雌马酚产生菌及其利用的制作方法

文档序号:391819阅读:1193来源:国知局
专利名称:雌马酚产生菌及其利用的制作方法
技术领域
本发明涉及雌马酚产生菌及其利用。
背景技术
大豆食品中大量含有的异黄酮作为对不明抱怨(不定愁訴)等的更年期症状的改善和骨质疏松症的预防、高血脂症和动脉硬化的预防、乳腺癌和前列腺癌的预防等具有效果的功能性成分而广为人知。根据近年的研究,已知异黄酮之一的黄豆苷原(Daidzein)通过体内的肠内细菌代谢为雌激素作用或抗氧化作用更强的雌马酚(Equol),雌马酚作为在体内发挥上述作用的主要有效成分之一而备受关注。有报道在体内从黄豆苷原到雌马酚的产生并不是在所有人体内同等进行的,其产生能力上有个人差别,30 50%的人有雌马酚产生能力(非专利文献1)。因此,全力进行着具有雌马酚产生能力肠内细菌的研究,作为具有雌马酚产生能力的微生物,报道有卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、星群链球菌(Streptococcus constellatus)(专利文献 1)、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae) (专利文献 2)、Slackia spp. TM-30 株、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adollescentis) TM-I株、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) JCM 1273 (专利文献3)、费氏丙酸杆菌(Proprionobacterium freudenreichii)、季L 双歧!f 菌(Bifidobacterium lactis) > 嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、唾液乳杆菌 (Lactobacillus salivarius)(专利文献 4)、SNU_Julong732 (非专利文献 2)、革兰氏阳性菌do03(非专利文献3)。然而,由于上述报道的微生物从作为基质的黄豆苷原到雌马酚的转化能力低,因此不能用于使用微生物的人体内的雌马酚产生和使用微生物的雌马酚的工业生产的用途中。现有技术文献专利文献专利文献1 国际公开99/7392号小册子专利文献2 国际公开2005/42号小册子专利文献3 日本特开2006_20似96号公报专利文献4 日本特表2006-504409号公报非专利文献非专利文献1 =Proc Soc Exp Biol Med, Vol. 217,No. 3,p335_339 (1998)非专利文献2:Appl Environ Microbiol, Vol. 71, p214-219 (2005)非专利文献3 J Biosci Bioeng, Vol. 102,p247_250 (2006)
发明内容
发明所要解决的课题因此本发明的课题在于提供雌马酚转化效率高的微生物、利用该微生物的饮食用、医药用组合物、使用该微生物的雌马酚的制造方法、以及能够特异性检测出该微生物的核酸片段。用于解决课题的方法本发明的发明人为了解决上述课题努力研究,其结果,通过使用本发明的发明人之前发明的具有雌马酚转化能力的微生物的选择培养基,传代培养具有雌马酚产生能力的人的粪便,成功地发现了雌马酚转化效率非常高的微生物,从而完成了本发明。S卩,本发明提供从黄豆苷原到雌马酚的转化能力为M小时50%以上的微生物。另外,本发明提供含有具有上述雌马酚转化能力的微生物的饮食用或医药用组合物。另外,本发明提供一种雌马酚的制造方法,其特征在于,使具有上述雌马酚转化能力的微生物与黄豆苷原作用。另外,本发明提供能够特异性检测出具有上述雌马酚转化能力的微生物的核酸片段。发明的效果由于本发明的微生物的雌马酚转化效率非常高,本发明的微生物能够在试图在人体内产生雌马酚的饮食品或医药品中利用,还能够在雌马酚相关的不明抱怨等的更年期症状、骨质疏松症、高血脂症、动脉硬化、乳腺癌、前列腺癌、月经前症候群等各种疾病的治疗和改善、或者其预防等的目的中利用。另外,在雌马酚的工业生产中利用时,由于能够高浓度地回收雌马酚,之后的分离精制等的操作变得容易,能够极为高效地生产雌马酚。而且, 通过使用本发明的核酸片段,能够从粪便或消化道内容物中检测出具有雌马酚转化能力的微生物,通过使用核酸片段对具有雌马酚转化能力的微生物进行定量化,能够简便地研究个人原本具有的雌马酚产生能力。


图1是表示Slackia sp. YIT 11861的分子系统树的图。图中[]表示登录号 (Accession Number),数值表不 Boot strap 值。图2是表示制作的引物的检测灵敏度的图。
具体实施例方式在本发明中,雌马酚转化能力能够通过在添加有作为雌马酚的底物的最终浓度为 100 μ M的黄豆苷原的培养基中,接种作为对象的微生物,使其为IO7个/培养基· mL,在 37°C保温一定时间,测定培养基中的雌马酚浓度,与黄豆苷原的初始浓度比较,代入下式来研究。雌马酚转化能力(% )=(含有作为对象的微生物的培养液中的雌马酚浓度)/ (培养液中的黄豆苷原的初始浓度)X100这里,为了再现人肠管内的状态,优选进行厌氧培养,作为培养基优选GAM培养基。
另外,雌马酚浓度能够根据液相色谱、LC-MS等的常规方法进行测定。本发明的“从黄豆苷原的雌马酚转化能力为M小时50%以上的微生物”是指通过 24小时的保温上述的雌马酚转化能力为50%以上的微生物。而且,能够合适地利用通过M 小时的保温为80%以上、更优选为100%的微生物。另外,还能够优选利用通过更短时间保温、例如8小时的保温为50%以上的微生物。作为这些的一个例子能够列举Slackia属细菌。具体而言,本发明的具有雌马酚转化能力的微生物能够通过筛选得到,即,使用有存在具有雌马酚转化能力的微生物可能性的检测体,使用本发明的发明人之前发明的具有雌马酚转化能力的微生物的选择培养基(国际公开2007/52740号小册子),确认从黄豆苷原的雌马酚转化能力,同时不断传代培养粪便等的检测体,能够筛选具有雌马酚转化能力的微生物。作为有存在雌马酚转化能力的微生物可能性的检测体,优选使用具有雌马酚转化能力的人(雌马酚产生者)的粪便或消化道内容物等,粪便优选使用经过离心清洗处理的粪便。通过上述方法得到的具有雌马酚转化能力的Slackia属细菌之一,作为Slackia sp. YIT 11861 (FERM ABP-11231),于平成21年2月3日,保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)。该Slackia sp. YIT 11861的系统分类、生物化学形状表示如下。按照常规方法确定Slackia sp. YIT 11861的1400bp以上的16S rRNA碱基序列, 在公用DNA数据库(DDBJ)中使用FASTA程序进行同源性检索。其结果,已知的Slackia属细菌株Slackia exigua ATCC 700122τ(登录号:AF101240)与本菌株的16S rRNA的同源性为92.4%。另外,对通过DNA数据库得到的其它细菌的碱基序列进行序列多重对比后,通过 NJ法进行分子系统解析的结果为,本菌株属于棒状杆菌科Slackia属。另外,在专利文献3 中记载的Slackia spp. TM-30与3种来自人类的未培养菌(登录号:EF071271,DQ797152, AY916234)具有99%以上的同源性,形成一个组群。生化学性状方面,在对碱性磷酸酶显示阳性的方面和对精氨酸芳胺酶、脯氨酸芳胺酶、苯丙氨酸芳胺酶、亮氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、丙氨酸芳胺酶、甘氨酸芳胺酶、组氨酸芳胺酶、丝氨酸芳胺酶显示阴性的方面与S. exigua ATCC 700122τ不同。另外,在D-甘露糖、D-棉子糖的利用性、对碱性磷酸酶显示阳性的方面与Slackia spp. TM-30不同。根据以上事实可以判定Slackia sp.YIT 11861与已有报道的菌株不同。含有本发明的具有雌马酚的微生物的饮食品或医药品组合,能够作为体内、血中、 大肠内等的肠内等中的雌马酚浓度上升剂使用,能够在不明抱怨等的更年期症状、骨质疏松症、高血脂症、动脉硬化、乳腺癌、前列腺癌、月经前症候群等异黄酮相关的各种疾病的治疗和改善、或者其预防等的目的中利用。特别是通过用于没有雌马酚产生能力的人(非雌马酚产生者)或雌马酚产生能力低的人,能够日常性预防异黄酮相关的各种疾病。另外,能够合适地用于不明抱怨等的更年期症状和骨质疏松症、患癌症风险高的中年期或老年期的人。这里,本发明的具有雌马酚转化能力的微生物的利用方式没有特别限制,活菌或加热菌体(死菌体)任一种均可,还可以是冻结干燥的菌体,也能够利用培养上清等的培养物、菌体处理物等。另外,由于认为雌马酚转化能力通过来自细菌的酶发挥作用,因此优选以不使酶的活性丧失的状态使用。本发明的组合物中也可以含有核糖醇、阿拉伯糖、赤藓醇、半乳糖、乳糖醇、松三糖、海藻糖、核糖、山梨糖、木糖、肌醇、山梨醇。由于这些糖类具有选择性具有雌马酚转化能力的微生物使维持、增殖或者增进微生物的雌马酚转化能力的作用,具有雌马酚浓度上升作用,因此通过与本发明的具有雌马酚转化能力的微生物并用,能够作为更加优异的雌马酚浓度上升剂使用。糖类可以单独使用,也可以组合2种以上使用。虽然这些糖类可以使用D型或L型的任一种,但优选D型。另外,也能够使用无水物、5水合物等的水合物。海藻糖中,随着2分子的葡萄糖的结合方式的不同,存在α、α型、α、β型以及β、β型的异构体,能够使用任一种异构体,但优选α、α型。肌醇中存在9种立体异构体(myo-肌醇、D(+)_肌醇、L-(-)肌醇、muco-肌醇、scyllo-肌醇、cis-肌醇、印i_肌醇、alio-肌醇、neo-肌醇)。天然存在myo-肌醇、D (+)-肌醇、L-㈠肌醇、muco-肌醇、 scyllo-肌醇,但从容易得到的观点出发,优选使用myo-肌醇。该肌醇能够并用2种以上的立体异构体。糖类可以使用合成品或来自天然的提取物等的市售品,另外,也可以作为大量含有这些糖类的来自天然的材料使用。具体而言,作为大量含有核糖醇的材料,可以列举植物的根或含有核黄素的材料,作为大量含有山梨糖的材料可以列举植物的果实,作为大量含有松三糖的材料可以列举植物的蜜或分泌液,作为大量含有海藻糖的材料可以列举菌类。
本发明的组合物中也可以含有黄豆苷原。由于黄豆苷原是雌马酚的底物,因此通过与本发明的具有雌马酚转化能力的微生物或上述糖类并用,能够作为更为优异的雌马酚浓度上升剂使用。黄豆苷原可以使用合成品或来自天然的提取物等的市售品,也可以使用大量含有黄豆苷原的来自天然的材料或其加工品。具体而言,作为大量含有黄豆苷原的材料,可以列举大豆、豌豆、葛、三叶草等,作为它们的加工品,例如,可以列举豆腐、豆乳、炸豆腐、纳豆、酱油、豆酱、豆豉等。由于异黄酮糖苷通过体内的肠内细菌的作用被糖苷配基化, 因此黄豆苷原也能够作为其糖苷化合物的黄豆苷、丙二酰基黄豆苷、乙酰基黄豆苷等的形态使用。另外,也可以使用作为从黄豆苷原到雌马酚转化中的中间代谢物二氢黄豆苷原等, 本说明书的“黄豆苷原”中也包括它们的糖苷或中间代谢物。在使用含有本发明的具有雌马酚转化能力的微生物的饮食用或医药用组合物的情况的给药量没有严格限制,由于根据对象者或适用疾病等的各种使用形态所得的效果不同,因此期望设定适当的给药量。作为微生物量优选按照活菌换算为每天投与IO5个 101° 个,特别优选IO6个 IO9个。另外组合物中糖类的含量优选为0. 5 50质量%,更优选为 1 10质量%,黄豆苷原的含量按照黄豆苷原换算优选为5 2000 μ Μ,更为100 800 μ Μ。本发明的组合物能够使用口服给药或非口服给药的任一种,但优选口服给药。在给药时,能够将含有作为有效成分的具有雌马酚转化能力的微生物的组合物与适用于口服给药、直肠内给药、注射等的给药方法的固体或液体的医药用无毒性载体混合,以常用的医药品制剂的形态进行给药。作为这样的制剂,例如,可以列举片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等固型剂、溶液剂、悬浊剂、乳剂等的液体剂、冻结干燥剂等。这些制剂能够通过制剂上的常规方法进行制备。作为上述的医药用无毒性载体,例如,可以列举淀粉、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理食盐水等。另外,根据需要也能够适当添加稳定化剂、润湿剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂、赋形剂等的常用的添加剂。另外,本发明的饮食用组合物可以直接或加入各种营养成分而在饮食品中含有。 本发明的饮食用组合物能够作为使体内的雌马酚浓度上升的目的或者对于不明抱怨等的更年期症状、骨质疏松症、高血脂症、动脉硬化、乳腺癌、前列腺癌、月经前症候群等的改善、 预防等有用的保健用食品或食品材料使用,这些饮食品或其容器上也可以带有具有上述效果的说明的表示。具体而言,使本发明的组合物为饮食品时,可以适当使用能够饮食的添加剂,使用常用的方法成型为适于食用的形态,例如,颗粒状、粒状、片剂、胶囊、糊状等,另外可以添加到各种食品,例如,火腿、香肠等肉食加工食品,鱼糕、竹轮等水产加工食品,面包、 糕点、黄油、奶粉、发酵乳制品使用,也可以添加到水、果汁、牛奶、清凉饮料、茶饮料等饮料中使用。其中,饮食品也包括动物的饲料。通过使本发明的具有雌马酚转化能力的微生物与黄豆苷原作用,能够有效地制造雌马酚。具有雌马酚转化能力的微生物的形态没有特别限定,可以为活菌或加热菌体(死菌体)的任一种,或也可以是冻结干燥的菌体,能够利用培养上清等的培养物、菌体处理物等,但由于认为雌马酚转化能力通过来自细菌的酶发挥作用,因此优选以不使酶活性丧失的状态使用。由于本发明的微生物与现有公知的雌马酚产生菌相比,雌马酚转化能力非常高,因此能够高收率地以低成本制造雌马酚。具体而言,能够通过在培养基中添加黄豆苷原使其达到10 1000 μ M,以IO6 101°个/培养基· mL接种本发明的具有雌马酚转化能力的微生物,在37°C厌氧培养8小时以上,制造雌马酚。该培养基中优选添加选自核糖醇、阿拉伯糖、赤藓醇、半乳糖、乳糖醇、松三糖、海藻糖、核糖、山梨糖、木糖、肌醇和山梨醇中的1种以上的具有雌马酚浓度上升作用的糖类1 10质量%,也可以添加使用其它的氮源等适当的成分,但不优选使用抑制本发明的具有雌马酚转化能力的微生物的增殖或抑制雌马酚转化能力的成分。作为能够添加的成分,例如,可以列举蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、氯高铁血红素、维生素Kl等维生素、 L-半胱氨酸盐酸盐、KH2P04、K2HP04、NaCl、(NH4)2SO4, CaCl2,MgSO4等。在本发明的培养基中所含的成分中,具有雌马酚浓度上升作用的糖类或黄豆苷原以外的成分的组成,能够为例如PY培养基、GAM培养基、BHI培养基等的组成。作为底物的黄豆苷原可以使用合成品或来自天然的提取物等的市售品,也可以使用大量含有黄豆苷原的来自天然的提取物或其加工品。另外,黄豆苷原也可以以其糖苷化合物的黄豆苷、丙二酰基黄豆苷、乙酰基黄豆苷等的形态使用,此时也可以与本发明的微生物并用具有将异黄酮糖苷糖苷配基化作用的公知的微生物(双歧杆菌等)或酶(β_葡萄糖苷酶等)。除了通过本发明的具有雌马酚转化能力的微生物的培养以外,也能够使来自微生物的具有雌马酚转化能力的酶发挥作用。其使用方法没有特别限制,但具体而言,可以列举直接使用培养物的方法、通过离心分离或膜处理等浓缩培养物而作为培养物浓缩液或颗粒使用的方法、作为静止菌体使用的方法、作为干燥菌体使用的方法、作为菌体破碎物使用的方法、作为粗酶溶液使用的方法、作为精制酶溶液使用的方法、作为酶粉末使用的方法等。酶的精制条件、精制度没有特别限制,能够使用一般的精制方法。培养具有雌马酚转化能力的微生物之后,通过离心分离、有机膜、无机膜等的分离方法分离菌体,在培养上清中含有该酶时,能够将其回收,作为粗酶溶液。另外,在菌体内含有该酶时,能够通过均浆机或超声波处理,物理性破碎菌体,或通过使用细胞壁溶解酶等进行酶处理,得到菌体内提取液作为粗酶溶液。也可以通过适当组合硫酸铵盐析处理、透析、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、吸附色谱、亲和色谱等,作为精制度高的精制酶溶液。具有雌马酚转化能力的微生物或来自微生物的具有雌马酚转化能力的酶可以使用采用一般的固定化方法固定化的酶,作为固定化的方法,可以列举载体结合法、交联法、 包埋法等,但并不局限于此。作为载体结合法,可以列举共价结合法、离子结合法、物理吸附法,作为交联法可以列举戊二醛法,作为包埋法可以列举格子型包埋法和微胶囊型包埋法作为例子。更具体而言,可以列举使其向活性炭、锯屑等吸附的方法,与CM-纤维素、P-纤维素、DEAE纤维素、ECTE0LA-纤维素等结合的方法,通过戊二醛、甲苯基二异氰酸酯等交联的方法,通过丙烯酰胺、κ卡拉胶、褐藻酸、明胶、纤维素乙酸酯等使其包埋的方法。另外, 可以通过批式、柱式等的一般利用固定化的细菌或酶的方法使用,这些能够单次、重复或连续使用。通过上述方法制造的雌马酚可以直接使用培养上清等的含雌马酚的培养物,也可以通过柱色谱、有机溶剂提取等的常规方法从培养物中分离精制雌马酚。使所得到的培养物吸附在离子交换柱后,用甲醇使其洗脱,得到雌马酚精制物。可以与本发明的具有雌马酚转化能力的微生物的DNA和/或RNA特异性杂交的核酸片段是通过将本发明的发明人进行测序得到的Slackia sp. YIT 11861的碱基序列与数据库(DDBJ,Genbank等)比较、研究得到的。在制作本发明的核酸片段时,在其靶点使用作为系统分类的指标的可靠性高的16S rRNA基因,由于分析中需要PCR法等的方法,因此不使用RNA而用DNA。在核酸片段的设计时,对作为目标的具有雌马酚转化能力的Slackia属细菌和与其相近的菌的16S rRNA碱基序列进行序列对比。即,基于以现在的基因序列为指标的分类体系,选择属于棒状杆菌科的亲缘关系近的菌种(阿托波氏菌属、柯林斯氏菌属),进行序列对比。其结果,可以得到由序列编号1或2所述的碱基序列构成的核酸片段。作为可以与目的细菌的DNA和/或RNA特异性杂交的核酸片段,不仅是过去设计的序列,也能够基于公知的技术常识适当设计,可以列举由与该碱基序列互补的碱基序列构成核酸片段,或由与这些相同的碱基序列构成且功能上等价的核酸片段。这里,作为由与这些相同的碱基序列构成且功能上等价的核酸片段,例如,可以列举以下的(a) (c)所示的核酸片段,即能够用于目的微生物的检测、鉴定或定量的片段。(a)在由序列编号1或2所示的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段中,由缺失、取代或添加了 1或数个、优选为1到10个碱基的碱基序列构成的核酸片段。(b)由与序列编号1或2所示的碱基序列或与其互补的碱基序列具有90%以上、 优选95%以上、更优选99%以上同源性的碱基序列构成的核酸片段。(c)与由序列编号1或2所示的碱基序列或与这些互补的碱基序列构成的DNA在严格条件杂交的碱基序列构成的核酸片段。其中,这里碱基序列的同源性通过使用GENEITX(R)的同源解析程序算出。另夕卜, 作为“严格条件”,可以列举例如在含有50%甲醛、5 X SSC、5 X Denhardt溶液和250mg/mL鲑鱼精子DNA的溶液中,在42°C恒温16 M小时使其杂交的条件。
如上所述设计的核酸片段能够根据其核酸序列通过DNA合成仪人工合成。其特异性表示在下面的实施例中,对于在使用核酸片段作为引物时的18株亲缘关系相近的种类 (化石阿托波氏菌(Atopobium fosser) JCM 9981τ、小阿托波氏菌(Atopobium minutum) JCM 1118τ、极小阿托波氏菌(Atopobium parvulum) JCM 10300τ、龈裂阿托波氏菌(Atopobium rimae) JCM 10299τ、阴道阿托波氏菌(Atopobium vaginae)DSM 15^9T、产气柯林斯氏菌 (Collinsella aerofaciens)ATCC 25986τ、肠道柯林斯氏菌(Collinsella intestinalis) JCM IOM3t、粪便柯林斯氏菌(Collinsella stercoris)JCM 10641T, Cryptobacterium curtum DSM 15641T、Denitrobacterium detoxificans CCUG 47027τ、香港埃格特菌 (Eggerthella hongkongensis) JCM 14552τ、迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)ATCC 25559τ、中国埃格特菌(Eggerthella sinensis)JCM 14551T、Olsenella profusa JCM 14553T、 Olsenella uli JCM 12494T、 Slackia exigua JCM 11022τ、 Slackia faecicanis JCM 14555τ、Slackia heliotrinireducens JCM 14554τ)的扩增子的有无以及代表性肠内细菌种类和病原菌种类27株的扩增子的有无作为指标进行了确认。结果发现在特异性上没有问题。由于本发明的核酸片段对于具有雌马酚转化能力的微生物是特异性的,因此通过进行以由人或动物的粪便或消化道内容物得到的DNA或RNA为对象的PCR反应或FISH(荧光原位杂交,Fluorescence in situ hybridization)等,能够特异性检测、鉴定、定量具有雌马酚转化能力的微生物。通过定量化具有雌马酚转化能力的微生物,能够简便地研究各个人原本具有的雌马酚产生能力,能够掌握雌马酚相关的不明抱怨等的更年期症状、骨质疏松症、高血脂症、动脉硬化、乳腺癌、前列腺癌、月经前症候群等各种疾病的患病风险,能够对没有雌马酚产生能力的人或雌马酚产生能力低下的人有效地采取投与本发明的组合物等的预防对策。另外,对患有这些疾病的人中没有雌马酚产生能力的人或雌马酚产生能力低下的人,投与本发明的组合物等,也能够有助于疾病的治疗或改善。使用PCR或RT-PCR的分析方法能够通过以下进行例如(1)提取检测体中的DNA 或RNA的工序;(2)使用上述核酸片段中1个以上进行PCR或RT-PCR的工序;以及(3)检测出通过工序(2)扩增的DNA片段的工序。通过在来自检测体的模板DNA(模板为RNA时为cDNA)中组合本发明的核酸片段,进行扩增反应,能够得到对作为目标的Slackia属细菌特异性的DNA片段(PCR产物)。将这样得到的DNA进行电泳,能够从条带的有无特异地检测、鉴定作为目标的Slackia属细菌。另外,梯度稀释模板DNA或RNA(cDNA)进行PCR,还能够进行Slackia属细菌的定量化。在使用PCR进行定量时,除了上述方法,更优选使用实时PCR(Real-time PCR)的方法。经时地观察利用PCR扩增的PCR产物量,通过规定得到一定量的DNA时的PCR循环数目,能够进行检测体中的Slackia属细菌的定量。扩增的PCR产物的经时观察能够通过STOR(R)Green I等嵌入型荧光色素标记PCR 产物,通过测定各PCR阶段的荧光强度进行。由于嵌入型荧光色素具有通过嵌入双链核酸中而增加荧光强度的性质,因此能够准确地测定由目标细菌的DNA(RNA的情况为cDNA)通过PCR反应生成的PCR产物,特别优选使用STOR(R)Green I。通过特别规定达到任意设定的一定的荧光强度(DNA量)时的PCR循环次数(以下称为Ct值),能够进行检测体中的目标细菌的定量或检测、鉴定。另外,也能够通过使用由荧光色素标记的TaqMan探针或Moleculer Beacon等进行。TaqMan探针或Moleculer Beacon是使荧光色素和猝灭剂在与通过PCR扩增的区域的内部序列具有同源性的寡核苷酸结合的探针,在PCR反应中共存使用。由于通过探针结合的荧光色素和猝灭剂的相互作用,发出对应PCR扩增反应的荧光,因此能够通过测定各PCR阶段的荧光强度,进行扩增的 PCR产物的经时的观察。检测体中的作为目标的Slackia属细菌的定量或检测、鉴定能够通过由培养法等测定的细菌数的对数值和Ct值的标准曲线求出。即,预先作出以作为目标的细菌数的对数值为横轴、以Ct值为纵轴绘制的标准曲线,将PCR反应的结果所得的Ct值应用于该标准曲线,进行检测体中的作为目标的Slackia属细菌的定量或检测、鉴定。本发明的核酸片段除了在上述PCR法中作为引物使用,也能够单独作为探针使用,这些也可以与其它公知的通用引物、寡核苷酸等组合使用。作为使用本发明的核酸片段作为探针的分析方法,例如,可以列举原位杂交(in situ hybridization)、斑点杂交(dot blot hybridization)等,其中原位杂交由于不需要提取检测体中的核酸的工序作为迅速的方法而被优选,更优选使用由荧光物质标记的核酸片段作为探针的FISH。具体而言,FISH能够通过以下工序进行,(1)通过甲醛或福尔马林固定检测体的工序;(2)将固定的检测体涂抹于载物玻片或滤膜的工序;(3)通过荧光标记的核酸片段进行杂交的工序;(4)对杂交后的多余的核酸片段和非特异地结合的核酸片段进行洗净的工序;以及(5)对杂交后的结果使用荧光显微镜肉眼观察,或者通过CXD照相机等作为图像而得到的工序。在检测体中存在作为目标的Slackia属细菌时,由于与使用的核酸片段杂交,在上述杂交后的结果中信号呈阳性,因此能够特异性检测、鉴定这些细菌。另外,通过对其进行计数也能够定量化。以下,列举试验例和实施例,进一步详细地说明本发明的内容,但本发明并不受任何限制。实施例试验例1具有雌马酚转化能力的细菌的获得在玻璃珠(Φ3πιπι)存在下将健康的雌马酚产生者的新鲜粪便充分悬浊在10倍容积的厌氧状态的稀释液(KH2PO4 0. 00255%, K2HPO4 0. 00255%, NaCl 0. 006%, (NH4)2SO4 0. 00255%,CaCl2 0. 000255%,MgSO4 0. 000255%,0. 刃天青溶液 0. 1%>8% Na2CO3溶液 2.2%、L-半胱氨酸盐酸盐0.05% )中,使用灭菌纱布除去残渣。进行8000Xg、10分钟的离心分离,在相同量的相同稀释液中悬浊沉淀。以该状态在-30°C冻结保存。使用时对解冻的粪便稀释液进行8000Xg、10分钟的离心分离,对得到的沉淀悬浊在以山梨糖为糖源的PY培养基(蛋白胨0. 5 %、胰蛋白胨0. 5 %、酵母提取物1 %、氯高铁血红素0. 00005 %、 维生素 Kl 0. 0001%、L-半胱氨酸盐酸盐 0. 05%、KH2PO4 0. 0006%,K2HPO4 0. 0006%,NaCl 0. 0012%, (NH4)2SO4 0. 0006%, CaCl2 0. 00006%, MgSO4 0. 00006% )中。在 37"C、混合气体(N2 H2 CO2 = 88 7 5)存在下孵育M 48小时。对将其传代到第7代的培养物,使用相同培养基制备IO6倍稀释液。对该稀释液50 μ L,分别涂抹于20枚GAM(添加1 % 葡萄糖)的琼脂平板培养基。将其在37°C、7au厌氧手套箱内进行孵育使其形成菌落。对得到的菌落,根据从菌落性状(表面性状,大小)和革兰氏染色图像分类为沈种。将分别的代表菌落接种在含有最终浓度100 μ M的黄豆苷原的GAM (添加1 %葡萄糖)液体培养基中。 以HPLC对在37°C、混合气体(N2 H2 CO2 = 88 7 5)存在下孵育M小时的培养液测定雌马酚浓度的结果,发现了具有高黄豆苷原-雌马酚转化能力的革兰氏阳性杆菌。其中,HPLC条件按照下面的条件进行。装置LC组件(module) 1 (Waters)柱YMC-PackCN (Y. M. C 制)检测紫外吸光光度计(测定波长^Onm)柱温40°C流动相0. 甲酸溶液/乙腈/甲醇(87 3 10)混合液流量2. 5mL/min进样量10μ 1试验例2具有雌马酚转化能力的细菌的分子系统解析、生物化学性状试验将在试验例1中分离的细菌基因组作为模板,使用引物27f (序列编号3)和 1552r (序列编号 4),以 16S ribosomal RNA (16S rRNA)为目标进行 PCR,得到约 1500bp 的扩增产物。将其作为模板,进行测序PCR。在测序PCR中,使用BigDye (R) Terminator v3. 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems),基于产品手册的方法进行。测序仪使用AB 3130基因分析仪(Applied Biosystems)。在16S rRNA序列的分析系统解析和同源性分析中,使用 Clustal X vl. 83, TreeView vl. 6. 6 和 GENETIX (R) Ver. 7 (株式会社 Genetics)。 其结果表明,本菌株属于柯林斯氏菌科(图1)。Slackia exigua ATCC700122T是系统上亲缘关系最近的现存的菌种,但同源性显示较低的值(92.4%)。与专利文献3记载的Slackia spp. TM-30有99%以上的同源性,在数据库上登录的未培养菌株一起形成一个组群。由此显示本菌株和Slackia spp. TM-30是同种的可能性。对本菌株和通过16S rRNA序列分析得到的在现存种类中系统上最近的S. exigua ATCC 700122τ,使用Rapid ID 32A (SYSMEX biomerieux株式会社)研究生物化学性状。测试菌的培养中,使用GAM(添加葡萄糖)琼脂培养基,在37°C厌氧条件下培养M小时。 其中,每一个鉴定试剂盒使用2枚GAM(添加葡萄糖)琼脂培养基。对于试剂盒的测试菌液的制备、反应和判定,均按照试剂盒中的说明书进行。在表1中表示其结果。具有雌马酚转化能力的细菌在Rapid ID 32A中,显示出与S. exigua ATCC 700122τ非常不同的性状。 另外,具有雌马酚转化能力的细菌在Rapid ID 32A中,在D-甘露糖、D-棉籽糖的利用性、 对碱性磷酸酶显示阳性的发面与专利文献3记载的Slackia spp. TM-30的生物化学性状不同。因此,表明了其与已经报道的菌株不同。通过以上的分子生物学和生物化学性状试验结果,可以认为本菌株是Slackia属中所含的新型菌株,将其命名为Slackia属细菌YIT 11861 (Slackia sp.YIT 11861)。[表 1]根据Rapid ID 32A的生物化学性状的比较
权利要求
1.一种微生物,其特征在于从黄豆苷原到雌马酚的转化能力为M小时50%以上。
2.如权利要求1所述的微生物,其特征在于 其是Slackia属细菌。
3.如权利要求1或2所述的微生物,其特征在于 其来自人类粪便和/或消化道内容物。
4.如权利要求1 3中任一项所述的微生物,其特征在于 其是 Slackia sp. YIT 11861 (FERMABP-11231)。
5.一种饮食用或医药用组合物,其特征在于 含有权利要求1 4中任一项所述的微生物。
6.如权利要求5所述的组合物,其特征在于含有选自核糖醇、阿拉伯糖、赤藓醇、半乳糖、乳糖醇、松三糖、海藻糖、核糖、山梨糖、木糖、肌醇和山梨醇中的一种以上。
7.如权利要求5或6所述的组合物,其特征在于 还含有黄豆苷原。
8.—种雌马酚的制造方法,其特征在于使权利要求1 4中任一项所述的微生物与黄豆苷原作用。
9.一种核酸片段,其特征在于可以与权利要求1 4中任一项所述的微生物的DNA和/或RNA特异性杂交,由序列编号1或2所述的碱基序列或与其互补的碱基序列构成,或者由与这些相同的碱基序列构成且在功能上等价。
全文摘要
本发明涉及一种从黄豆苷原到雌马酚的转化能力为24小时50%以上的微生物、含有该微生物的饮食用或医药用组合物、利用该微生物的雌马酚的制造方法以及能够特异性检测该微生物的核酸片段。
文档编号A23L1/30GK102317435SQ20108000786
公开日2012年1月11日 申请日期2010年2月25日 优先权日2009年2月25日
发明者森山熏, 赤座英之, 辻浩和, 野本康二 申请人:株式会社益力多本社
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