域、RNA聚合酶启动子标签域、测序标签域、捕获标签域、扩增标签域、检测标签域、地址标签域和转座子末端域。如本文所用，“切割位点域”表示显示用于使切割容易的目的的序列的标签域。在一些实施方案中，切割位点域用于从加标签的环状ssDNA分子产生加双标签的线性ssDNA分子。在一些实施方案中，在标签中的切割位点域包括以下部分或由以下部分组成一个或多个2'-脱氧尿苷单磷酸(dUMP)部分或者一个或多个8-氧鸟嘌呤-2'-脱氧核苷基单磷酸(8-氧-dGMP)部分，并且该方法的步骤(c)包括使加标签的环状第一链cDNA分子分别与尿苷-N-糖基化酶(UNG ；EPICENTRE)或8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(Fpg ；EPICENTRE) 接触，以产生包含一个或多个无碱基位点的加标签的环状第一链cDNA分子，并随后孵育该包含一个或多个无碱基位点的加标签的环状第一链cDNA分子，所述孵育是在其中环状第一链cDNA分子在该无碱基化位点处或在该无碱基化位点附近被线性化产生加双标签的线性ssDNA分子的条件下诸如通过在碱性溶液或在包含内切核酸酶如内切核酸酶IV的溶液中孵育而进行。在一些实施方案中，在标签中的切割位点域显示限制性位点的序列。在一些实施方案中，限制性位点在靶DNA中如果有也只很少出现(例如，稀有切割的限制性内切核酸酶诸如NotI或AscI的限制性位点)。在一些实施方案中，在切割位点域中的限制性位点用于II型限制性内切核酸酶，诸如i^okl限制性内切核酸酶。在一些实施方案中，所述方法还包括使与加标签的环状ssDNA片段的单链限制性位点互补的寡脱氧核糖核苷酸退火，然后使用识别该限制性位点的限制性内切核酸酶在该限制性位点切割该加标签的环状 ssDNA片段。因此，在一些实施方案中，所述方法包括使加标签的环状ssDNA片段线性化以产生加双标签的线性ssDNA片段。在一些其他实施方案中，第一链cDNA合成引物具有包含双链发夹或由双链发夹组成的5’ -端部分，该双链发夹包含限制性位点，并且所述方法还包括使用识别该限制性位点的限制性内切核酸酶在该限制性位点切割加标签的线性ssDNA 片段的步骤。在包括以下的一些优选的实施方案中(i)通过与单链限制性位点互补的寡脱氧核糖核苷酸的退火或通过使用包含双链发夹的转移链，产生双链的限制性位点，并且 ( )然后使用识别该双链的限制性位点的限制性内切核酸酶切割该限制性位点，该方法还包括将限制性内切核酸酶切割的加标签的线性ssDNA片段与具有相容的3’端的另一种DNA 分子相连接的步骤。 如本文所用，“RNA聚合酶启动子域”或“启动子域”表示显示用于RNA聚合酶启动子的正义启动子序列或反义启动子序列的序列的标签域。如本文所用，“正义启动子序列” 或“正义RNA聚合酶启动子序列”表示与充当RNA聚合酶转录的模板的DNA链连接的RNA 聚合酶启动子的序列，所述RNA聚合酶结合RNA聚合酶启动子并且在适于转录的反应条件下从RNA聚合酶启动子启动转录。如本文所用，“反义启动子序列”或“反义RNA聚合酶启动子序列”表示与正义启动子序列互补的RNA聚合酶启动子的序列。在一些实施方案中， 由RNA聚合酶启动子域显示的正义启动子序列用于结合单链RNA聚合酶启动子并由此启动转录的RNA聚合酶，在这些实施方案中，正义启动子序列足以作为RNA聚合酶启动子发挥功能(例如，用于噬菌体N4RNA聚合酶)。在一些实施方案中，正义启动子序列用于结合双链 RNA聚合酶启动子并由此启动转录的RNA聚合酶，在这些实施方案中，该方法包括在使用结合双链RNA聚合酶启动子并由此启动转录的RNA聚合酶进行转录之前，使RNA聚合酶启动子变为双链的(例如，通过正义启动子序列与显示与正义启动子序列互补的反义启动子序列的寡脱氧核糖核苷酸退火，或者通过使用加标签的环状ssDNA片段或加双标签的线性 ssDNA片段作为模板来合成包含正义启动子序列或由正义启动子序列组成的dsDNA)。在一些实施方案中，正义启动子序列是用于T7型RNA聚合酶(例如，选自T7RNA聚合酶、T3RNA 聚合酶和SP6RNA聚合酶)的。显示正义启动子序列的RNA聚合酶启动子域使得使用该方法合成与连接于该正义启动子序列的单链DNA互补的RNA成为可能。如本文所用，“测序标签域”或“测序标签”表示显示用于如下目的的序列的标签域使利用合成加标签的环状SSDNA片段的方法对该标签连接的SSDNA片段的测序容易(例如，提供引发位点用于通过合成测序，或提供退火位点用于通过连接测序，或提供退火位点用于通过杂交测序)。例如，在一些实施方案中，测序标签域提供了用于引发所述 ssDNA片段或所述ssDNA片段的互补序列的DNA合成的位点。如本文所用，“捕获标签域”或“捕获标签”表示如下标签域显示用于使该标签域连接的SSDNA片段的捕获容易的目的的序列(例如，提供退火位点或亲和标签用于将加标签的环状ssDNA片段或加双标签的线性ssDNA片段捕获在珠子或其他表面上，例如，其中该标签域序列的退火位点允许通过与表面上的特异性序列诸如在珠子或在微芯片或微阵列或在测序珠子上的探针退火来捕获)。在该方法的一些实施方案中，在加标签的环状ssDNA 片段或加双标签的线性ssDNA片段通过与表面上的互补探针退火而被捕获后，捕获标签域提供用于使用所述加标签的环状ssDNA片段或所述加双标签的线性ssDNA片段(或所述加标签的环状ssDNA片段或加双标签的线性ssDNA片段的互补序列)作为模板引发DNA合成的位点。在一些其他的实施方案中，捕获标签域包括与化学基团或化学部分连接的转移链的5’部分，所述化学基团或化学部分包括亲和性结合分子或由其构成(例如，其中转移链的5’部分与第一亲和性结合分子诸如生物素、链霉抗生物素蛋白、抗原或结合该抗原的抗体连接，所述第一亲和性结合分子允许在第二亲和性结合分子连接的表面上捕获环状加标签的ssDNA片段或加双标签的线性ssDNA片段，所述第二亲和性结合分子与所述第一亲和性结合分子形成特异性结合对)。如本文所用，“扩增标签域”表示显示用于如下目的的序列的标签域使所述标签附加的核酸的扩增容易。例如，在一些实施方案中，扩增标签域提供用于使用DNA聚合酶的核酸扩增反应(例如，PCR扩增反应或链置换扩增反应或滚环扩增反应)的引发位点，或用于在核酸扩增反应(例如，连接链反应)中使用依赖模板的连接酶连接探针的连接模板。如本文所用，“检测标签域”或“检测标签”表示显示用于如下目的的序列或可检测的化学部分或生物化学部分的标签域使加标签的环状ssDNA片段或加双标签的线性 ssDNA片段的检测容易(例如，其中所述序列或化学部分包括可检测的分子或与可检测的分子连接；所述可检测的分子诸如选自以下的可检测分子可见的、荧光的、化学发光的或其他可检测的染料；在存在底物的情况下可检测的酶，例如碱性磷酸酶与NBT加BCIP或过氧化物酶与适合的底物)；可检测的蛋白，例如，绿色荧光蛋白；以及与可检测的部分结合或者可与另一种可检测的亲和性结合分子形成亲和性结合对或特异性结合对的亲和性结合分子；或本领域已知的许多其他可检测分子或系统中的任何一种)。如本文所用，“地址标签域”或“地址标签”表示显示允许特定样品的鉴定的序列的标签域(例如，其中第一链cDNA合成引物的5’-端部分具有对每种样品显示不同序列的不同地址标签域)。“转座子末端域”是显示转移的转座子末端序列的标签部分或标签域。一般说来， 使用来自 EPICENTRE Biotechnologies, Madison, Wisconsin, USA 的 Nextera 样品制备试剂盒产生具有含转座子末端域的标签的线性ssDNA分子，从该公司信息是可用的。不同的标签域的名称和描述是为了便利，这样使得理解和讨论不同实施方案中的标签的不同部分或域的预定目的和应用更容易。然而，这些名称和描述不旨在以任何方式限制标签或其任何一种标签域的使用或应用。因此，任何具体的标签或标签域可用于除了预定的或主要的目的或应用以外任何目的，或者代替预定的或主要的目的或应用的任何目的。同样，一种标签域可包括两种或更多种其他标签域(例如，测序标签域可包括捕获标签域和扩增标签域)，或一种标签域可提供两种或更多种不同的标签域的功能或目的或应用 (例如，捕获标签域还可提供特定应用的测序标签域和/或扩增标签域的功能或目的)。更进一步，不必按照一种或多种不同的域描述标签以便用于任何特定的目的或应用或功能。发明的一般描述通过使用依赖模板的(或同源连接酶)或不依赖模板的(或非同源)连接酶连接线性单链DNA(ssDNA)分子可制备环状ssDNA分子。如本文所用，“依赖模板的连接酶”或“同源连接酶”表示在以下情况下催化该线性ssDNA分子的分子内连接(即环化)的DNA连接酶当与互补多核苷酸退火时，要连接的线性ssDNA分子两端彼此相邻。与要连接的ssDNA分子的两个末端邻近地退火的多核苷酸在本文被称为“连接模板”并且这种连接被称为“依赖模板的连接”或“同源连接”。连接模板可以是生物样品的基因组或其他DNA中的互补DNA序列，或者连接模板可以是被合成并提供用于连接特定的或具体的线性ssDNA分子的“桥接寡脱氧核糖核苷酸”或“连接夹板(ligation splint)寡脱氧核糖核苷酸”(或“连接夹板”)。每个桥接的寡脱氧核糖核苷酸被设计显示与期望连接的线性ssDNA分子末端互补的核苷酸序列，以使得该线性 ssDNA分子的末端在与该桥接的寡脱氧核糖核苷酸退火时相邻。依赖模板的DNA连接酶的实例包括NAD型DNA连接酶，诸如大肠杆菌DNA连接酶、Tth DNA连接酶、Tfl DNA连接酶和AMPLIGASE DNA 连接酶(EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI, USA)，它们只有在存在连接模板的情况下催化ssDNA分子的分子内连接；以及ATP型DNA连接酶，诸如 iMDNA连接酶或FASTLINK DNA连接酶(EPICENTRE Biotechnologies)，尽管对于平端连接 ATP型DNA连接酶不需要连接模板，但比起不依赖模板的连接，它们更有效地催化依赖模板的连接。线性ssDNA分子的依赖模板的分子内连接在存在由生物样品中的靶序列或桥接的寡脱氧核糖核苷酸组成的互补连接模板的情况下是有效的和特异性的，并且是本领域已知的用于检测生物样品中靶核酸序列的存在或对其定量的许多方法的基础。然而，如果目标是环化大群体的不同ssDNA分子，诸如通过寡聚(dT)引发的对样品中所有mRNA分子的反转录而合成的所有的第一链cDNA分子，那么依赖模板的连接是极其不实际的，因为对于所有要连接的ssDNA分子设计适合的互补的桥接寡脱氧核糖核苷酸是非常困难的。具体而言，如果ssDNA分子的末端序列是未知的，那么设计或提供互补的桥接寡脱氧核糖核苷酸以环化在大小和核苷酸序列不同的大群体ssDNA分子中高百分比的所有ssDNA分子是极其困难的或是不可能的。例如，在本申请人尝试使用桥接寡脱氧核糖核苷酸与不同的依赖模板的连接酶和连接反应条件环化显示未知或随机的5’和/或3’端序列的线性ssDNA分子的实验室的许多实验中，不超过百分之几的线性ssDNA分子可被连接，即使该桥接寡脱氧核糖核苷酸显示不同长度的随机核苷酸序列，或者其中该桥接寡脱氧核糖核苷酸的一部分显示与在我们期望连接的线性ssDNA底物的一端的已知序列互补的序列，并且其序列的另一相邻部分由不同长度的随机序列或不同长度的包含通用碱基诸如肌苷的序列组成。不受理论束缚，申请人相信桥接寡脱氧核糖核苷酸的已知序列正确地与在要连接的线性ssDNA 分子一端的互补序列退火，但在该桥接寡脱氧核糖核苷酸另一端的随机序列通常不与该线性ssDNA分子的另一端互补(并因此阻断连接)。因而，使用依赖模板的连接酶的方法对于许多应用(例如，用于从样品中的所有mRNA分子制备的所有第一链cDNA分子产生环状 ssDNA分子，(例如，用于基因表达分析)，或者用于从变性基因组DNA片段产生环状ssDNA 分子(例如，用于CNV分析))来说是不实际的。本领域所需的是不需要连接模板诸如互补的靶核酸或桥接寡脱氧核糖核苷酸来从线性SSDNA分子产生环状ssDNA分子的分子内连接方法。所需的是采用“不依赖模板的” 或“非同源的”连接酶的分子内连接方法，提及“不依赖模板的”或“非同源的”连接酶我们在此表示在不存在连接模板的情况下导致线性ssDNA的分子内连接以产生环状ssDNA的连接酶，所述连接模板例如与期望连接的线性ssDNA末端退火以使其末端相邻的靶核酸或桥接寡脱氧核糖核苷酸。如上文在以上所讨论的，已尝试和本领域已知用于线性ssDNA分子不依赖模板的分子内连接成环状ssDNA分子的方法和连接反应混合物产生不令人满意的可变结果，这取决于线性ssDNA分子的序列和长度。因而，即使对于产生最好的不依赖分子内模板的连接结果的热稳定的RNA连接酶如噬菌体TS2U6RNA连接酶来说，在本领域对于改进不依赖分子内模板的连接方法以及对于改进的连接反应混合物和试剂盒存在迫切的未满足的需求。 本领域已知的最好的可用连接反应混合物和连接条件已使用，如本文所用，“标准连接反应混合物”，其在本文表示包含具有5’ -磷酰基和3’ -羟基基团的0. 5 μ M线性ssDNA底物分子、1 μ M热稳定的RNA连接酶(例如，每微升5单位CIRCLIG ASE ssDNA连接酶)、50mM MOPS 缓冲液(pH 7. 5) UOmM KClUmM DTT、5mM MgCl2,2. 5mM MnCl2 禾口 50 μ M ATP 的连接反应混合物，并且“标准连接反应条件”表示线性ssDNA底物分子在标准连接反应混合物中在 60°C孵育一小时。以上标准连接反应混合物和标准连接反应条件与本领域中常用于使用噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶进行线性ssDNA的分子内连接的标准连接反应混合物和标准连接反应条件相同或相似。EPICENTRE Biotechnologies (Madison, WI, USA)推荐这些使用CIRCLIGASE ssDNA连接酶(例如，见产品手册〃 Lit. #222)进行ssDNA的分子内连接的标准连接反应条件，并且ft^karia及其合作伙伴Matis和ftOkazyme推荐该标准连接反应条件，除外的是他们另外推荐在该标准连接反应混合物中添加牛血清白蛋白(BSA) 至每微升25ng BSA的终浓度(例如，见日期为2004年4月洸日的THERM0PHAGE ssDNA 连接酶(产品号IUig 122)的产品说明4.2版中对"ssDNA连接(环化)的指示，该 thermophage s sDna连接酶到本专利申请的申请日为止可从thermophage ssDna连接酶的经销商 Prokaria、Matis 或 Prokazyme 获得。在使用以上标准连接反应条件分子内连接线性ssDNA分子后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在变性条件下分析反应产物。样品可以在凝胶上电泳之前用外切核酸酶(外切核酸酶I或外切核酸酶III，或优选两种酶的混合物)处理，所述外切核酸酶消化未连接的ssDNA分子并且帮助鉴定环状ssDNA分子内连接产物。在申请人和申请人的雇主EPICENTRE Biotechnologies的其他雇员研究和销售 CIRCLIGASE ssDNA连接酶的大约五年中，EPICENTRE科学家观察到，使用所述标准连接反应混合物和条件，某些ssDNA寡核苷酸比具有不同序列或长度的其他ssDNA寡核苷酸更容易被环化。使用该酶从较大线性ssDNA分子合成显著产率的环状ssDNA分子也是非常困难的，所述较大线性ssDNA分子诸如通过对来自生物样品的mRNA反转录而制备的第一链 CDNA0优选让所有ssDNA分子以相同高效率分子内连接，这样达到各种应用中的最好表现。EPICENTRE Biotechnologies已提供了用于改进抗拒连接或难以连接的底物的连接产率的指南。这些建议包括改变MnCl2浓度或比标准连接反应混合物添加更多的 CIRCLIGASE 酶。然而，对于某些底物来说，产率仍比用更易连接或容易连接的ssDNA底物能达到的产率小。在研究CIRCLIGASE ssDNA连接酶的几年中，申请人还观察到这种酶不同的制备物对某些线性ssDNA底物产生产率可变的环状ssDNA产物。在2008年，EPICENTRE Biotechnologies的科学家构建了噬菌体TS2U6热稳定的 RNA连接酶基因的新的重组质粒克隆以便获得比我们用先前克隆能获得的该蛋白在大肠杆菌细胞中的更好的表达和产率。新的重组克隆包含噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶基因的核苷酸序列但没有六组氨酸标签，如在美国专利第7，303，901号中公开的。CIRCLIGASE 酶以良好的产率从这个新克隆中表达并且当被纯化时具有预期的43，876道尔顿分子量， 并且通过在包含SDS的10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分析纯化的酶制备物。然而，申请人出乎意料地发现从这个新克隆制备的CIRCLIGASE 酶主要由腺苷酸化形式的TS2U6热稳定的RNA连接酶组成(估计大约70%腺苷酸化)(图1)。相反，从先前克隆制备的酶的类似 SDS-PAGE分析显示该酶主要由非腺苷酸化形式的TS2U6热稳定的RNA连接酶组成(估计只有大约30%腺苷酸化)。当来自新克隆和旧克隆的酶制备物在标准连接反应条件(上述)下使用时，使用来自新克隆的酶制备物获得环状ssDNA连接产物的产率比使用来自旧克隆的酶制备物获得的产率低。这个结果有点出人意料并且引导申请人系统地比较从新克隆和旧克隆制备的CIRCLIGASE 酶的分子内连接活性，使用不同的线性ssDNA底物，不同的连接反应混合物，包括具有不同的ATP、MgCl2, MnCl2水平和不同的从新克隆和旧克隆制备的CIRCLIGASE 酶水平的连接反应混合物，以及用不同的连接反应条件，包括不同的反应时间，以及在连接反应混合物中的某些全新组分，诸如两性离子化合物三甲基甘氨酸(甜菜碱)。出人意料地且预想不到地，申请人观察到，当在不存在ATP且腺苷酸化形式的 CIRCLIGASE ssDNA连接酶(TS2U6热稳定的RNA连接酶)比线性ssDNA底物摩尔过剩条件下进行连接反应时，尤其是来自新克隆的高腺苷酸化的酶对具有不同核苷酸序列和大小的各种不同的线性ssDNA底物产生近似定量的分子内连接(尤其是在申请人发现进一步改良连接反应的方法以制备改进的连接反应混合物和改进的连接反应条件之后)。获得的结果(见实施例)使得申请人开发了允许对具有不同核苷酸序列和/或大小的线性ssDNA底物更加有效和一致的分子内连接的改进的连接反应混合物和使用所述改进的连接反应混合物的改进的分子内连接方法。因而，本发明的一个实施方案是用于线性ssDNA分子的分子内连接成为环状 ssDNA分子的改进的连接反应混合物。“改进的连接反应混合物”在本文表示包含以下成分的连接反应混合物(a)线性 ssDNA 分子；(b)热稳定的RNA连接酶分子的组合物，其中高比例的所述热稳定的RNA连接酶分子为腺苷酸化的并且其中所述腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶分子的浓度至少等于所述 ssDNA分子的摩尔浓度；(c)保持pH的缓冲液；和(d) Mn2+阳离子；其中，ATP在所述反应缓冲液中不存在，或者以比所述非腺苷酸化形式的热稳定的 RNA连接酶的浓度小的摩尔浓度存在。在优选的实施方案中，没有向所述连接反应混合物添加 ATP。提及语句“高比例的热稳定的RNA连接酶分子为腺苷酸化的”，我们表示在改进的连接反应混合物中所有热稳定的RNA连接酶分子的至少约60%为腺苷酸化的。在改进的连接反应混合物的一些实施方案中，所有热稳定的RNA连接酶分子的大于约70%为腺苷酸化的。在改进的连接反应混合物的一些实施方案中，所有热稳定的RNA连接酶分子的大于约 80 %为腺苷酸化的。在改进的连接反应混合物的一些优选的实施方案中，所有热稳定的RNA 连接酶分子的大于约90%为腺苷酸化的。在改进的连接反应混合物的一些优选的实施方案中，所有热稳定的RNA连接酶分子的大于约95 %为腺苷酸化的。在一些优选的实施方案中， 热稳定的RNA连接酶被腺苷酸化来制备如下组合物其中通过在纯化过程之中或之后将热稳定的RNA连接酶分子与ATP孵育将高比例的该酶腺苷酸化。例如，可用于使热稳定的RNA 连接酶腺苷酸化的一个方案是在50°C下在包含50mMTris-HCl，pH 8. 0、2mM MgCl2UOOmM NaCl以及0. 5mM ATP的溶液中孵育该酶15分钟；然后通过添加EDTA至5mM的终浓度终止反应；然后通过透析或凝胶过滤除去反应组分。腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶的百分比可通过在实施例中描述的SDS-PAGE分析来估计。在一些优选的实施方案中，其中高比例热稳定的RNA连接酶分子被腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶为噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶。在改进的连接反应混合物的一些实施方案中，缓冲液将PH保持在pH 6.5和？!1 8.0 之间。在改进的连接反应混合物的一些优选的实施方案中，缓冲液将PH保持在pH 7.0和 PH 8.0之间。在改进的连接反应混合物的一些优选的实施方案中，将pH保持在pH 7.0和 PH 8.0之间的缓冲液是Tris缓冲液。在改进的连接反应混合物的一些实施方案中，Mn2+阳离子的浓度在0. 5mM和IOmM之间。在改进的连接反应混合物的一些实施方案中，Mn2+阳离子的浓度在ImM和IOmM之间。在改进的连接反应混合物的一些实施方案中，Mn2+阳离子的浓度在ImM和5mM之间。在改进的连接反应混合物的一些优选的实施方案中，Mn2+阳离子的浓度为2. 5mM。在改进的连接反应混合物的一些优选的实施方案中，Mn2+阳离子作为MnCl2 而提供。在一些实施方案中，在改进的连接反应混合物中的腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶分子的浓度为ssDNA分子摩尔浓度的至少两倍。在一些实施方案中，在改进的连接反应混合物中的腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶分子浓度为ssDNA分子摩尔浓度的至少五倍。 在一些实施方案中，在改进的连接反应混合物中的腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶分子浓度为ssDNA分子摩尔浓度的至少十倍。在一些优选的实施方案中，改进的连接反应混合物另外包括盐，诸如氯化钾或醋酸钾(例如，浓度在大约50mM到大约IOOmM)。在一些优选的实施方案中，改进的连接反应混合物另外包括还原剂，诸如二硫苏糖醇(DTT)(例如，浓度在大约0. 5mM或ImM)。在一些实施方案中，改进的连接反应混合物另外包括浓度在0. 25M 到5. 2M之间的两性离子的三甲基甘氨酸(甜菜碱)。在一些实施方案中，改进的连接反应混合物另外包括浓度在0. 5M到2M之间的两性离子的三甲基甘氨酸(甜菜碱)。在一些实施方案中，改进的连接反应混合物另外包括大约IM浓度的两性离子的三甲基甘氨酸(甜菜碱)。在一些优选的实施方案中，改进的连接反应混合物包括(a)具有5，-磷酰基和3，-羟基基团的线性ssDNA分子(例如，0. 5 μ M)；(b)热稳定的RNA连接酶分子的组合物，其中> 70%的热稳定的RNA连接酶分子为腺苷酸化的并且其中在该改进的连接反应混合物中的腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶分子的浓度至少等于ssDNA分子的浓度(例如，约1 μ M的腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶对应0. 5 μ M的线性ssDNA分子)；(c)最终pH为大约pH 7. 8的33mM TRIS醋酸盐；禾口
(d)终浓度大约2. 5mM的Mn2+阳离子；其中，ATP在所述反应缓冲液中不存在，或者以比所述非腺苷酸化形式的热稳定 RNA连接酶的浓度小的摩尔浓度存在。在优选的实施方案中，没有向所述连接反应混合物添加 ATP。在一些优选的实施方案中，改进的连接反应混合物另外包括66mM醋酸钾和0. 5mM DTT0在一些优选的实施方案中，改进的连接反应混合物另外包括IM甜菜碱。本发明的另一实施方案是用于线性ssDNA分子改进的分子内连接来合成环状 ssDNA分子的方法，其中该方法包括将该线性ssDNA分子在改进的连接反应混合物中在大约40°C到大约70°C的反应温度下孵育足够的时间，其中合成环状ssDNA分子。在用于线性 ssDNA分子改进的分子内连接来合成环状ssDNA分子的方法的一些实施方案中，该方法包括将该线性ssDNA分子在改进的连接反应混合物中在55°C到70°C的反应温度下孵育足够的时间，其中合成环状ssDNA分子。在用于线性ssDNA分子改进的分子内连接来合成环状 ssDNA分子的方法的一些优选的实施方案中，该方法包括将该线性ssDNA分子在改进的连接反应混合物中在55°C到65°C的反应温度下孵育足够的时间，其中合成环状ssDNA分子。 在用于线性ssDNA分子改进的分子内连接来合成环状ssDNA分子的方法的一些优选的实施方案中，该方法包括将该线性ssDNA分子在改进的连接反应混合物中在60°C的反应温度下孵育足够的时间，其中合成环状ssDNA分子。在其中线性ssDNA分子改进的分子内连接的方法用于合成环状ssDNA分子的一些实施方案中，合成的环状ssDNA分子的产率比使用本文所定义的标准连接条件从相同量的线性ssDNA分子合成的环状ssDNA分子的产率高至少两倍。在其中线性ssDNA分子改进的分子内连接的方法用于合成环状ssDNA分子的一些实施方案中，合成的环状ssDNA分子的产率比使用本文所定义的标准连接条件从相同量的线性ssDNA分子合成的环状ssDNA分子的产率高至少五倍。在其中线性ssDNA分子改进的分子内连接的方法用于合成环状ssDNA分子的一些实施方案中，合成的环状ssDNA分子的产率比使用本文所定义的标准连接反应条件从相同量的线性ssDNA分子合成的环状ssDNA分子的产率高至少十倍。上述预想不到的发现引导申请人思考该改进的连接反应条件的基础，希望对所涉及的机制的更好的理解将使我们能够将我们的发现应用并扩展到其他情况、应用和方法。 我们希望我们的发现和更好的理解将产生更有效的且一致的线性ssDNA分子的分子内连接和在用于可使用环状ssDNA分子的任何应用的环状ssDNA分子的合成中的产率最大化。 不受理论或推测束缚，关于在此描述的本发明的基础和潜在益处，申请人在以下提供了他们的想法和意见。为了解决使用噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶对具有不同序列和大小的ssDNA 分子进行的可变的分子内连接效力的问题，申请人仔细考虑在这种酶的连接机制中涉及的各种催化步骤，这些催化步骤实际上对所有依赖ATP的DNA和RNA连接酶而言是常见的。噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶(例如，CIRCLIGASE 或THERM0PHAGE )连接反应步骤可书写如下反应1.连接酶+ATP —腺苷酸化的连接酶+PPi反应2.腺苷酸化的连接酶+线性5，-pDNA — AppDNA+连接酶反应3.连接酶+AppDNA —环状DNA+AMP+连接酶因而，第一反应步骤包括TS2U6热稳定的RNA连接酶活性位点赖氨酸的ε氨基基团被ATP腺苷酸化形成腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶。然后，在第二反应步骤中，将 AMP部分从该腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶转移至该线性ssDNA的5’磷酰基基团来合成 5，腺苷酸化的ssDNA。最后，非腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶促进该ssDNA的3，-羟基基团(在连接反应中称“受体”)对5’ -腺苷酸化末端(在连接反应中称为“供体”)的攻击，从而使该ssDNA的3’ -端与5’ -端连接来合成环状ssDNA并释放非腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶和AMP。基于热稳定的RNA连接酶的以上3步骤的连接反应机制，相比于本领域中使用的标准连接反应条件，可以设想几种改进分子内连接效率和环状ssDNA分子的产率的策略。例如，可用于本领域的一种策略是试着调整ATP浓度以找到给出更有效率或更高水平的分子内连接的浓度。这种策略有时对于优化使用热稳定的RNA连接酶容易连接的单ssDNA底物的分子内连接而言是有效的。提及“容易连接”，我们表示如下ssDNA底物 所述ssDNA底物显示允许其被热稳定的RNA连接酶有效地分子内连接并以高水平形成环状ssDNA分子的序列和大小。提及“高水平”，我们表示至少50%的线性ssDNA分子在存在热稳定的RNA连接酶的情况下在标准连接反应条件下孵育一小时后被分子内连接。然而， 如在“背景”部分中所讨论的，本申请人和本领域其他技术人员诸如Nimez等人(在以上讨论)在研究这一问题的几年时间内观察到在不同ssDNA分子的分子内连接效率上的巨大差异。尽管我们努力这样做，但我们不能制定规则来可靠地预测哪种ssDNA底物会容易连接以及哪种ssDNA底物很难或甚至不可能有效地连接。因而，在其中希望达到单种难以连接的ssDNA分子的有效或高水平的分子内连接或其中希望达到在序列、大小或连接效率不同的ssDNA分子群体中所有ssDNA分子的有效或高水平的分子内连接的情况下，试着寻找用于分子内连接反应的更好的ATP浓度的策略还没有成功。我们首先问自己“我们及其他人没有成功通过调整ATP浓度来实现这种情况下更有效或高水平的分子内连接的原因是什么？”为试图回答这个问题，我们考虑了试着达到在序列、大小或连接效率不同的ssDNA分子群体中的所有ssDNA分子的有效或高水平的分子内连接的常见的情况(诸如，将遇到试着分子内连接通过将生物样品中的所有mRNA分子反转录而制备的所有第一链cDNA分子或通过使断裂的dsDNA诸如变性的断裂的基因组 DNA或线粒体DNA变性而获得的所有ssDNA片段)。在这种群体中，将寻找一些容易连接的 ssDNA分子和其他难以连接的ssDNA分子。容易连接的ssDNA分子、难以连接的ssDNA分子和RNA连接酶在存在ATP的情况下开始连接反应后在不同的时间点发生了什么？
包括RNA连接酶分子的腺苷酸化的第一反应步骤在反应温度(对于TS2U6RNA连接酶而言通常在大约60°C )下孵育连接反应混合物后立即开始。随着这个步骤发生，腺苷酸化的RNA连接酶分子被用在第二反应步骤中使ssDNA分子的5’ -磷酰基末端腺苷酸化。 对于容易连接的ssDNA连接底物(意味着被RNA连接酶快速地分子内连接的ssDNA底物) 来说，该底物可以在所有RNA连接酶分子被ATP腺苷酸化之前被快速地腺苷酸化，随后，在第二反应步骤后仍与非腺苷酸化连接酶结合的腺苷酸化ssDNA分子在第三反应步骤中被非腺苷酸化RNA连接酶进行分子内连接。就难以连接的ssDNA连接底物(意味着只非常慢地被RNA连接酶进行分子内连接的底物)而言，连接反应的第二或第三步骤或两个步骤发生得更慢。因而，随着越来越多的RNA连接酶分子被ATP腺苷酸化直至大多数或所有的RNA 连接酶分子被腺苷酸化，一些ssDNA分子也被腺苷酸化。然而，腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶不能分子内连接腺苷酸化的线性ssDNA分子。因此，如果所有RNA连接酶分子的腺苷酸化发生在一些难以连接的ssDNA分子被腺苷酸化但还没有被分子内连接之后，不可能完成连接步骤3将腺苷酸化的难以连接的线性ssDNA分子转化成环状ssDNA分子。具体地说， 如果在连接反应步骤2之后所有的RNA连接酶分子被腺苷酸化并且难以连接的ssDNA分子被腺苷酸化但不与非腺苷酸化的RNA连接酶结合，那么这些腺苷酸化的ssDNA分子将不被连接。因此，在存在ATP的情况下进行分子内连接反应能够在所有热稳定的RNA连接酶被腺苷酸化且一些线性ssDNA底物被腺苷酸化的情况下限制反应。这个问题的一个可能的解决办法可能是降低连接反应混合物中ATP的浓度。然而，如果ATP浓度非常低，连接反应步骤1变成速率限制步骤，也降低第二和第三连接反应步骤的速率。在反应过程中，ATP的浓度降低，因此总反应速率也随着时间降低。可能人们会采用ATP再生系统来将ATP浓度保持在不导致连接酶的完全腺苷酸化的稳态水平。然而， 条件可能对于反应中所有不同的线性ssDNA分子来说不是最适的。通过添加其他反应组分引入的复杂性也是不期望的，因为更加难以控制或优化所有ssDNA分子的连接。概括地说，如果连接反应步骤1是快速的，而连接步骤2和3是速率限制的，那么不管反应进行多长都将产生低产率的环。这是因为所有的连接酶在[ATP] >> [连接酶] 的标准连接条件下将处于腺苷酸化形式。如果连接反应步骤1和2是快速的，而连接反应步骤3是速率限制的，那么由于相同的原因将获得低产率的环。因而，当使用标准连接反应混合物和本领域已知的用热稳定的RNA连接酶对ssDNA分子进行分子内连接的方法时，容易连接的ssDNA连接底物可以在所有的酶被ATP腺苷酸化之前被腺苷酸化并且快速地由RNA 连接酶进行分子内连接，而难以连接的ssDNA连接底物可以在所有的酶被ATP腺苷酸化之前被腺苷酸化但还未被连接，使得不可能驱使腺苷酸化的难以连接的ssDNA底物的分子内连接完成。基于这些考虑，申请人假设，不受理论束缚，分子内连接因改进的连接反应混合物和利用腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶比线性ssDNA分子摩尔过量及无外源ATP的改进的连接反应条件而改进，因为在这些条件下，连接反应的第一步骤被绕过，所以不存在将非腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶转化为腺苷酸化形式的ATP，同时线性ssDNA分子在连接反应的第二步骤中被腺苷酸化。因而，在稳态条件下，腺苷酸化的RNA连接酶只用于在连接反应的第二步骤中使线性ssDNA分子腺苷酸化。同样，在改进的连接反应条件下，随着线性 ssDNA的腺苷酸化发生，非腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶浓度在反应中随时间增加，这有利于线性ssDNA分子被分子内连接合成环状ssDNA分子。本领域技术人员没有注意在连接反应混合物中提供的热稳定的RNA连接酶的腺苷酸化水平来改进ssDNA分子的分子内连接。申请人无法找到如下任何本领域技术人员的任何公开内容已指定包含热稳定的RNA连接酶分子的组合物的连接反应混合物，其中高比例的热稳定的RNA连接酶分子被腺苷酸化，或者已公开使用这种改进的连接反应混合物进行ssDNA分子的分子内连接的方法。因而，使用缺乏ATP的本发明的改进的连接反应混合物，通过提供热稳定的RNA连接酶分子的组合物，其中高比例的热稳定的RNA连接酶分子被腺苷酸化并且其中该腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶以等于或超过要连接的5’-磷酸化的ssDNA分子摩尔浓度的浓度存在于该连接反应混合物中，实现对分子内连接反应动力学的更大控制。更进一步，本发明改进的连接反应混合物和改进的连接反应条件允许更容易地优化其他连接反应参数以改进各种DNA样品的环状DNA的速率和产率。例如，如以上所述，申请人发现分子内连接产率可通过在反应中除去镁和只包括锰作为二价阳离子来改进。作为另一个实例，添加甜菜碱到反应中也改进环状DNA的产率。已知甜菜碱使核酸中的G-C碱基配对不稳定以及改进酶在升高的温度下的稳定性。这两种效应将通过使DNA更易于分子内连接以及通过在长孵育阶段中保持高酶活性而允许更好的产率。
实施例在以下实施例和权利要求中进一步定义了本发明。应当理解这些实施例虽然指出本发明的优选实施方案，但仅通过举例说明方式给出。从以上讨论和这些实施例，本领域技术人员能够确定本发明的必要特征，并且在不背离本发明的精神和范围的情况下能够对本发明作出各种改变和变更以使其适合于各种运用和条件。实施例1来自噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶基因的新克隆的纯化的CIRCLIGASE 酶的SDS-PAGE分析腺苷酸化的CIRCLIGASE 酶在10 % SDS-PAGE凝胶上迁移为比非腺苷酸化的 CIRCLIGASE 略高的条带。图1显示从新克隆获得的CIRCLIGASE 酶制备物的银染色的 SDS-PAGE凝胶。通过比较腺苷酸化条带和非腺苷酸化条带的相对强度估计腺苷酸化百分比；这里显示的来自新克隆的CIRCLIGASE 酶估计由大约70%的腺苷酸化形式和大约30% 的非腺苷酸化形式构成。实施例2来自新克隆的高腺苷酸化的CIRCLIGASE 酶与来自旧克隆的低腺苷酸化的 CIRCLIGASE 酶的分子内连接活性的比较当在标准连接反应条件下测定时，来自旧克隆的低腺苷酸化的CIRCLIGASE 酶将近似> 95%的55-核苷酸对照寡核苷酸(与CIRCLIGASE ssDNA连接酶一起供应的线性 ssDNA)转化为环状ssDNA产物(图2)。相比之下，来自新克隆的高腺苷酸化的CIRCLIGASE 酶只将近似50%的相同线性ssDNA寡核苷酸转化为环状ssDNA产物。实施例3ATP浓度对由新克隆纯化的高腺苷酸化形式的CIRCLIGASEtmssDNA连接酶进行的线性ssDNA的分子内连接的影响在标准连接反应化合物中存在50 μ M ATP的情况下，与CIRCLIGASE ssDNA连接酶一起供应的近似50%的55-核苷酸ssDNA对照寡核苷酸被转化为环状ssDNA产物。当标准连接反应混合物中省略ATP时，近似> 95%的55-核苷酸ssDNA对照寡核苷酸被转化为环状ssDNA产物(图3)。环状ssDNA产物对20单位的外切核酸酶I (Exo I ；EPICENTRE) 的消化有抵抗力，外切核酸酶I为需要游离3’端的单链特异性外切核酸酶。未连接的线性 ssDNA底物被Exo I降解，而环状ssDNA连接产物对Exo I消化具有抵抗力。实施例4使用具有不同核苷酸序列和不同大小的线性ssDNA分子的高腺苷酸化形式的 CIRCLIGASE ssDNA连接酶与低腺苷酸化形式的CIRCLIGASE ssDNA连接酶的分子内连接活性的比较只包含低百分比的该酶的腺苷酸化形式的CIRCLIGASEtmssDNA连接酶 (EPICENTRE)对显示不同核苷酸序列或大小的不同线性ssDNA寡核苷酸底物的分子内连接显示不同的效率。然而，包含高百分比的该酶的腺苷酸化形式的CIRCLIGASEssDNA连接酶当标准连接反应混合物中省略ATP时对显示不同核苷酸序列或大小的不同线性ssDNA寡核苷酸底物显示高得多的分子内连接效率(图4中的表)。虽然从标准连接反应混合物中除去ATP提高了测试的大多数线性ssDNA寡核苷酸的分子内连接，但一些线性ssDNA底物如 4N454B和pYRTP. 5在这些条件下仍连接较差。这些底物用于进一步优化连接反应条件。实施例5使用高腺苷酸化形式的CIRCLIGASETMssDNA连接酶的分子内连接反应条件的进一步优化和改进的连接反应混合物的开发使用在实施例4中连接较差的线性ssDNA寡核苷酸pYRTP. 5底物和高腺苷酸化形式的CIRCLIGASETMssDNA连接酶(从新克隆纯化)评估镁和锰二价阳离子对分子内连接的影响。使用在由 33mM Tris 醋酸盐 pH7. 6、66mM K0Ac、0. 5mM DTT 和 O、1、2. 5、5 或 IOmM MnCl2或Mg(OAc)2组成的新连接反应混合物中的pYRTP. 5ssDNA底物和高腺苷酸化形式的 CIRCLIGASE ssDNA连接酶进行分子内连接实验。如图5所示，发现用于线性pYRTP. ksDNA 底物的分子内连接的优化的连接反应混合物在不存在镁阳离子的情况下包含2. 5mM MnCl20在这些连接反应条件下，近似30%的线性pYRTP. ksDNA底物被分子内连接。此外， 与本领域之前关于产生标准连接反应混合物的最适连接反应条件的发现不同，连接反应混合物中除了 2. 5mM MnCl2之外还存在镁阳离子没有改进连接。当在包含2. 5mM MnCl2和5mM Mg(OAc)2的相同缓冲液中进行分子内连接反应时，< 10%的线性pYRTP. 5ssDNA底物被转化为环状ssDNA产物(数据未显示)。当在包含线性ssDNA寡核苷酸pYRTP. 5底物、高腺苷酸化形式的CIRCLIGASE ssDNA连接酶和2. 5mM MnCl2的相同的连接反应混合物中进行分子内连接反应时，通过添加 100 μ g/ml的BSA或DMSO (5-20% 7V)没有观察到pYRTP. ksDNA底物分子内连接的进一步改进(数据未显示)。本发明不限于包含Tris的改进的连接反应混合物。例如，改进的连接反应混合物的一些其他实施方案包含MOPS pH 7. 5缓冲液或另一种缓冲液。实施例6改进的连接反应混合物的进一步开发难以连接的底物的甜菜碱分子内连接效率的效应使用在由来自实施例5的由33mM Tris醋酸盐pH 7. 6、66mM K0Ac、0. 5mM DTT和 2. 5mM MnCl2组成的改进的连接反应混合物加IM甜菜碱中的pYRTP. 5ssDNA底物和高腺苷酸化形式的CIRCLIGASE ssDNA连接酶评估两性离子的三甲基甘氨酸(甜菜碱)对分子内连接的影响并且将该反应混合物在60°C孵育16小时。在这些改进的连接反应条件下，几乎 100%的线性pYRTP. 5ssDNA底物被转化为耐外切核酸酶的环状ssDNA产物(图5)。甜菜碱对容易连接的线性ssDNA底物(例如，线性pYGT. 5ssDNA寡核苷酸)的分子内连接速率没有可检测的影响，如通过时程分析所确定的(数据未显示)。因此，甜菜碱似乎增强了难以连接的ssDNA底物的分子内连接而对容易连接的线性ssDNA底物没有抑制作用。因而，浓度在0. 25M和2. 2M之间的甜菜碱被包括在改进的连接反应混合物的一些实施方案中，并且在改进的连接反应条件的一些实施方案中，使用在大约60°C的较长反应时间。实施例7CIRCLIGASE ssDNA连接酶的底物大小偏爱的评估许多相关应用要求不同ssDNA底物群体的环化。为了评估具有不同核苷酸序列和大小的线性ssDNA底物群体的无偏倚的分子内连接的可能性，将限制性内切核酸酶切割的且变性的基因组DNA作为使用高腺苷酸化形式的CIRCLIGASE ssDNA连接酶的分子内连接的底物来测试。用Alu I完全消化小牛胸腺DNA，通过加热使之变性，在冰上快速冷却。得到的线性ssDNA分子在变性PAGE凝胶上显示可再现的且特异性的带型和大小分布。将变性的Alu I消化的小牛胸腺ssDNA片段与高腺苷酸化形式的CIRCLIGASE酶在来自实施例6的改进的连接反应条件下孵育，这导致近似10%的200ng总ssDNA底物转化为耐外切核酸酶的环状ssDNA产物(图7)。对线性ssDNA分子观察到的相对大小分布和特异性带型被分子内连接后的环状ssDNA分子所保留，这指示但不证明，对于高达约6000个核苷酸大小的ssDNA片段，不存在基于大小或总体序列组成的总底物偏倚(图7)。用Rsa I切割随后变性的基因组DNA获得类似结果(数据未显示)。实施例8改进的连接反应混合物和改进的连接反应条件应用至使用古细菌的热稳定的RNA 连接酶进行的线性ssDNA分子的分子内连接申请人:克隆、表达并纯化了嗜热自养甲烷杆菌RNA连接酶I(Mthfoil) (Torchia, C 等人，Nucleic Acids Res 36 :6218-6227,2008) 在实施例6中描述的但包含大约50%到 60%腺苷酸化的Mthfoil酶的改进的连接反应混合物和改进的连接反应条件改进了从线性 ssDNA分子合成环状ssDNA分子的分子内连接效率和产率。Mthfoil酶的连接效率和产率不如具有相当的腺苷酸化水平的CIRCLIGASE (TS2126RNA连接酶)的连接效率和产率高。改进的连接反应混合物的一些实施方案包含不同的高腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶的混合物(例如，包括噬菌体TS2U6RNA连接酶和Mthfoil)。实施例9使用产生加标签的环状ssDNA片段的方法作为制备下一代测序模板的工艺的一部分在一些实施方案中，线性ssDNA分子包含使用样品中的RNA(例如，mRNA或总RNA) 或DNA作模板通过DNA聚合酶延伸第一链cDNA合成引物而产生的5，加标签的ssDNA片
32段，其中第一链cDNA合成引物包含5’端部分和该3’端部分，其中5’端部分由显示不与该模板互补的序列的标签组成，并且3’端部分显示不与该模板互补的序列。在一些实施方案中，使用本发明的改进的连接反应混合物和改进的连接方法分子内连接这些5’加标签的 ssDNA片段。在这些实施方案的一些中，第一链cDNA合成引物中的标签包含使用特定的下一代测序仪如Roche 4 测序仪进行下一代测序的测序标签域。例如，在一些实施方案中， 本发明的方法的步骤(b)是通过首先使线性ssDNA分子热变性随后使用不依赖模板的连接酶通过进行以下反应使其环化而进行的
达到20微升终体积的水
χ
1微升 1微升 4微升 10微升 4微升
330 mM Tris 醋酸盐 pH 7.8, 660 mM KOAc 50 mM MnCl2
5 M甜菜碱
20 |Lig/ml变性的5’加标签的断裂DNA 100 υ/ι TS2126 连接酶(CIRCLIGASE II,
EPICENTRE)
20微升终反应体积将反应在60°C孵育2小时。然后，用18单位的外切核酸酶I和20单位的外切核酸酶III在37°C处理反应产物1小时以消除非环化的线性DNA。环化的产物没有被消化。实施例10来自实施例9的加标签的环状ssDNA的PCR分析使用与包含显示用于特定的下一代测序仪的序列的测序标签域的标签退火的PCR 引物进行PCR分析。使用这些PCR引物的PCR产物证明环化，因为只有连接的、加标签的环状ssDNA分子能够被扩增产生与环状ssDNA的大小对应的线性dsDNA产物。如下进行PCR 反应
“21微升水
1微升外切核酸酶处理的CircLigase II反应(1 1000稀释) 1微升 5 μΜ PCR引物1 (例如，对于Roche FLX 454衔接子A)1微升 5 μΜ PCR引物2 (例如，对于Roche FLX 454衔接子B ) 1微升FailSafe DNA聚合酶
25 微升 FailSafe 2 χ PCR PreMix C
50微升终反应体积在如下条件下进行PCR持续四个循环
94 °C 10 秒.50 °C 10 秒.72°C1 分钟.凝胶分析表明产生的PCR产物的大小范围与5’加标签的断裂ssDNA相当。也进行了对照反应。当连接反应中省略CIRCLIGASE II ssDNA连接酶时，没有从 5’加标签的线性ssDNA片段中产生PCR产物。当从PCR反应中省略PCR引物时，没有产生产物。PCR产物具有与5’加标签的线性ssDNA片段相同的大小分布的事实表明1)5’加标签的线性ssDNA片段可被热变性以产生变性的加标签的线性ssDNA片段，该变性的加标签的线性ssDNA片段为不依赖模板的连接的底物；和2) 5，加标签的线性ssDNA片段可被有效转化为加标签的环状ssDNA片段而没有可检测的偏倚(如在外切核酸酶I和外切核酸酶 III处理后通过PCR扩增所证实的)。实施例11对来自Nextera 产生的线性加标签的ssDNA片段的加标签的环状ssDNA的PCR 分析在一些其他实施方案中，本发明改进的连接方法中使用的线性加标签的ssDNA分子包括使用Nextera 样品制备试剂盒(EPICENTRE)产生的5，加标签的ssDNA片段；在这些实施方案中，使用Nextera从dsDNA产生包含5，加标签的ssDNA片段的线性加标签的 ssDNA分子，所述dsDNA如基因组dsDNA、线粒体dsDNA或甚至从RNA制备的双链cDNA。在这些实施方案中，使用Nextera试剂盒产生的线性加标签的ssDNA片段具有包含转座子末端标签域和测序标签域的标签。在将使用Nextera获得5’加标签的ssDNA片段而产生的加标签的dsDNA片段变性后，使用与实施例9中所用的方案类似的方案将这些线性加标签的 ssDNA分子环化。然后，使用与实施例10中所用的方案类似的方案分析该环状产物，除外的是PCR引物1与转座子末端序列互补(例如，与非转移的转座子末端序列互补)，而PCR引物2与Roche 454测序仪衔接子互补(例如，与Roche FLX 454B互补)；在PCR后，PCR产物具有与5’加标签的线性ssDNA片段相同的大小分布的事实表明(1)转座子末端组合物具有有效的5’加标签的且断裂的靶基因组DNA ；2)退火的互补5’加标签的线性ssDNA片段已经被热变性以产生变性的加标签的线性ssDNA片段，该变性的加标签的线性ssDNA片段为不依赖模板的连接的底物；和幻5’加标签的线性ssDNA片段已被有效地转化为加标签的环状ssDNA片段而没有可检测的偏倚(如在外切核酸酶I和外切核酸酶III处理后通过 PCR扩增所证实的)。
权利要求
1.一种用于线性ssDNA分子的不依赖模板的分子内连接的连接反应混合物，所述连接反应混合物包括(a)具有5，-磷酰基和3，-羟基基团的线性ssDNA分子；(b)热稳定的RNA连接酶分子的组合物，其中高比例的所述热稳定的RNA连接酶分子为腺苷酸化的，并且其中在所述连接反应混合物中的腺苷酸化的热稳定的RNA连接酶分子的浓度等于或超过所述ssDNA分子的摩尔浓度；(c)将最终的pH保持在大约pH6. 5和大约pH 8. 0之间的缓冲液；和(d)处于对所述热稳定的RNA连接酶最适的浓度的锰盐，其中在所述连接反应混合物中的Mn2+阳离子的终浓度在大约0. 5mM和大约IOmM之间；其中，ATP在所述反应缓冲液中不存在或者以比所述热稳定的RNA连接酶的非腺苷酸化形式的浓度小的摩尔浓度存在。
2.如权利要求1所述的连接反应混合物，所述连接反应混合物另外包括终浓度在大约 0. 25M至大约2M的甜菜碱(两性离子的三甲基甘氨酸)。
3.一种用于具有5’ -磷酰基和3’ -羟基基团的线性ssDNA分子的不依赖模板的分子内连接来合成环状ssDNA分子的方法，所述方法包括(1)制备权利要求1任一项所述的连接反应混合物；和(2)在大约40°C至大约70°C的反应温度在所述连接反应混合物中孵育所述线性ssDNA分子持续足够的时间，其中合成环状ssDNA分子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述不依赖模板的热稳定的RNA连接酶选自由以下组成的组栖热菌属(Thermus)噬菌体RNA连接酶；噬菌体TS2U6RNA连接酶；古细菌RNA 连接酶；嗜热自养甲烧杆菌(Me thanobacterium thermoautotrophicum)RNA 连接酶 1。
5.如权利要求4所述的方法，所述方法还包括(1)制备所述连接反应混合物，所述连接反应混合物包括(a)所述具有5’-磷酰基和3’ -羟基基团的线性ssDNA分子；(b)噬菌体TS2U6热稳定的RNA连接酶的组合物，其中彡60%的所述热稳定的RNA连接酶分子为腺苷酸化的并且以如下的量存在其中在所述连接反应混合物中的腺苷酸化的 RNA连接酶分子的摩尔浓度等于或超过所述线性ssDNA分子的摩尔浓度；和(c)所述缓冲剂；(d)提供终浓度在大约0.5mM和IOmM之间的Mn2+阳离子的锰盐；和(2)在大约55°C和大约65°C之间的温度孵育所述连接反应混合物持续足够的时间，其中从所述线性ssDNA分子产生环状ssDNA分子。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述连接反应混合物另外包含终浓度为0.25M至2M 的甜菜碱(两性离子的三甲基甘氨酸)。
7.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述线性ssDNA分子包括线性ssDNA分子的群体或由线性ssDNA分子的群体组成，其中5’端或3’端的核苷酸序列是未知的和/ 或其中所述线性ssDNA分子大小不同。
8.如权利要求3-7中任一项所述的方法，其中在用于分子内连接的所述方法中使用的所述具有5’ -磷酰基和3’ -羟基基团的线性ssDNA分子包括线性第一链cDNA分子的群体或由线性第一链cDNA分子的群体组成，所述线性第一链cDNA分子是通过使用DNA聚合酶延伸与由生物样品中的一个或多个靶核酸分子展示的互补序列退火的一个或多个第一链cDNA合成引物而产生。
9.如权利要求8所述的方法，其中通过延伸一个或多个第一链cDNA合成引物而产生的所述线性第一链cDNA分子通过如下方式进一步纯化通过使用特异性消化所述靶核酸分子但不消化所述线性第一链cDNA分子的核酸酶除去所述靶核酸分子，或者通过将亲和标签掺入所述线性第一链cDNA分子中并使用与所述亲和标签形成特异性结合对的亲和性结合物质将所述线性第一链cDNA分子拉出，来从所述靶核酸分子中选择性纯化所述线性第一链cDNA分子，所述亲和性结合物质与表面相连。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述一个或多个第一链cDNA合成引物中的每一个都包括5’端部分，所述5’端部分包含显示基本上不与所述靶核酸分子中的序列互补的序列的标签或者由显示基本上不与所述靶核酸分子中的序列互补的序列的标签组成；以及 3’端部分，所述3’端部分显示与来自生物样品的至少一个靶核酸分子所显示的序列互补的序列。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述一个或多个第一链cDNA合成引物的5’端部分中的标签包括一个或多个标签域或者由一个或多个标签域组成，所述标签域选自由以下组成的组显示正义启动子序列的RNA聚合酶启动子标签域；切割位点标签域；序列特异性测序标签域；捕获标签域；扩增标签域；检测标签域；和地址标签域。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第一链cDNA合成引物包括含一个或多个不同标签域的标签或者由含一个或多个不同标签域的标签组成，所述一个或多个第一链cDNA 合成引物各自包含在所述第一链cDNA的标签域之间或在其5’端部分与其3’端部分之间的切割位点，并且所述方法还包括步骤(3)使所述环状第一链cDNA分子在所述切割位点处线性化以获得各自在5’端显示所述第一链cDNA合成引物的3’端部分的序列并且在3’ 端显示所述第一链cDNA合成引物的5’端部分的序列的线性第一链cDNA分子。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述一个或多个第一链cDNA合成引物的5’端部分包括如下标签或由如下标签组成所述标签包含显示正义启动子序列的RNA聚合酶启动子标签域和位于所述正义启动子序列的3’ -的切割位点，或者由显示正义启动子序列的 RNA聚合酶启动子标签域和位于所述正义启动子序列的3’ -的切割位点组成，并且其中所述方法还包括如下子步骤(i)使显示反义启动子序列的寡脱氧核糖核苷酸与所述正义启动子序列在来自步骤C3)的每一个所述线性第一链cDNA分子的3’端退火以产生转录底物， 以及随后(ii)使用结合所述双链RNA聚合酶启动子并由此启动转录的RNA聚合酶转录所述转录底物。
14.如权利要求13所述的方法，其中，在子步骤(ii)之前，所述方法还包括通过使用 DNA聚合酶延伸显示反义启动子序列的所述寡脱氧核糖核苷酸来产生双链cDNA的子步骤。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述一个或多个第一链cDNA合成引物的5’端部分包括如下标签或由如下标签组成所述标签包含两个测序仪特异性测序标签域或由两个测序仪特异性测序标签域组成，并且步骤C3)产生在5’端和3’端各具有一个测序标签域的线性ssDNA测序模板(加双标签的测序模板)。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述在5’端和3’端各具有一个测序标签域的线性ssDNA测序模板用作在所述测序标签域对其特异的下一代测序仪上测序的模板。
17.如权利要求3-11中任一项所述的方法，所述方法还包括通过选自以下的方法扩增环状ssDNA分子滚环复制、滚环转录和PCR。
18.如权利要求3-11中任一项所述的方法，所述方法还包括使用所述环状ssDNA分子作为模板用于大规模平行测序。
全文摘要
本发明提供了用于使用例如热稳定的RNA连接酶对线性ssDNA进行改进的不依赖模板的分子内连接(环化)的连接反应混合物、方法和试剂盒，所述线性ssDNA包括变性的gDNA片段或通过RNA的反转录制备的第一链cDNA。使用所改进的连接反应混合物和方法获得的环状ssDNA分子可例如用作如下的模板用于通过反向PCR、滚环复制、转录来扩增的模板，或者用于大规模平行DNA测序的模板。应用包括，例如对于诸如人类医学或动物医学、法医学或农业目的用于研究、筛选、医学诊断、治疗诊断、个性化医学治疗或育种的通过qPCR或使用微阵列的基因表达分析；gDNA拷贝数变异的分析；以及特定核酸序列的检测或定量。
文档编号C12Q1/68GK102317475SQ201080007788
公开日2012年1月11日 申请日期2010年2月16日 优先权日2009年2月16日
发明者乔安妮·德克尔, 加力·大鹿, 杰罗马·箭之撒 申请人:阿霹震中科技公司