干细胞免疫调节应用方法和设备的制作方法

专利名称：干细胞免疫调节应用方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗自身免疫性疾病与免疫紊乱相关疾病的通用方法和设备。
背景技术：
人类自身免疫性疾病与免疫紊乱相关疾病的患病率逐渐增长，比如心血管疾病、 糖尿病和神经退行性疾病，为寻找更加有效的治疗措施提出了严峻地挑战。干细胞治疗技术，包括胚胎和成人干细胞，为再生医学提供了根本的治疗工具，很有可能为现代治疗手段带来新的革命。因为胚胎干细胞具有很强的自我更新和多向分化的潜能，胚胎干细胞已经成为非常活跃的研究领域。然而，伦理问题已经限制了它们的可行性和实用性。撇开这些伦理问题，利用体外受精和改变细胞核转移来产生胚胎干细胞，但所需要的技术非常复杂， 也限制了其推广应用。近来，人脐血已经被作为干细胞的来源，用于重建造血系统和其它的器官。脐带血提供了丰富的干细胞来源，包括间充质干细胞和单核细胞来源的干细胞。表达胚胎干细胞分子标志的干细胞已经在去除了造血干细胞后的脐带血中被发现(包括去除了所有的白细胞共同抗原CD45阳性的细胞)。然而，此类干细胞的在脐带血中极少的含量，显著的限制了它们的实际应用。成人来源的而不是胚胎来源的，其它几种胚胎样干细胞已经被公布了。比如，美国专利号 7,045，148，美国专利申请序号 2005/0148034，2005/0118715，2004/0028660， 2003/0235909, 2002/0160510, 2003/0180269 和国际专利申请号 WO 03/068937 公布了从胎盘或从脐带血中提取出的胚胎样干细胞。美国专利申请号WO 2006/0078993公布了从脐带的羊膜分离出的胚胎样干细胞。这些专利或专利申请中发现的干细胞都来源于间充质，不表达白细胞共同抗原⑶45(^45—)。另外一个例子，美国专利申请序号2006/01474 公布了从人骨髓中分离的干细胞。赵和Mazzone的国际专利申请PCT/US06/385M公布了从脐带血中分离发现的一种胚胎样干细胞，非常适合干细胞治疗。另外，赵和Mazzone的国际专利申请PCT/US07/22260公布了从成年人外周血中分离的一种胚胎样干细胞，也非常适合干细胞治疗
发明内容
本发明揭示了利用具有胚胎样干细胞特点的干细胞，以教育自身免疫反应细胞为机制，来治疗自身免疫性疾病的方法和设备。该发明的一个方面，揭示了用于调节淋巴细胞并抑制自身反应T细胞的生物反应器，这个生物反应器包括一个培养室，这个培养室具有至少一层带正电和/或疏水性表面的基材，一群干细胞附着在基材表面，一个用于将淋巴细胞导入这个培养室的入口管道，一个用于输出经过干细胞共培养处理过的淋巴细胞的出口管道。生物反应器的基材表面由一层或多层构成。另外，这个基材表面由多个微载体构成。另外一个实施方式中，基材表面可以是一个通透性的薄膜层。在一些实施方式中，基材表面包含疏水性聚合物，如干细胞容易附着的聚苯乙烯。 在基材表面，干细胞在基材表面的贴附率至少50%、60%、70%、80%、90%，或甚至95%。 生物反应器的培养室中，优选含有至少IO6个干细胞。在一些实例中，培养室内干细胞和淋巴细胞的比率至少为1 10。生物反应器的培养室可以构建成允许干细胞和淋巴细胞之间的细胞与细胞的接触；或避免这样的细胞与细胞之间的接触，进而防止处理过的淋巴细胞离开培养室时，携带干细胞。更进一步，干细胞可以在培养室内多种基材表层上培养。干细胞可从脐带血或外周血中获得。干细胞可以是异体的，和淋巴细胞来源于不同的个体；干细胞可以是自体的，和淋巴细胞来源于同一个体。该发明的另一个方面，揭示了抑制自身免疫紊乱的系统，该系统包括用于从个体中抽出血液的流体管道，用于把淋巴细胞从抽取的血液中分离出来的血细胞单采机；和生物反应器，该生物反应器包括培养室，该培养室至少拥有一层带正电和/或疏水性表面的基材，一群干细胞贴壁附着在基材表面，一个将单个核细胞和/或淋巴细胞导入这个培养室的进口管道，和一个用于输出经过干细胞共培养处理过的单个核细胞和/或淋巴细胞的出口管道；和用于将处理过的淋巴细胞回输给个体的流体管道。生物反应器可拥有以上描述到的所有或任何一个组件、特性或功能。该发明的另一个方面，揭示了抑制由自身反应性T细胞引起的自身免疫紊乱的方法，该方法包括下述步骤从患者体内抽取血液，从抽取的血液中分离出淋巴细胞，使淋巴细胞暴露于干细胞，这样可激活调节性T细胞，进而可以抑制自身反应T细胞，并且回输至少一部分处理过的淋巴细胞到个体体内。例如，这种方法可以应用到自身免疫紊乱相关的糖尿病治疗。淋巴细胞暴露于干细胞的步骤进一步包括在反应器(或教育器)中培养干细胞， 例如使干细胞在带有正电荷和/或疏水性表面的基材表面贴壁生长，以及将个体的淋巴细胞导入反应器中进行干细胞地处理。对患者的淋巴细胞而言，该方法采用的干细胞可以是异体的或自体的。这些干细胞可以从脐带血或从外周血中获得，例如自体干细胞可从个体自己的外周血中获得。在生物反应器中培养干细胞的步骤进一步包括收集含有外周血单个核细胞的外周血；培养这些外周血单个核细胞，这样外周血单个核细胞中所含的胚胎样干细胞，通过附着在生物器的表面，被分离出来进一步生长扩增。该方法包括通过干细胞表达程序性死亡配体(PD-Ll)调控调节性T细胞(Treg)， 和/或通过干细胞释放的一氧化氮(NO)激活调节性T细胞。该方法包括，在反应器内通过调节性T细胞与干细胞的细胞与细胞之间的直接接触，和/或干细胞释放的可溶性因子的作用，活化Treg细胞。活化Treg细胞的方法进一步包括将Treg细胞暴露于干细胞，干细胞可通过表达羧肽酶M(CPM)或缓激肽Bl受体，或表达自身免疫调控蛋白 (autoimmuneregulator,AIRE)。被调节/活化的Treg细胞通过表达⑶4，⑶25，⑶62L，和⑶69标志中的至少一个来被标记，并优选表达所有这些分子标志。在一个实施方式中，在抽取患者血液和回输处理后的淋巴细胞的步骤，是一个连续的过程。例如，患者的血液连续的处理，抽取达到足够的量，至少抽取1升血液。另外一个方面，该发明揭示了从具有胚胎样干细胞的材料中，收集胚胎样干细胞的方法；干细胞在培养基中生长，干细胞还原为胚胎样干细胞；和分离胚胎样干细胞。在一些实施方式中，干细胞的生长培养基可以是有血清和无血清培养基。干细胞的生长在体外不需要滋养层细胞，在体内生长不形成畸胎瘤。干细胞的培养进一步包括，干细胞被种植在疏水性基材表面，例如聚苯乙烯或其他合适的塑料材料和玻璃。在一些实施方式中，胚胎样干细胞表达如下分子标志八聚体结合转录因子 4(0ct-4)、Nanog 同源异型盒(Nanog)、SRY (性别决定区 Y)-框 2(Sox_2)、CD9、CD45、羧肽酶M(CPM)、缓激肽Bl受体(BlR)和程序性死亡配体(PD-Ll)中的至少一种。另外一个实施方式中，胚胎样干细胞表达诱导型一氧化氮合成酶(iNOQ。另一个实施方式中，胚胎样干细胞表达自身免疫调节因子(AIRE)。另一个方面，这个发明揭示了在需要的个体中培养和调节淋巴细胞或淋巴细胞功能的方法，包括一群胚胎样干细胞和另一群包括淋巴细胞的细胞共同培养，共同培养处理后的包括淋巴细胞的细胞回输给患者。淋巴细胞(包括T淋巴细胞和B淋巴细胞)可以是异体淋巴细胞，也可以是人外周血中的自体淋巴细胞。用胚胎样干细胞培养淋巴细胞可以调节淋巴细胞。比如，调控机制可包括调节自身抗原的表达。另外一个实施方式中，胚胎样干细胞调节⑶4+，⑶62L+T淋巴细胞。这个方法包括上调一氧化氮的产生。另外一个实施方式中，这个方法可以提高自身免疫调节因子 (AIRE)的表达。另外一些实施方式中，这个方法可用于治疗、改善1型糖尿病的症状或延缓 1型糖尿病的发生。另外一个方面，这个发明揭示了治疗有需要的哺乳动物糖尿病个体的方法，包括抽取个体中至少一个自身免疫淋巴细胞；胚胎样干细胞和淋巴细胞共同培养；回输干细胞处理后的淋巴细胞到个体体内，以达到治疗糖尿病的目的。在一个实施方式中，从个体外周血中抽取淋巴细胞。采用细胞分离法可从个体中获取淋巴细胞。另外一个实施方式中，淋巴细胞是⑶4+、⑶62L+T淋巴细胞。回输的步骤可通过任何合适的方式，例如，通过静脉或动脉注射。每个个体应用细胞的数量，从IX IO4到IX IO13个不等。这种方法可以用来处理或改善胰岛素依赖型糖尿病的症状。在一些实施方式中，淋巴细胞可通过血细胞分离法从外周血中获得。另一方面，该发明揭示了干细胞与第二群细胞共培养的设备。这个设备能够实现多层干细胞的培养，并且通过每层的开口，细胞和/或液体可以从一层流到另一层。在一个实施方式中，这个设备有疏水性表面，比如聚苯乙烯或其它合适的塑料材料和玻璃。在另一个实施方式中，干细胞附着在设备的表面。这个设备还有一个输入口和输出口。第二群细胞通过输入口导入到设备中，与干细胞共培养后，通过设备的输出口流出来。这个设备可以是个封闭系统，一端连接输入口，可以不断地输入细胞；另一端连接输出口，可以把干细胞共培养处理后的第二群细胞移走，回输给患者。持续输入口，细胞可由血细胞单采机提供。 在另外一个实施方式中，持续输出口，也可连接一个细胞回输动力泵设备。这个设备可进一步设计成为，在干细胞与第二群细胞之间放置一层膜，将它们分离隔开。这个膜是个多孔膜。这个多孔膜的孔足够小以防止干细胞通过膜。在另外一个实施方式中，这个多孔膜的孔足够大，允许因子从膜的一边通过膜到另一边。在一个实施方式中，干细胞附着在这个多孔膜的一个表面。在另一个实施方式中，这些孔径的大小，不超过干细胞平均尺寸的一半。


图1是本发明提供的系统的示意图。这个系统利用具备单针操作程序的血细胞分离机MCS+，来治疗自身免疫紊乱；图2是本发明提供的系统中的干细胞生物反应器应用的示意图；图3是本发明提供的系统中的干细胞生物反应器另外一个实施方式的示意图；图4A表明了人脐带血干细胞具有低免疫原性，不能刺激同种异体的淋巴细胞增殖。图4B显示了在体外与脐血多能干细胞(或称脐带血干细胞)共培养后的 CD4+CD25+Treg, CD4+Foxp3+Treg 和 CD4+CD62L+Treg 的百分率。图4C显示了在体外与脐血多能干细胞共培养后，⑶25和R)xp3在⑶4+⑶62L+Treg 中的表达的流式分析。图4D显示了在细胞内细胞因子标记后的⑶4+CD62L+Treg的流式分析。独特型匹配的抗体IgG作为对照。图5A显示了脐血多能干细胞调控过的⑶4+CD62L+Treg细胞(mCD4⑶62L)可以纠正糖尿病NOD小鼠的高血糖。纯化的未经脐血多能干细胞处理过的⑶4⑶62LTreg作为对照组(总共5百万细胞/小鼠，腹腔注射，蓝线，η = 5只小鼠)。PBS作为一个另外的对照组(黑线，η = 5只小鼠)。图5Β显示了采用mCD4⑶62LTreg第一次治疗3周后，腹腔糖耐量测试(IPGTT)结果。七周龄的NOD小鼠作为正常对照。图5C显示了用酶联免疫法(ELISA)测定血中胰岛素水平的结果。图5D显示了对小鼠体重的治疗效果。图5E显示了胰岛β -细胞总量形态定量分析。胰岛β -细胞总量的形态定量分析，先采用豚鼠抗胰岛素抗体(Dako公司)进行免疫组化染色，并用苏木素进行负染，利用对胰岛β细胞进行定点计数分析。图5F显示了 Ki67阳性的胰岛β细胞。采用细胞增殖分子标志Ki67和胰岛素抗体进行双染色后，计数Ki67-阳性细胞在胰岛中的数量。独特型匹配的兔IgG作为抗-Ki67 的对照。图6A显示了采用mCD4⑶62LTreg治疗糖尿病NOD小鼠，可以纠正胰岛的炎症和免疫功能紊乱。用mCD4⑶62LTreg治疗可以纠正明显的1型糖尿病NOD小鼠的胰岛炎症。
图6B显示了不同类型的胰岛炎症的典型图像。资料来源于mCD4⑶62LTreg治疗过的糖尿病NOD小鼠。比例尺，50 μ m。图6C显示了 6周龄的小鼠血浆干扰素(IFN- y )水平的测定结果。采用ELISA法检测。图6D显示了血浆白细胞介素-4(IL_4)水平的测量结果。采用ELISA法检测。图6E显示了血浆白细胞介素-IO(IL-IO)水平的测定结果。采用ELISA法检测。图6F显示了血浆转化生长因子- β 1 (TGF-β 1)水平的测定结果。采用ELISA法检测。图7显示了采用mCD4⑶62LTreg治疗后，增加TGF-β 1在胰岛局部的表达，导致浸润的免疫细胞发生凋亡。图8显示了脐血多能干细胞和糖尿病人来源的淋巴细胞共培养的结果。脐血多能干细胞和淋巴细胞以1 10的比率，淋巴细胞可经过10 μ 1/ml丝裂原PHA刺激或不刺激。 24小时后，收集悬浮的淋巴细胞作流式分析(A和B)。图8A显示细胞内细胞因子标志分析。图8B显示细胞内Foxp3标志分析。图8C显示细胞的增殖实验。1型糖尿病病人中分离的GAD特异的⑶4+T细胞克隆， 经过抗原提呈细胞(APC)和特定的GAD肽或非特异性的胰岛素原肽的刺激，与脐血多能干细胞共培养三天后，收集细胞检测；图9A显示了脐血多能干细胞表达CPM、B1R和iNOS。独特型匹配的IgG作为免疫组的对照。放大倍数，χ 400 ；图9B和9C显示了定量动态检测NO的产生；图9D显示了在CPM抑制剂MGTA(IOyM)和BlR拮抗剂DALKD O μ M)作用下，脐血多能干细胞的共培养对丝裂原PHA刺激的淋巴细胞的抑制作用。图IOA显示了定量PCR分析Aire基因的表达，随后采用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。图IOB免疫细胞化学显示了转录因子Aire的表达。独特型匹配的IgG (左侧)作为AIRE染色(右侧)的对照，放大倍数x200。代表性数据来源于8个脐血多能干细胞样
P
BFI ο图IlA蛋白质印迹(Western blot)显示了 Aire siRNA的剂量反应。阴性对照 40nMsiRNA作为对照。图 IlB Western blot 显示了三组 Aire-特异的 siRNA(PI，P2and P3)使 AIRE, CPM和PD-Ll表达的蛋白的水平显著下降。β -actin作为内参对照。图IlC显示了 Foxp3表达的流式分析结果。脐血多能干细胞和成人外周血来源的淋巴细胞，以1 10的比例进行共培养50nMAire siRNA处理的脐血多能干细胞组，和阴性对照(NC) siRNA处理的脐血多能干细胞组作为对照。淋巴细胞采用PHA刺激。作用M小时后，收集细胞做流式分析。图12是本发明的提供的系统中的干细胞生物反应器应用的示意图。
具体实施方式
本发明揭示了一种新的使用干细胞的方法和设备。这些干细胞可以来源于脐血或外周血(但不是间充质)。这些细胞可用简单的技术进行分离和扩增。这个发明特别有用的一方面就是这些细胞可从个体，特别是成人个体中分离出来，进行自体干细胞治疗，或者这些细胞可从另外个体中分离进行非自体干细胞治疗。本发明也揭示了干细胞在调控单个核细胞功能方面的应用，比如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)和粒细胞。在优选的实施方式中，这些干细胞具有如下特征，包括但不仅限于如下特征，表达干细胞标志Oct-4、Nanog和Sox_2，和其他的胚胎干细胞相关的基因，例如锌指(Zinc finger)和 SCAN 域包含 10 (SCAN domain containing 10) (ZNF206，也叫 MCAm0)，Zic 家族成员 3 异位(Zic family member 3heterotaxy，ZIC3)，Zic 家庭成员 2(ZIC2)，生长相关蛋白 43(GAP43)，PR 域包含 14(PR domain containing 14，PRDM14)，蛋白质酪氨酸磷酸酶， 受体型，Z多肽(PTPRZl)，足细胞标记蛋白样(Podocalyxin-like，P0DXL)，多聚同源异体 1 (polyhomeotic homolog 1，PHC1)，锌指蛋白 589(ZNF589)，羧肽酶M(CPM)，缓激肽B1受体 (BlR) (SEQ ID NO 1)和程序性死亡配体(PD-Ll)。另外一个实施方式中，胚胎样干细胞表达诱导型一氧化氮合成酶(iNOQ。在另一个体实施方式中，胚胎样干细胞表达自身免疫调节因子(AIRE) (SEQ ID NO :2)。0ct_4、Nanog 和 Sox_2 的序列可分别在 GenBank 登入 Nos. NM-002071, Zl 1898 和 Q01860 ；GenBank 登入 Nos. NM-024865 和 NP-079141 ；和 GenBank 登 Λ Nos. Z31560 和 CAA83435 后看到。在另一个实施方式中，脐血多能干细胞也具有造血细胞的特征，如表达白细胞共同抗原⑶45。更进一步的实施方式中，脐血多能干细胞不表达⑶3、⑶20(B淋巴细胞表面抗原 Bl，登入 No. M27394)，CDl Ic (整合素，alpha X，登入 No. NM-000887)，CDl lb/Mac-1 (补体成分 3 受体 3 亚基，登入 No. NM-000632)和 CD14(登入 Nos. NM-001040021 和 P08571) 标志。另外一个体现，脐血多能干细胞不表达⑶34标志(造血祖细胞抗原⑶34，登入 No. P28906)。这项发明也揭示了脐血多能干细胞在对自身免疫紊乱和疾病的发病进行预防或推迟和/或逆转或治疗方面的作用，比如糖尿病(包括1型、1.5型和2型)。就像例子中显示的，通过与脐血多能干细胞共培养后，多种T淋巴细胞可被分离和回输给患者，进而可以预防或推迟和/或逆转或治疗自身免疫紊乱和疾病的发病，比如糖尿病。例如，对CD62L 标志(记忆淋巴细胞的标志)阳性的T细胞可被分离出来。⑶4+⑶25+⑶62L+⑶69+T细胞可显著推迟和预防高危病人发生糖尿病。例如， ⑶4+⑶25+⑶62L+⑶69+T细胞的应用，显示可调节糖尿病NOD小鼠的自身免疫应答的启动阶段，并且能显著推迟糖尿病的发生。当⑶4+⑶25+⑶62L+⑶69+T细胞其中任何一种应用之后，自身免疫紊乱或疾病，比如糖尿病，可被逆转，使血糖恢复正常。本发明更进一步揭示了采用胚胎样干细胞，进行干细胞的治疗所使用的方法和设备。在一个实施方式中，干细胞用来治疗哺乳动物个体的自身免疫疾病和免疫紊乱相关的疾病，比如糖尿病。在另外一个实施方式中，本发明揭示了至少对一种自身免疫淋巴细胞进行免疫调节的方法。这个方法包括提供成人外周血的样本；从样本中提取淋巴细胞；用干细胞对淋巴细胞进行共培养；从共培养物中收集淋巴细胞，然后把淋巴细胞回输到病人体内。干细胞能够附着在生物反应器的表面。此外，这些干细胞不需要细胞饲养层。本发明适合基于干细胞的共培养疗法，自体和非自体细胞疗法。调节性T细胞在保持内环境稳定和自身耐受方面发挥着关键作用，通过对自身反应性效应T细胞的抑制作用，比如释放免疫抑制性细胞因子白细胞介素-10 (IL-10)和/或转化生长因子-β KTGF-β 1)。越来越多的证据表明Tregs异常，不管是在数量还是功能方面，都和自身免疫疾病的发生和发展有关，比如糖尿病。通过调控Tregs来治疗自身免疫疾病是个新型方法。有限的研究把重点放在修复受损的Tregs功能，以保护机体，抵抗自身免疫疾病和糖尿病。干细胞，就像此发明揭示的，能纠正Tregs的功能缺陷，进而逆转明显的自身免疫疾病，比如糖尿病。一个方面，本发明的干细胞可与T淋巴细胞进行共培养，从而提高多种T细胞亚群的产生，进而来预防、推迟、治疗和/或降低糖尿病的发生。在一些实施方式中，共培养过的淋巴细胞回输给病人可以推迟、降低或改善自身免疫紊乱，比如糖尿病的发病。在另外一些实施方式中，共培养过的淋巴细胞包括至少一种⑶4+⑶25+⑶62L+⑶69+Τ细胞。在一些实施方式中，T细胞可以是⑶62L显阳性，和⑶69或⑶4中的至少一个显阳性的T细胞，能够降低至少一种自身免疫紊乱，比如糖尿病的症状，或改善病人的紊乱。例如，共培养过的淋巴细胞可用于患者，其中所述患者血糖水平被降到正常范围。在一些实施方式中，共培养过的淋巴细胞可以在体外可用淋巴细胞生长因子对其进行扩增。大量的生长因子可用来扩增共培养过的淋巴细胞或共培养过的淋巴细胞的特定亚群(例如，⑶4+⑶25+⑶62L+⑶69+Τ 细胞)。I.定义这项发明中所使用的术语，一般地说，期望采用标准的术语、已经被分子生物学领域具有普通技能的人广泛接受的标准定义。除少数例外，如下面列出，在该项发明范围内的被进一步明确了。如此处所用的，术语“胚胎干细胞”指的是囊胚(例如，一个4-7天大的人胎儿)中的卵黄囊内细胞团来源的一种干细胞，具有多潜能。术语“胚胎样干细胞”，“干细胞，”“脐血多能干细胞(CB-SC) ”，“脐带血来源的胰岛素产生细胞(CB-IPC) ”，“外周血干细胞(PB-SC) ”，和“外周血来源的胰岛素产生细胞(PB-IPC) ”在此处交替使用，指不是从囊胚中的卵黄囊内细胞团来源的一种干细胞。胚胎样干细胞是多能的。胚胎样干细胞展现胚胎干细胞和造血细胞特征中的至少一个。术语“干细胞”指的是一种能够无限期扩增的细胞， 能够形成组织和器官的特定细胞。干细胞是一种发育多能或多能的细胞。干细胞可以分裂产生两个子细胞，或一个子干细胞和一个祖(“中转”)细胞，然后增殖分化为成熟的组织细胞。此处用到的“干细胞”包括“祖细胞”，除非另有说明。如此处所用的，术语“多能的”，“多能分化”，“多能性的”指细胞具有多能性标志， 比如但不限于Oct-4、Nanog和Sox_2显阳性，并且在适当地刺激下比如利用适当的生长因子，细胞有潜能分化成哺乳动物约260中细胞类型中的至少一种。如此处所用的，术语“全能细胞”指一种能够形成完整胚胎(比如，囊胚)的细胞。术语“个体”指的是任何一个活着的具有免疫应答的生物体。这个术语指一个活的需要做治疗的活体动物或人，或者易受不必要或不良微生物影响的状态，或体内具有不需要的致病细胞需要接受特殊治疗。术语“个体”包括，但不限于，人类，非人类灵长类动物比如黑猩猩和其他的类人猿和猴种；农场的家畜比如牛、羊、猪、山羊和马；家庭哺乳动物比如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物比如小鼠、大鼠、豚鼠和类似物。这个术语没有特殊的年龄或性别限制。因此，成年的和刚出生的个体，以及胎儿，不管是雄性还是雌性的，都应该覆盖在内。在优选的实施方式中，个体是个哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。在大多数的实施方式中，个体指的是人。术语“未分化的”被用在这里，指的是多能的胚胎干细胞还没有定向发育为具有一定特征的细胞。这个领域中的技术人员将会认为，术语“未分化的”和“分化的”是相对的。 “分化的”干细胞具备更特定细胞的特征。未分化的和分化了的细胞通过公认的既定标准， 可以相互区别，包括形态特征比如相对大小和形状，核/浆的比值；可检测到已知的分化标志的存在。说明细胞已分化或未分化的分化标志，可以具体是细胞的蛋白质、碳水化合物、 脂肪、核酸、功能特征和/或形态特征，这些对分化的细胞是特异的。如此处所用的，术语“大量同质性”当用到细胞身上时，指的是一群细胞，其中至少有70 %，优选80 %，更优选90 %的细胞属于相同的细胞类型。细胞类型包括，但不限于，胚胎样干细胞，β细胞样胰岛素产生细胞，神经元细胞，心肌细胞，巨核细胞，内皮细胞，上皮细胞，红细胞，淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，粒细胞，肝细胞，肾原性细胞，成脂细胞，成骨细胞，破骨细胞，肺泡细胞，心脏细胞，肠细胞，肾细胞，视网膜细胞和类似物。在一些实施方式中，术语“大量同质性”描述一群细胞，其中至少有70%，优选80%，最优选90%的细胞是未分化的。更进一步的实施方式中，大量同质性的细胞中95%以上的细胞是未分化的。另外一个实施方式中，大量同质性的细胞中90%以上的细胞是未分化的。可以通过一个或多个分化标志来检测细胞以确定这些细胞是不是大量同质性的。产生和/或维持大量同质性的胚胎样干细胞和/或一种分化了的细胞类型是否具有大量的同质性，可通过检测未分化的和/或已分化的细胞的特殊标志来评估。例如，未分化细胞标志比如0ct4，神经前体细胞的标志比如nestin和Ngn_3，成熟神经元的标志比如 β-微管蛋白(β-tubulin)和ΤΡΗ2的转录产物的相对比率，可采用定量RT-PCR来检测。 另外，未分化细胞标志的产生和定位，可通过免疫细胞化学来检测。未分化的干细胞和已分化细胞的标志，可通过多种方法来检测，比如以抗体为基础的检测技术，利用一个特定标志的特异性抗体。抗体技术包括免疫荧光和免疫印迹。进一步的检测包括，检测编码特定标志的mRNA。这样的检测包括聚合酶链反应，印迹杂交(也叫做Northern印迹法)和原位杂交。这些和其他检测的细节在此处和标准参考中将会进行描述，包括J. Sambrook和D. W. Russell，分子克隆一本实验室手册，冷泉港实验室出版社； 第三版，2001 ；F. M. Ausuble, Ed.，分子生物短期协议，当前协议；第五版，2002 ；和E. Harlow 和D. Lane，抗体一本实验室手册，冷泉港实验室出版社，1988。如此处用到的，术语“淋巴细胞”和“白细胞”互换使用，通常指的是造血、单个核细胞，包括但不限于，白细胞，T细胞和B细胞，T淋巴细胞，效应性T细胞，Treg细胞，未成熟的T细胞，B淋巴细胞，未成熟的B细胞，成熟的B细胞，抗原提呈细胞，记忆性B细胞。如此处用到的，术语“培养基”通常指培养活细胞所用的任何物质或制剂。“细胞培养”指的是细胞在体外的生长。尽管这些细胞能够增殖，但不能形成组织。如此处用到的，术语“治疗(treat)”，“治疗(treating) ”，“治疗(treatment)，， 和类似语指的是减轻或改善纠正紊乱和/或相关的症状。尽管不排除，治疗紊乱或状况，不需要紊乱、相关的状况或症状完全消除。如此处用到的，术语“防止(prevent)”、“防止 (preventing) ”、“防止(prevention) ”和类似语包括“预防性治疗”指的是在没有紊乱或症状出现之前，针对这些高危人群进行治疗，可降低这种紊乱或状况出现的可能性。术语“实施”或“回输”在全文中应用，按照该发明用于特指胚胎样干细胞输送到个体体内的过程。胚胎样干细胞可通过多种方式进行实施，包括肠外(这个术语包括静脉和动脉和其他合适的肠外途径)，鞘内，脑室，脑实质(包括进入到脊髓，脑干或运动皮层)，脑池内的，头颅内的，纹状体内的和黑质内的，等等其他途径，可允许细胞潜移至需要的位置。 根据这个发明，这个细胞组分可在没有用诱导剂处理之前使用(“未处理”，没有进一步处理，未使干细胞定向分化)，或用诱导剂或其它药物诱导处理后使用(“处理”)，可以促使胚胎样干细胞定向分化成，具有特异表型的细胞。实施途径通常取决于治疗的疾病或状况，最好选择通过肠外途径，例如，静脉注射，通过实施进入脑脊髓液或者直接实施进入大脑或其他部位受影响的组织。例如，对于糖尿病而言，最好的实施途径是通过导管进入胰腺，或静脉注射途径，让细胞通过循环系统潜行归巢至受影响的部位。术语“自身免疫紊乱”和“自身免疫疾病”在全文中应用，属于同义词用来描述有自身免疫表现的疾病，比如艾迪生(Addison)疾病，自身免疫溶血性贫血，自身免疫甲状腺炎，克隆氏(Crohn)病，糖尿病(1型)，毒性弥漫性甲状腺肿疾病，格林-巴利综合征，系统性红斑狼疮(SLE)，狼疮性肾炎，多发性硬化症，重症肌无力，银屑病，原发性胆汁性肝硬化， 类风湿关节炎和葡萄膜炎，哮喘，动脉粥样硬化，1型糖尿病，银屑病和各种过敏。术语“免疫紊乱相关的疾病”在全文中应用，用来描述免疫紊乱参与发病过程的疾病，比如2型糖尿病，肥胖，心血管疾病，高血压，高脂血症，慢性肾脏病，原发性肾小球肾炎，紫癜性肾炎，狼疮性肾炎，糖尿病肾病，糖尿病足，糖尿病眼病。术语“移植物(grafting)” 和“移植(transplanting) ” 和“移植物(graft)，，禾口 “移植(transplantation) ”在全文中应用，按照本发明用来描述胚胎样干细胞或其它细胞， 被释放到能够发挥良好作用的位置的过程，比如治疗自身免疫性疾病和治疗糖尿病。本发明中使用的胚胎样干细胞或其它细胞也可以通过以上所描述的任何方式，实施到身体的边远部位，依靠细胞的潜行能力，迁移至身体合适的部位，实现移植的效果。术语“本质上”用来描述一群细胞或一个方法至少90%有效，优选至少95%，甚至更优先至少98%有效。因此，说一种方法“本质上”消除了一个某一指定的细胞群，应该消除至少90%的靶细胞群，最好的能消除98%的细胞群。在某些实施方式中，胚胎样干细胞本质上是没有造血干细胞(如造血干细胞的标志⑶34显阴性)，本质上没有淋巴细胞(如淋巴细胞的标志⑶3，⑶20和⑶90均显阴性)，本质上没有单核细胞/巨噬细胞抗原⑶1 Ib/ Mac-I和⑶14，本质上没有树突状细胞抗原⑶11c，并且本质上没有间充质细胞(⑶45_)。术语“非致瘤”指的是细胞不会引起恶性肿瘤或肿瘤。本发明使用的胚胎样干细胞，不能形成恶性肿瘤和癌症。II.干细胞的分离方法本发明揭示了从脐血和外周血中，分离出来的一群干细胞的应用。在此处命名为 脐血多能干细胞(CB-SC)或外周血干细胞(PB-SC)。如此处用到的，术语“脐带血”和“脐血”可以通用。根据本发明中的方法，干细胞在和淋巴细胞群共培养的过程中，干细胞是贴壁的细胞群。淋巴细胞来源于成人外周血。淋巴细胞也可以是，但不限于，脐带血，骨髓细胞，脾细胞，胸腺细胞，淋巴结，脂肪组织和肝细胞。淋巴细胞可在血清含量非常低的最基本的细胞培养基中共培养，(例如，7%的胎牛血清)，或无血清培养基并且无细胞滋养层的情况下对淋巴细胞进行共培养。干细胞可以贴附在带正电的表面。表面也可以是疏水表面，例如， 聚苯乙烯和玻璃。本发明中“分离”的意思是指干细胞或淋巴细胞与其它细胞分开，比如在脐带血中或外周血中发现的红细胞和其它不贴壁的单个核细胞，可以通过一种或多种方法分离开来，比如但不限于，机械分离或选择性培养。其它细胞类型也许会在第二细胞群中出现，也许在共培养过程中或在收集过程中被去除。优先的体现，第二细胞群由多于50%的单个核细胞组成。在一个优选的实施方式中，第二细胞群由多于75%的单个核细胞组成。在另一个进一步的优选实施方式中，第二细胞群由多于90%的单个核细胞组成。在另外一个实施方式中，第二细胞群从成人外周血中去除红细胞、骨髓细胞、脾细胞、胸腺细胞、淋巴结、月旨肪组织和肝细胞后，至少有50%的单个核细胞。III.干细胞的特征描述干细胞适合做干细胞治疗的关键特点之一是它的增殖能力。如此处用到的，术语 “增殖能力”指的是细胞表达一个或多个自我更新的标志，比如但不限于Nanog，和这种细胞能增殖。更好的是，这种细胞能够无限期的增殖。目前揭示的“增殖”的意思是这种细胞可以生长，并且在培养后可以成倍的增加数量。术语“增殖”和“扩增”在此处可通用。没有被任何具体理论所限定，干细胞的低免疫原性有助于调节免疫细胞，比如T 淋巴细胞。在免疫细胞和干细胞的共培养之后，免疫细胞产生的炎性细胞因子减少了，比如减少至少2-3倍，其它的细胞因子的产生可能会增加，比如TGF-β 1可增加了 2-3倍。通过干细胞的共培养可以减少的炎性细胞因子包括TNF-α，IL-I β，IFN- y , IL-15，IL-17， IL-18，ILl β，IL-21，IL22，IL-23，IL-4，IL-5和IL-6。干细胞和免疫细胞共培养时，可以降低刺激的免疫细胞的比例，比如⑶8+Τ细胞和IL-2刺激的⑶4+⑶25+调节T细胞，同时使其它的免疫细胞正常化，比如⑶4/⑶8比率。⑶69分子，活化的T淋巴细胞表面表达的负调控分子，通过干细胞共培养后也可以增加在免疫细胞上的表达，比如⑶4+和⑶8+Τ淋巴细胞。另外，干细胞可以抑制刺激的免疫细胞的增殖，比如IL-2和/或PHA刺激的淋巴细胞。干细胞和淋巴细胞之间通过细胞与细胞的直接接触，可以介导抑制作用。干细胞和淋巴细胞之间的作用，可通过干细胞和/或淋巴细胞表面的受体直接发生相互作用。这样的受体包括，但不限于，缩肽酶M(CPM)，缓激肽Bl受体(BlR)和程序性死亡配体 (PD-Ll)。干细胞分泌的可溶性因子，比如一氧化氮(NO)，也可以调解抑制作用；该机制通过有力的一氧化氮合酶抑制剂(N-omega-L-arginin^L-NNA)阻断实验证明。此外，机理研究表明脐血多能干细胞产生的一氧化氮有助于脐血多能干细胞(CB-SC)对调解T淋巴细胞进行调节。脐血多能干细胞产生的一氧化氮对淋巴细胞DNA甲基转移酶活性的表观遗传调控，可被特异的诱导型一氧化氮合酶抑制剂1400W显著抑制。IV.治疗方法糖尿病已成为主要的健康问题。胰岛素产生细胞的缺乏是1型和2型糖尿病的关键问题。干细胞来源的胰岛素产生细胞可以为治疗提供根本的工具。这个治疗成功的关键是找到一种来源方便、容易选择、培养、扩增和分化的细胞，并且没有伦理问题和免疫排斥。 胚胎和成人干细胞可以作为临床治疗应用的潜在来源。然而，由于人体免疫系统的监视作用，免疫系统可以识别并攻击任何外来细胞，即使是同种异体的胚胎干细胞的应用。因此， 应用自体干细胞是个潜在的很有吸引力的策略。越来越多的证据显示人骨髓和外周血可作为提供自体干细胞的有价值的来源，包括CD34+造血干细胞，间充质干细胞和单核细胞来源的干细胞。本发明揭示了在哺乳动物个体中预防和治疗自身免疫疾病的方法。自身免疫功能紊乱可以是下属疾病的任何一种，包括艾迪生疾病，自身免疫溶血性贫血，自身免疫甲状腺炎，克罗恩病，糖尿病(1型)，毒性弥漫性甲状腺肿疾病，格林-巴利综合征，系统性红斑狼疮(SLE)，狼疮性肾炎，多发性硬化症，重症肌无力，银屑病，原发性胆汁性肝硬化，类风湿关节炎和葡萄膜炎，哮喘，动脉粥样硬化，1型糖尿病，2型糖尿病，银屑病和各种过敏都属于自身免疫紊乱。自身免疫疾病的其中一个例子就是1型糖尿病。在一个实施方式中，单个核细胞，比如淋巴细胞和单核细胞，从个体中获得。单个核细胞也可以是但不限于，骨髓细胞，脾细胞，胸腺细胞，淋巴结，脂肪组织和肝细胞。作为临床应用，单个核细胞可从个体外周血中获得。单个核细胞可用干细胞进行处理，像上述所揭示的，将单个核细胞和干细胞进行共培养，以获得多种干细胞处理过的单个核细胞。在共培养过程中，干细胞对单个核细胞发生直接作用，以调节它们的功能。调节功能可通过但不限于以下方式来评定，细胞膜表面标志在静息或活化的状态下，表达水平的改变(升高或降低)，和与细胞静息或活化或死亡状态相关的基因表达的改变(升高或降低)。经过干细胞的调节后，单个核细胞可降低对自身抗原的自身免疫反应。共培养后，干细胞处理过的单个核细胞就可以收获了。干细胞处理过的单个核细胞被回输到个体体内， 以预防或治疗自身免疫疾病。更好的是，干细胞处理过的单个核细胞在实施进入个体之前， 经过共培养后可被收集。另外一个实施方式中，干细胞处理过的单个核细胞，经过共培养处理后，收集的细胞可同时被实施进入个体体内，发挥治疗作用。在一个方面，该发明揭示的这个方法用来预防或治疗哺乳动物个体的自身免疫疾病，包括在一个持续、封闭的系统中，从至少包含一种单个核细胞的个体外周血中移走单核细胞，将单个核细胞和干细胞进行共培养，据此至少一种淋巴细胞与干细胞进行了共培养， 收获共培养后的单个核细胞，其中至少包含一种经过干细胞处理的淋巴细胞，实施共培养过的单个核细胞，其中至少包含一种干细胞处理过的淋巴细胞回输到个体体内。单个核细胞可以是，但不限于，淋巴细胞，T淋巴细胞，⑶4+⑶25+⑶62L+⑶69+T淋巴细胞，B细胞，效应性T细胞，Treg细胞，未成熟的T细胞，B淋巴细胞，未成熟的B细胞，成熟的B细胞，记忆 B细胞，粒细胞，单核细胞，树突状细胞和其它的抗原提呈细胞。这个持续、封闭的系统可利用血细胞单采机从个体外周血中获得，并从个体外周血中分离出单个核细胞和淋巴细胞。单个核细胞至少包含一种淋巴细胞。个体的外周血被抽取，在血细胞分离机中外周血的血浆和红细胞与单个核细胞分离，单个核细胞被转移至干细胞生物反应器设备中，接受干细胞的共培养处理，而血浆和红细胞被直接回输到个体体内。单个核细胞进入干细胞生物反应器设备中，与干细胞共培养，通过下述方式实现含有单个核细胞的液体(如生理盐水)可在干细胞上流过。单个核细胞可通过重力作用或动力泵从共培养体系中被移走，并回输到个体体内。
另外一个实施方式中，本发明揭示了免疫调节至少一种淋巴细胞的方法。这个方法包括提供一个成人外周血的样本；从样本中移走红细胞获取单个核细胞；用干细胞对单个核细胞进行共培养；从共培养物中收获单个核细胞，并将其回输到个体体内。目前的发明适合以干细胞为基础的共培养疗法，自体的和非自体的细胞疗法。干细胞与单个核细胞和/或淋巴细胞共培养可以激活单个核细胞和/或淋巴细胞。激活是单个核细胞和/或淋巴细胞形态和功能方面的转变，这可以诱导和细胞激活相关的特定基因的合成，比如但不限于CD69，CD100，淋巴细胞增殖增强因子，胸腺细胞激活因子，CD223等。激活也可能诱导单个核细胞和/或淋巴细胞进入细胞周期。激活也可能诱导单个核细胞和/或淋巴细胞的增殖。这个发明的另一个方面，干细胞在与单个核细胞和/或淋巴细胞进行共培养之前，干细胞贴壁生长，其百分率至少40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%和。一个实施方式中，干细胞与单个核细胞和/或淋巴细胞至少以1 2的比率进行共培养。一个实施方式中，干细胞与单个核细胞和/或淋巴细胞至少以1 5的比率进行共培养。一个实施方式中，干细胞与单个核细胞和/或淋巴细胞至少以1 10的比率进行共培养。一个实施方式中，干细胞与单个核细胞和/或淋巴细胞至少以1 20的比率进行共培养。一个实施方式中，干细胞与单个核细胞和/或淋巴细胞至少以1 50的比率进行共培养。一个体现，干细胞与单个核细胞和/或淋巴细胞至少以1 100的比率进行共培养。V.设备图1说明整个治疗系统10 按照治疗自身免疫紊乱的发明，通过流体管道12从个体2中抽取血，同时还有血细胞单采机14，干细胞反应器16和一个流体回输管道18。在使用时，利用血细胞单采机中的血流动力学泵，经血液流体管道12从个体中抽取血液，利用单采机14处理来分离血液中的淋巴细胞。血液通过流体回输管道18回输到病人体内。分离的淋巴细胞被输送到干细胞反应器(“干细胞教育器”)16中，在反应器16中大部分淋巴细胞通过与干细胞相互作用被修饰。还有一个体现，干细胞可激活Treg细胞，从反应器16 中Treg细胞经过干细胞的处理修复后，通过液体回输管道18回输到个体体内。图2是本发明所述干细胞反应器20的示意图，反应器包括培养室22，流体入口 23，多个基材表面层M，可以种植干细胞26.层与层之间的通道25，允许淋巴细胞沿着流动途径27，从入口 23流向出口四。在使用中，淋巴细胞从血细胞单采机分离后，送入培养室 22，开始接受干细胞的调节/激活。经过一段合适的时间后，活化的Treg细胞(和/或经过调节的其它淋巴细胞，如果有)被从反应器中移走，然后回输到个体体内。图3是干细胞反应器30的另一种实施方式的示意图该设计方案把淋巴细胞和干细胞36机械性分开，没有直接接触。干细胞反应器30包括培养室32，容纳有培养的干细胞。这个培养室有入口 34和出口 35，用来作为干细胞培养基的循环供给。在这个培养室内是一个或多个通道37，由通透性的膜把淋巴细胞和干细胞隔开，干细胞36可以在这个培养室内随处生长，例如可在管状膜37外面生长，与淋巴细胞隔离。在使用时，如同专利声明1 所述淋巴细胞从血细胞单采机分离后，通过流体管道31被送到培养室32，然后通过流体管道39被移走。当在培养室内时，某些淋巴细胞被干细胞调节/激活。经过一段合适的时间后，活化的Treg细胞(和/或经过调节的其它淋巴细胞，如果有)被从反应器中移走，然后回输到个体体内。
大量事例证明了由于调节T淋巴细胞(Tregs)的内在缺陷，导致了自身免疫性1 型糖尿病的发生和发展。因此，通过对Treg淋巴细胞的调控，已成为一种成功的预防和治疗自身免疫紊乱的免疫疗法，日益引人注目，成为研究焦点。利用干细胞，比如脐血多能干细胞或外周血干细胞，能通过整体调控基因表达谱，来纠正Treg淋巴细胞的功能缺陷，进而逆转明显的自身免疫功能紊乱。尤其是，淋巴细胞和干细胞的共培养治疗，不仅仅去除了自身免疫。整个过程是简单、安全并且经济有效的。因此，该发明所揭示的方法和设备对糖尿病和自身免疫疾病的临床治疗，有深远的影响，为利用干细胞调节的淋巴细胞来逆转人类疾病的新型疗法，开辟了道路。目前这个发明更进一步揭示了以干细胞为基础的疗法所用的设备包含本发明中的干细胞。一个体现，本发明的干细胞用来治疗哺乳动物个体自身免疫疾病和免疫相关的疾病，比如糖尿病。这个设备是个生物反应器，用来抑制自身反应的淋巴细胞。生物反应器包括一个至少为正电基材表面的培养室。一群干细胞可以附着在这个基材的表面。这个表面可以是多种形式，如一片层形式，多个微载体和一个半透膜表层的形式。这个基材表面还能包括疏水物质，比如干细胞可以附着的聚苯乙烯或玻璃。一个体现，这个培养室有多个基材表层。 一个体现，这个室有至少两个表层，和多达35层或之间的任何数。这个室也可以允许干细胞和单个核细胞/淋巴细胞发生相互作用。这个相互作用可以是通过细胞与细胞间的接触。相互作用也可以通过从一种细胞释放可溶性因子到另一种细胞。这个室也可以防止干细胞和单个核细胞/淋巴细胞之间的细胞与细胞间的接触。 多孔膜可用来提供干细胞和单个核细胞/淋巴细胞之间的屏障，允许可溶性因子通过这个膜，但不允许细胞通过。这个多孔膜的孔径足够小以防止细胞、干细胞、经过共培养的细胞群、淋巴细胞、T细胞穿过到膜的另一端。另外一个体现，这个多孔膜的孔足够大允许干细胞释放的因子、生长因子、细胞因子从膜的一端传向另一端。一个体现，干细胞附着在多孔膜的表面。另外一个体现，这个孔径尺寸小于干细胞平均尺寸的一半大。生物反应器还包括一个进口管道，将淋巴细胞导入这个室。这个进口管道允许细胞群通过进口流入到生物反应器中。生物反应器还包括一个出口管道，从室中提取经过处理的、共培养的淋巴细胞。重力和/动力泵可以使细胞群从进口管道传向出口管道。生物反应器还包括一个干细胞的培养室。干细胞可以种植在这个室的基材表面。 此外，干细胞呈现的浓度至少为IO7细胞。干细胞存在的数量也可以至少104、105、105、106、 IO7, ΙΟ8、109、101°细胞。一个体现，干细胞在基材表面贴壁生长至少为40 %、50 %、60 %、 70 %、80 %、85 %、90 %或95 %。干细胞也可以在生物反应器中生长以获得最佳的贴壁率。 另外一个体现，干细胞在基材表面生长，贴壁率至少为40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、85 %、 90%或 95%。干细胞可从多个来源获得。干细胞与提取的单个核细胞/淋巴细胞可以是自体的。另外，干细胞与单个核细胞/淋巴细胞可以是同种异体的。此外，干细胞可以来源于外周血、脐带血、骨髓细胞、脾细胞，胸腺细胞，淋巴结，脂肪组织和肝细胞。另外一个方面，这个发明揭示了抑制自身免疫紊乱的系统。这个系统包括一个从个体中抽取血液的流动管道和把处理过的淋巴细胞回输到个体体内的流动管道。这个系统还包括一个单采机，从抽血的血液中分离出淋巴细胞。单采机根据细胞大小、重量、离心等将淋巴细胞分离出来。此外，单采机可以选择性分离单个核细胞、淋巴细胞、血浆和红细胞等。单采机可以是单针程序也可以是双针程序。单采机是个商业设备，比如 Baxter (UK)的 AWX 系统、Baxter 的 CS3000plus、Haemonetics 的 MCS+9000 和 CaridianBCT 的 COBE Spectra 。抑制自身免疫紊乱的系统还包括一个抑制自身反应淋巴细胞的生物反应器。生物反应器包括一个至少为正电基材表面的室。一群干细胞可以附着在这个基材的表面。这个表面可以是一片层，多个微载体和一个半透膜表层的形式。这个基材表面还包括疏水物质比如干细胞可以附着的聚苯乙烯或玻璃。一个体现，这个室有多个基材表层。一个体现，这个室有至少两个表层和有的多达35层或之间的任何数。这个室也可以允许干细胞和单个核细胞/淋巴细胞发生相互作用。这个相互作用可以是通过细胞与细胞间的接触。相互作用也可以通过从一个细胞释放可溶性因子到另一个细胞。这个室也可以防止干细胞和单个核细胞/淋巴细胞之间的细胞与细胞间的接触。 多孔膜可用来提供干细胞和单个核细胞/淋巴细胞之间的屏障，允许可溶性因子通过这个膜但不允许细胞通过。这个多孔膜的孔径足够小以防止细胞、干细胞、经过共培养的细胞群、淋巴细胞、T细胞穿过到膜的另一端。另外一个体现，这个多孔膜的孔足够大允许干细胞分泌的因子、生长因子、细胞因子、iNOS从膜的一端传向另一端。一个体现，干细胞附着在多孔膜的表面。另外一个体现，这个孔径的尺寸小于干细胞平均尺寸的一半大。该系统可抑制自身免疫紊乱，包括生物反应器，配有一个进口管道将淋巴细胞导入这个室，和一个出口管道，从室中提取经过处理的、共培养的淋巴细胞。生物反应器还包括一个可以附着干细胞的基材表面。干细胞呈现的浓度至少为IO7细胞。干细胞存在的浓度也可以为104、105、106、107、108、IO9UOltl细胞。一个体现，干细胞在基材表面的贴壁率至少为40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%。干细胞也可以在生物反应器中生长以获得最佳的贴壁率。另外一个体现，干细胞在基材表面生长，贴壁率至少为40%、50%、 60%、70%、80%、85%、90% 或 95%。这个系统是个封闭的系统，允许个体血液持续的处理(看图1 。通过流动管道将个体和单采机连接在一起，比如静脉针。反过来，单采机将淋巴细胞从个体抽取的外周血中分离出来。淋巴细胞通过进口管道导入给生物反应器中，与干细胞共培养。淋巴细胞被激活，能够抑制自身反应淋巴细胞比如自身反应T细胞，处理过的淋巴细胞通过出口管道从生物反应器中提取出来，然后通过流动管道回输到个体体内。经过干细胞调节的患者的单个核细胞(例如，T细胞，Tregs, B细胞，单核细胞， DCs)回输到个体体内，能够显示不同的治疗潜力，比如系统性地调节免疫平衡，诱导组织的免疫耐受，比如胰岛，通过诱导浸润的免疫细胞的凋亡降低炎症，并能刺激刺激组织细胞的再生，比如胰岛β细胞的复制和再生，其次是恢复病变胰岛的整体生理架构。例子该发明通过下述例子来进一步解释和说明发明的内容，但不应该局限于此。下属实验结果丛不同的角度，证明了该发明的很多方面。下述实施例中的数据通过配对的Mudent' s-test获得，通过对实验数据进行统计学分析，获得了重要的数据。实验结果表示为均数士SD(标准差)。例子1
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方法和材料雌性NOD/LtJ小鼠，5-6周龄，从Jackson实验室(Bar Harbor, ME)购买来，并喂养保存在伊利诺伊州大学芝加哥分校没有病原的环境中。采用Ascensia ELITE血糖仪 (BayerCorporation, Elkart, IN)在上午9点到11点之间空腹条件下对其血糖水平进行监测。雌性糖尿病NOD小鼠在M-观周时，可自发形成自身免疫引起的糖尿病，用来进行动物实验。根据小鼠体重减轻、多尿、至少连续2天空腹血糖水平> 250mg/dL的标准诊断糖尿病。所有的实验程序严格按照美国伊利诺伊州大学芝加哥分校动物保护委员会的协议规定进行。细胞共培养人脐带血(60-120ml/unit/袋)从Life Source Services (Glenview, IL)购买， 来源于健康的捐献者。对于我们这项研究采用脐血，不需要大学的伦理委员会(IRB)批准，并且不需要和捐献者签署任何协议，因为它们已经成为商业化产品，可丛公司购买。人脐带血来源的多能干细胞(CB-SC)的产生，如之前描述的那样。简要的说，脐血单个核细胞以IX IO6个细胞/ml种植在150X 15mm的Petri dish培养皿中(Becton Dickson labware, Franklin Lakes, NJ,未经组织培养处理过的培养皿)，其中每个培养皿含有25ml 的RPMI1640培养基和7%的胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad, CA)，并且在37°C，含有8% CO2的条件下进行培养。2-3周后，脐血多能干细胞生长到80-90%贴壁率，去除所有未贴壁的脐血单个核细胞后，与小鼠淋巴细胞共培养。为了共培养，从6-8周大的小鼠脾脏中分离小鼠淋巴细胞，然后移植到脐血多能干细胞上，脐血多能干细胞和淋巴细胞以1 10的比率混合，在含有25ml的RPMI1640培养基和7%的胎牛血清的150 X 15mm的培养皿中，37°C， 含有8% CO2的条件下进行共培养。共培养2-4天后，收集悬浮的淋巴细胞做实验，使脐血多能干细胞的污染保持最低限度(< 的悬浮细胞，表达脐血多能干细胞的分子标志人白细胞共同抗原⑶45显阳性)。因为脐血多能干细胞紧紧附着在培养皿上，并且呈现大而圆的形态，所以很容易区分淋巴细胞和脐血多能干细胞然后进行收集。在对照实验中，淋巴细胞在相同的条件下生长，但是没有脐血多能干细胞。流式分析和细胞分选流式分析和细胞分选的操作步骤，如同以前所描述的那样操作。对于流式分析， 细胞需要用稀释的大鼠抗小鼠⑶16单克隆抗体(eBioscience，圣地亚哥，加州)在含 2. 5%马血清(Vector Laboratories)的介质中，在4°C孵育15分钟，以阻止Fc受体及其他非特异性结合。细胞标记过程采用大鼠抗小鼠单克隆抗体进行标记，包括Alex Fluor 647-结合CD13，FITC-或藻红蛋白(PE)-结合CD4，FITC-结合CD25，和/或藻红蛋白-Cy7 (PE-Cy7)-结合CD62L，在4°C保持45分钟，之后，在流式分析前用冷的PBS冲洗。 独特型匹配的大鼠抗小鼠IgG抗体作为阴性对照。通过染色后，用CyAn ADP流式细胞计数分析仪(DakoCytomation公司生产)进行分析。对于细胞内细胞因子标记，最初先对细胞表面抗原进行标记(例如，PE-结合⑶14，FITC-结合⑶25，和PE_Cy7_结合⑶62L)然后用 BDCytofix/Cytoperm 固定 / 穿孔试剂盒(BD Bioscience, San Jose, CA)制备。随后， 细胞用不同的抗体组合进行标记，包括FITC-IL-4，Alexa Fluor 647-IL-10，Alexa Fluor 647-IL-12，太平洋蓝(pacific blue)-IFN-γ，生物素抗-TGF-β IAb (目录号 BAF240，R&D Systems公司，明尼阿波利斯市，明尼苏达州，美国)。对于TGF-β 1标记，细胞用链霉抗生物素蛋白(Strepavidin) - ^^ FITC (Vector Laboratories)进行标记。Alexa Fluor647_ 结合抗R)Xp3从eBioscience购买。为流式细胞分选经过脐血多能干细胞共培养的不同的细胞群，和对照组小鼠淋巴细胞或新鲜分离的小鼠脾细胞，细胞分选最初用CD16 Ab进行孵育，以阻止Fc受体的非特异性结合，然后用不同的抗体组合进行孵育，比如FITC-⑶4和 PE-Cy7_CD62L在4°C保持45分钟，并且用MoFlo (DakoCytomation公司生产)进行细胞分选。在确认细胞的纯度后(> 98% )，收集⑶4+⑶62L+Tregs然后用在不同的体外和体内试验中。实时定量PCR不同mRNAs的表达通过实时定量PCR (简称定量PCR)进行分析。总的RNA用Qiagen 试剂盒(Valencia，CA)进行提取。第一链合成的cDNAs用Quantikct逆转录试剂盒，根据制造商(Qiangen，Valencia，CA)的说明利用总RNA合成。定量PCR用ABI Prism7900HT 快速定量PCR系统，每个样本采用三个平行样进行操作，条件如下用验证过的基因特定的 RT2PCR引物进行扩增，95°C 15分钟，然后95°C 15秒，60°C 60秒，共40个循环。每个基因的表达水平，相对于肌动蛋白作为内参对照。对于定量PCR筛选，按照制造商的说明用小鼠Thl-Th2-Th3PCR筛选试剂盒进行。数据用制造商(美国SuperArray公司)提供的网络PCR筛选数据分析软件，进行分析。体内治疗为治疗糖尿病NOD小鼠，从6-8周的雌性NOD鼠分离脾脏淋巴细胞，与上面提到的 CB-SC共培养。共培养2-4天后，收集悬浮的淋巴细胞进行细胞分选。将纯化的⑶4+⑶62L+ 调节性T细胞(11￡04+00621；调节性11细胞，3\106个细胞，悬于100 μ 1 PBS)腹腔内注射给典型的糖尿病NOD小鼠，首次剂量是每只小鼠100 μ 1 PBS(接近胰腺部位注射)；一周后第二次治疗，每只鼠2Χ106个细胞(悬于ΙΟΟμΙ PBS，接近胰腺部位注射)。注射相同体积的PBS给糖尿病小鼠作为对照组。由于淋巴细胞在体外培养后，活性显著下降，因此采用从小鼠脾脏新鲜分离的淋巴细胞，筛选⑶4+⑶62L+调节性T细胞(对照⑶4+⑶62L+调节性 T细胞)，未与CB-SC共培养，作为另一对照组。血糖水平和体重一周检测两次，直到试验结束。治疗开始后3周，按下述方法做糖耐量试验。治疗后7周时，对照组小鼠由于严重的高血糖症(> 600mg/dL)和体重减轻(> 20% )，被处死后进行病理学检测。经过mCD4⑶62L 调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠，血糖恢复正常，同时也被处死，进行组织病理分析。为检测胰岛素，从尾静脉收集血液样品。使用超灵敏小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(生产商 Alpco Diagnostics，NH)，按照使用说明测量血清胰岛素水平。灵敏度为0.019ng/ml。腹腔内糖耐量试验小鼠禁食12h，称体重并腹腔内注射葡萄糖Omg/g体重)。分别在0，10，20，30， 45，60，90，120分钟，从尾静脉取血检测血糖。免疫组织化学胰腺在10%甲醛中固定，处理并用石蜡包埋。切成5μπι厚的薄片试样。按照以前描述的方法进行免疫组织化学染色，稍有轻微修改。为阻断非特异性染色，试样在含有2. 5%马血清的缓冲液中室温孵育20min。一抗包含豚鼠单克隆抗胰岛素抗体 (DakoCytomation, Carpinteria, CA)，小鼠抗胰高血糖素抗体，小鼠抗TGF-β 1抗体(目录号ΜΑΒΜ0，与潜伏型TGF-β 1有25%的交叉反应，与TGF-β 2没有交叉反应，与TGF-β 3和 TGF-β 5 的交叉反应< 2%，R&D Systems)，小鼠抗 SMAD4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)抗体，兔抗Ki67抗体和大鼠抗巨噬细胞标志F4/80抗体(Novus Biologicals, Littleton, CO)，和仓鼠抗小鼠树突状细胞的标志 CDl Ic (BD Phanningen)。 二抗包含iTexas red标志的驴抗豚鼠IgG，rhodamine标志的驴抗兔IgG，AMCA驴抗兔 IgG，FITC标志的驴抗鼠IgG，和Cy-5标志的驴抗大鼠IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove， PA) 。 if[|f"fM，ffl ABC i式齐[Ji (Vector Laboratories, Burlingame,CA)进行非荧光染色。生物素化的马抗兔抗体和羊抗猪抗体从Vector实验室 (Burlingame, CA)购买。从 BD Biosciences 购买鼠 IgGlk，从 Santa Cruz 公司购买豚鼠血清和兔IgG进行独特型匹配对照。对于胰腺载玻片，免疫染色后用苏木素复染色。每个试验中独特型抗体都作为阴性对照。使用数码荧光显微镜Wkiss Axiocam彩色相机给细胞照相，得到HRP免疫组化图像，用kiss LSM510共聚焦显微镜得到荧光图像。采用胰岛素抗体进行免疫组化染色后，比较总胰岛β细胞的数量，使用点计数形态分析Image J软件计量胰岛β细胞数量。为了评估胰岛炎症的程度，给胰岛评分，每个实验组的胰腺组织用苏木素伊红 (hematoxylin and eosin)染色。每个胰岛的200个连续切片中至少50个切片用来评估白细胞浸润程度。基于白细胞浸润胰岛的程度，胰岛炎症分为5个类别无炎症(未浸润)， 轻度炎症(< 25%浸润)，中度炎症(25% -50%浸润)，重度炎症(50% -75%浸润)和极重度炎症(>75%浸润)。使用原位细胞凋亡检测试剂盒(荧光素)按照生产商(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)要求的步骤测定浸润白细胞的凋亡。使用Microtome Cryostat HM5000M 冷冻切片机(Microm International GmbH)，制作来源于mCD4⑶62L调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠的和对照组小鼠的冷冻胰腺切片(8um厚)。为检测哪种细胞发生凋亡，分别利用不同的标志包括PE-⑶4抗体标记⑶4+T细胞，PE-⑶8抗体标记⑶8+T细胞，PE-B220抗体标记B细胞，大鼠抗小鼠F4/80抗体标记巨噬细胞，结合TUNEL染色。⑶4，⑶8和B220抗体购自eBioscience。切片直接使用原位细胞凋亡检测试剂盒检测，然后用不同的单克隆抗体免疫染色和用kiss LSM510共聚焦显微镜照相。双染色后，阳性细胞直接在显微镜和/ 或图像中定量。用不含TUNEL反应混合物的溶液和/或独特型IgG孵育的切片作为阴性对照。细胞因子检测使用ELISA试剂盒按操作步骤定量小鼠血清中的细胞因子水平。从 Biolegend (SanDiego, CA)公司购买 IFN-γ ELISA 试剂盒，从 Assay Designs 公司(Ann Arbor, MI)购买鼠 IL-4 和 IL-10ELISA 试剂盒，从 Promega 公司(Madison，WI)购买 TGF-β IELISA 试剂盒。例子2小鼠调节性T淋巴细胞的调节为研究调节性T细胞对1型糖尿病TlD的治疗潜能，我们采用了 NOD小鼠实验模型。首先，CB-SC与NOD小鼠的脾脏来源的淋巴细胞共培养，发现淋巴细胞与CB-SC按不同比例的共培养，并不能有效刺激小鼠淋巴细胞的增殖(CB-SC与淋巴细胞的比例分别为1 5， 1 10，和 1 20)图 4Α，ρ = 0. 25，ρ = 0. 15，ρ = 0. 16)，这与 CB-SC 和人淋巴细胞的共
22培养是相似的，说明干细胞CB-SC的免疫原性很低。图中数据代表四次独立实验的平均值士标准差。接下来，我们分析了 CB-SC与小鼠淋巴细胞的共培养后，调节性T细胞的变化，包括常见的⑶4+⑶25+调节性T细胞，⑶4+Foxp3+调节性T细胞和⑶4+⑶62L+调节性T细胞。 我们没有发现小鼠总脾脏淋巴细胞中的⑶4+⑶25+调节性T细胞和⑶4+FoXp3+调节性T细胞，不管是单独培养的或与CB-SC共培养后有显著的不同。相反，在与CB-SC共培养后， ⑶4+CD62L+调节性T细胞的百分比增加了 5倍，图4B。更进一步的流式细胞分析表明只有一小部分的⑶4+⑶62L+调节性T细胞是⑶4+CD25+⑶62L+FoXp3+阳性的(图4C)，而且不管有没有与CB-SC共培养，这个百分比并没有什么不同(0. 11 士0.04%和0. 10士0.03%，p = 0. 44)。因此，我们集中研究了在与CB-SC共培养后，变化明显的⑶4+CD62L+调节性T细胞。 B-C的数据代表了 3-5次实验结果。为探讨在体外与CB-SC共培养后，对⑶4+⑶62L+调节性T细胞的影响，采用流式分析检测了 Thl和Th2相关的细胞内细胞因子的变化(图4D)。结果证明，mCD4CD62L调节性T细胞相对于对照组⑶4⑶62L调节性T细胞的IL-4水平明显下调(p = 0. 004)，然而 IL-10，IL-12*TGF-3 1 水平上调(分别的，ρ = 0. 001,ρ = 0.0001，和 ρ = 0.006)。相反地，与CB-SC共培养后，IFN- γ的表达没有改变(图4D，ρ = 0.幻。下一步，我们利用定量 PCR来研究与CB-SC共培养以后，纯化的⑶4+⑶62L+调节性T细胞中Thl_Th2_Th3细胞相关基因的表达变化。结果证明mCD4CD62L调节性T细胞显示Th细胞相关基因包括多种细胞因子及受体，趋化因子及受体，细胞表面分子以及信号通路分子和转录因子等标志下调。 这些数据清楚的表明与CB-SC的体外共培养，导致小鼠⑶4+⑶62L+调节性T细胞基因表达的大幅修改，尤其是功能相关细胞因子和趋化因子基因。CB-SC调节的⑶4+CD62L+调节性T细胞纠正小鼠高血糖接下来，典型的糖尿病NOD小鼠(雌性，24- 周)发病5_20天后，采用mCD4⑶62L 调节性T细胞治疗(每只小鼠5百万细胞，腹腔注射，每组8只小鼠)，以观察mCD4CD62L 调节性T细胞对糖尿病NOD小鼠的治疗潜能。相同数量的对照组CD4CD62L调节性T细胞 (腹腔注射，η = 5小鼠)和PBS(总共200微升/小鼠，腹腔注射，η = 5小鼠)作为对照组。很显著地，我们发现使用mCD4CD62L调节性T细胞治疗后，这些有典型糖尿病的小鼠 (6/8小鼠)血糖恢复正常(图5A)。然而，使用对照CD4CD62L调节性T细胞或PBS治疗后的糖尿病小鼠没有降低高血糖(图5B)(每组分别为5/5，5/5小鼠)。用mCD4CD62L调节性T细胞治疗后的血糖恢复正常的糖尿病小鼠，进一步采用糖耐量试验也证明有显著的提高，这与没发生过糖尿病的NOD小鼠在7周时的结果是相似的(图5B)。然而，使用对照组 ⑶4⑶62L调节性T细胞或PBS治疗后的糖尿病小鼠维持较高血糖水平(> 500mg/dL)，血糖水平没有任何可观察到的下降(图5B)。接下来，我们测定用mCD4CD62L调节性T细胞治疗后的6周时血液胰岛素水平。结果表明对照组CD4CD62L调节性T细胞或PBS治疗后的糖尿病小鼠的胰岛素未被ELISA方法检测到(ELISA试剂盒的灵敏度是0. 019ng/ml,图 5C)。根据动物保护委员会的规定，这些小鼠由于严重的高血糖症(BG > 600mg/dL)和体重减轻而被处死(图5D)。相反的，用mCD4CD62L调节性T细胞治疗的糖尿病NOD小鼠的血液胰岛素水平，获得明显提高。(图5D，ρ = 0. 0025)。治疗45天后，将胰腺进行组织学分析，并对胰腺组织连续切片进行胰岛素抗体免疫组化染色后，评估总的胰岛β细胞的数量。定量形态学分析证明用mCD4CD62L调节性 T细胞治疗显著提高了总的胰岛β细胞的数量(图5Ε，ρ = 0.0(^6)。相反地，用对照组 CD4CD62L调节性T细胞或PBS治疗后的β细胞数量显著降低。为揭示总胰岛β细胞数量增加的机制，我们检测了胰岛细胞增殖的标志一细胞核增殖抗原Ki67的表达。采用胰岛素和Ki67抗体的双免疫荧光染色显示mCD4CD62L调节性T细胞治疗的小鼠的胰岛中，有 20士8的胰岛β细胞表达Ki67(图5F)，这比用对照组⑶4⑶62L调节性T细胞治疗的小鼠胰岛中，检测到的细胞显著提高(1 士0.4) (ρ = 0.0014)。这表明胰岛β细胞的再生，导致了胰岛总β细胞数量的显著增加。而且，用β细胞标志胰岛素和α细胞标志胰高血糖素进行双免疫染色显示，用mCD4CD62L调节性T细胞治疗的小鼠的胰岛表现为与无糖尿病NOD 小鼠的正常胰岛α-和β-细胞分布相同的模式。然而，用对照组⑶4⑶62L调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠由于β细胞的缺失，导致胰岛结构完全被破坏。因此，用mCD4CD62L调节性T细胞治疗可以通过提高β细胞的再生和胰岛细胞构架的重建，来治疗糖尿病TlD小鼠，纠正高血糖。逆转NOD小鼠胰岛炎和纠正其免疫紊乱为证明mCD4⑶62L调节性T细胞是否对自身反应性效应T细胞具有免疫抑制作用，在治疗后45天，我们做了胰腺组织学分析和胰岛评分。组织学评估表明治疗之前糖尿病NOD小鼠接近80%的胰岛β细胞被破坏。治疗后6周，我们发现糖尿病小鼠接受了 mCD4CD62L调节性T细胞治疗后，36%的胰岛没有或只有少量炎性细胞的浸润迹象；20%的胰岛表现轻微胰岛炎；15%的胰岛表现中度炎症；18%的胰岛有重度炎症，只有11%表现极重度炎症(图6A和图6B)。没有炎症的胰岛范围较小，并且增殖标志Ki67呈阳性，表明这部分胰岛可能是新生的。相反地，对照组CD4CD62L调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠的所有胰岛表现出大量的炎性细胞浸润迹象，胰岛结构被严重破坏(图6B)，只有很少或没有胰岛素阳性细胞出现。相似的，胰腺组织学检测证明经过45天的观察后抵抗mCD4⑶62L调节性T细胞治疗的2只小鼠(2/8)也表现出极重度炎症。典型的数据来源于6只(6/8)对 mCD4CD62L调节性T细胞治疗敏感的血糖正常的糖尿病小鼠。胰岛炎症程度评分是采用胰岛素抗体免疫组化和苏木素复染色后，单个核细胞浸润到胰岛的百分率。为弄清胰岛炎症减轻的分子机制，采用ELISA法检测了血浆中Thl/Th2细胞因子水平。我们发现相对于对照组⑶4⑶62L调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠，采用mCD4⑶62L 调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠血浆中Thl细胞因子IFN- γ和Th2细胞因子IL-4显著减少(P = 0. 017，图6C，P = 0. 018，图6D)。相反地，相对于那些用对照组CD4CD62L调节性T 细胞治疗的糖尿病小鼠(P = 0.016)和无糖尿病的6周NOD小鼠(？ = 0.014)，用11￡04^621^ 调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠的血浆IL-10水平有了明显提高。血浆细胞因子水平的结果来源于三次实验，表述为平均值士标准差。另外，相对于用对照组⑶4⑶62L调节性T 细胞治疗的糖尿病小鼠，mCD4CD62L调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠的血浆中转化生长因子TGF-β 1水平显著升高(ρ = 0. 041)。这些数据表示mCD4⑶62L调节性T细胞治疗后， 血浆IL-10和TGF-β 1升高，有助于诱导免疫耐受。这些数据证明暴露于CB-SC导致了 mCD4CD62L调节性T细胞发生深刻变化，进而有助于重建正常的胰岛结构和β细胞功能，最终抑制糖尿病。TGF-βΙ是能够抑制免疫，诱导和保持自身耐受的最强有力的细胞因子之一。为阐明用mCD4CD62L调节性T细胞上述治疗后，保护胰岛β细胞的分子再生机制，除了检测血浆TGF-β 1的水平外，通过免疫组织化学(简称免疫组化)还观察了胰岛TGF-β 1的表达。 结果证明相对于用对照组CD4CD62L调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠，用mCD4CD62L调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠其TGF-β 1水平在胰岛中表达显著的提高。TGF-β 1阳性细胞染色表现两种模式一种分布于胰岛β细胞之间，平均阳性细胞量14士9个细胞每个胰岛， 另一种包绕在胰岛β周围。很重要的是，我们发现这些环绕的TGF-β 1阳性细胞(巨噬细胞的标志F4/80阴性，但树突状细胞的标志⑶Ilc阳性)及它们释放的TGF-β 1形成了一个环，围绕在胰岛周围。这个环可能通过诱导自我侵润性效应淋巴细胞凋亡，来保护新生的胰岛免受再攻击。通过末端脱氧核苷酸转移dUTP缺口末端标志(TUNEL)染色来检测细胞凋亡。用mCD4⑶62L调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠有58士23侵润的白细胞表现为TUNEL+， 对照组⑶4⑶62L调节性T细胞治疗的糖尿病小鼠只有9 士 3侵润的白细胞表现为TUNEL+(ρ =0. 02)为弄清是哪种细胞凋亡，我们用不同的细胞标志包括⑶4单抗标记⑶4+T细胞， CD8单抗标记⑶8+T细胞，B220单抗标记B细胞，和F4/80单抗标记巨噬细胞，结合TUNEL染色来进行双染色。发现，与用对照组⑶4⑶62L调节性T细胞治疗相比，用mCD4⑶62L调节性T细胞治疗促进了浸润性T细胞，B细胞和巨噬细胞的凋亡。(P值分别为0. 0034，0. 024， 0.041，和0.032)。这3种细胞类型相比，⑶4+T细胞表现了更高的凋亡细胞百分率(图7)。 因此，这些数据提示了用mCD4⑶62L调节性T细胞治疗，提高了胰岛TGF-β 1的表达，形成保护性TGF-β 1分子环，有助于保护新生胰岛免受自身反应性免疫细胞再破坏。实验结果来源于五次实验，表述为平均值士标准差。例子3体外免疫调节机制CB-SC能通过调节⑶4+CD62L+调节性T细胞的功能，进而可以预防和逆转自身免疫引起的1型糖尿病NOD小鼠的发病。为了进一步探讨CB-SC的治疗潜能，我们检测了 1 型糖尿病病人。检测了在有分裂原PHA存在的情况下，CB-SC对1型糖尿病病人CD4+CD62L+ 调节性T细胞的免疫调控(图8A和图8B)。细胞内细胞因子标记结果证明，与用对照组 PHA处理相比，CB-SC共培养处理的⑶4+⑶62L+调节性T细胞的IL-5水平明显下调(p = 0. 007)，而IL-10和TGF- β 1显著上调(P值分别为0. 0018和0. 019)，这与在NOD小鼠的观察到的对⑶4+CD62L+调节性T细胞作用是一致的。相反地，与CB-SC共培养后，IL_4，IL-12 和IFN- γ的表达没有改变(图8Α)。另外，与用对照组PHA治疗相比，用PHA+CB-SC处理后，调节性T细胞的特异标志转录因子R)xp3上调了 2.7倍(图8Β)。因此，这些数据表明 CB-SC可以调节1型糖尿病人的⑶4+⑶62L+调节性T细胞。为确定CB-SC对1型糖尿病的治疗潜能，我们探讨了 CB-SC对1型糖尿病人外周血来源的胰岛细胞GAD特异的CD4+T细胞克隆的直接调节。结果证明抗原提呈细胞APC和不同剂量的GAD肽能够显著的刺激T细胞克隆的增殖；与无CB-SC的对照组相比，，在CB-SC 存在的情况下，它们这种对T细胞克隆增殖的刺激作用显著降低。因此，CB-SC有消除致病 T细胞的潜能。实验结果来源于三次实验，表述为平均值士标准差。羧肽酶M (CPM)和缓激肽Bl受体我们发现CB-SC表达膜CPM，缓激肽Bl受体和诱导型一氧化氮合成酶(iNOQ (图9A)。实验表明在巨噬细胞和内皮细胞中，CPM可以作用于底物产生精氨酸，然后精氨酸在诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的作用下，可以提高巨噬细胞和内皮细胞NO的产生。结果显示B1受体活化剂des-Arg 10-bradykinin (DAKD)可以刺激CB-SC产生NO ； iNOS特异的抑制剂1400W或Bl受体拮抗剂[Des-Arg 10，Leu9]胰激肽DALKD的结合可以抑制CB-SC 产生NO (图9B和图9C)。用特异的B-型羧肽酶抑制剂2-mercapomethyl-3-guanidinoeth ylthiopropanoic acid(MGTA)阻断，可以阻止CB-SC中NO的产生，并逆转CB-SC对同种异体淋巴细胞的抑制作用，这与使用iNOS抑制剂1400W是相似的。为明确细胞与细胞之间的接触及CPM和BlR的表达，对CB-SC调节人Treg细胞的影响，在共培养实验中采用了 CPM的特异抑制剂MGTA和BlR的特异抑制剂DALKD进行阻断。淋巴细胞在trans-well中培养作为对照。结果证明阻断CPM和/或BlR能降低 ⑶4+CD25+⑶62L+⑶69+调节性T细胞的阳性百分率。实验结果来源于五次实验。CB-SC表达自身免疫调控因子(Aire)Aire通过调节外周自身抗原异位表达和删除自身反应性T细胞，在免疫耐受中发挥了重要作用。为探究CB-SC免疫调控的分子机制，我们发现CB-SC在基因水平(图10A) 和蛋白水平(图10B)都表达Aire。这就提示CB-SC表达Aire可能有助于免疫调节。实验数据来源于3次CB-SC代表性实验。为进一步探讨Aire在CB-SC中的功能，通过Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)转染技术，转染了 3对特异Aire siRNA(图11A)。代表性数据来源于5个CB-SC标本。Westernblot显示相对于阴性对照的siRNA，经过50nMAire siRNA处理后，70%的Aire蛋白可以被去掉(图11B)。Western blot也证明Aire siRNA处理后， CPM和PD-Ll蛋白的表达水平也显著下降了(图11B)。这说明Aire可以在转录水平调节基因表达。代表性数据来源于3次实验。为进一步检测Aire对免疫调节的作用，我们检测了 Aire siRNA和阴性对照siRNA 处理后的CB-SC，对人调节性T细胞标志R)xp3的影响。流式分析证明与用阴性对照siRNA 处理的CB-SC相比，Aire siRNA处理后的CB-SC和淋巴细胞共培养后，Foxp3的表达水平要显著的降低(P = 0. 028，图11C)。因此，这些数据表明了 Aire的表达参与了 CB-SC的免疫调节作用。数据代表3次实验的平均值士标准差。目前，该发明描述了特殊的方法和组分，本领域技术人员基于本发明可以做出变动和修改。本领域技术人员通过常规的实验，按照上面描述的体现，将会意识到或查明该发明有新的特征和优势。实践目前的发明将应用，除非另有说明，细胞生物学，细胞培养，分子生物学，微生物学，基因工程和免疫学的常规技术，这些都包含在本领域技术范围之内。本发明，主要描述了目前认为非常实际和优选的实施方式，本发明不局限于所述的实施方式， 凡是根据本发明内容所做的均等变化与修饰，均涵盖在本发明的专利范围内。在不会偏离如权利要求所述的本发明的创新方面的情况下，本发明可进行各种修改和变通。同样的，该发明不局限于上述特别表述和描述的内容。所有的发表文章和参考文献在此都引用全文。
权利要求
1.一种用于调节淋巴细胞和抑制，自身反应性T细胞的生物反应器，包含具有至少一层带正电的基材表面的培养室；一群干细胞附着于基材表面；一个用于将淋巴细胞导入培养室的入口管道，和一个用于导出与干细胞共培养处理后的淋巴细胞的出口管道。
2.一种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述基材表面包含至少一层表层。
3.—种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述基材表面包含许多微载体。
4.一种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述基材表面包含至少一层可透过的膜层。
5.一种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述基材表面包含疏水性聚苯乙火布ο
6.一种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述干细胞在基材表面显示贴壁率至少50%以上。
7.—种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述干细胞在基材表面显示贴壁率至少80%以上。
8.—种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述干细胞在基材表面显示贴壁率至少90%以上。
9.一种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述培养室被设计为允许干细胞和淋巴细胞之间的细胞与细胞接触。
10.一种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述培养室被设计为阻止干细胞和淋巴细胞之间的细胞与细胞接触。
11.一种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述干细胞来源于脐带血。
12.—种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述干细胞来源于外周血。
13.—种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述干细胞相对于淋巴细胞是同种异体的。
14.一种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述干细胞相对于淋巴细胞是自体的。
15.一种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述培养室里至少包含IO6个干细胞。
16.一种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述培养室里的干细胞与淋巴细胞的比例至少为1 10。
17.—种如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述干细胞在培养室里的多个基材表面层培养生长。
18.—种抑制自身免疫紊乱的系统，包括从患者导出血液的流体管道；从抽取的血液中分离淋巴细胞的血细胞单采机；生物反应器，该生物反应器包含具有至少一层带正电的基材表面的培养室，一群干细胞附着于基材表面，一个用于将淋巴细胞导入的培养室的入口管道，和一个用于导出与干细胞共培养处理后的淋巴细胞的出口管道，和给患者回输处理后的淋巴细胞的流体管道。
19.一种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述生物反应器的基材表面包含至少一层表层。
20.一种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述生物反应器的基材表面包含微载体。
21.一种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述生物反应器的基材表面包含至少一层可透过的膜层。
22.—种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述生物反应器的基材表面包含疏水性聚苯乙烯。
23.一种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述干细胞在基材表面显示贴壁率至少50%以上。
24.一种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述干细胞在基材表面显示贴壁率至少80%以上。
25.一种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述干细胞在基材表面显示贴壁率至少90%以上。
26.—种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述生物反应器的培养室被设计为允许干细胞和淋巴细胞之间的细胞与细胞接触。
27.—种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述生物反应器的培养室被设计为阻止干细胞和淋巴细胞之间的细胞与细胞接触。
28.—种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述附着于基材表面的干细胞来源于脐带血。
29.—种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述附着于基材表面的干细胞来源于外周血。
30.一种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述附着于基材表面的干细胞相对于淋巴细胞是同种异体的。
31.一种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述附着于基材表面的干细胞相对于淋巴细胞是自体的。
32.—种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述培养室里的附着于基材表面的干细胞培养到至少IO7个。
33.一种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述培养室里的附着于基材表面的干细胞与淋巴细胞的比例至少为1 10。
34.一种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述干细胞在在培养室里的多个基材表面层培养生长。
35.一种如权利要求18所述的系统，其特征在于，所述系统是封闭的系统。
36.一种抑制自身反应性T细胞引起的自身免疫紊乱的方法，这种方法包含 从需要治疗的患者抽取血液；从抽取出的血液中分离淋巴细胞；将淋巴细胞暴露于干细胞，这样，调节性T细胞被活化进而来抑制自身反应性T细胞，禾口回输给患者至少一部分干细胞处理后的淋巴细胞。
37.一种如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述自身免疫紊乱是指糖尿病。
38.一种如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述将淋巴细胞暴露于干细胞的步骤进一步包含在反应器中培养干细胞，和将患者的淋巴细胞导入反应器中。
39.一种如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述干细胞相对于淋巴细胞是同种异体的。
40.一种如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述干细胞来源于脐带血。
41.一种如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述干细胞来源于外周血。
42.一种如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述干细胞是来源于患者自身外周血的自体干细胞。
43.一种如权利要求36所述的方法，其特征在于，在反应器中培养干细胞的步骤进一步包括收集包含外周血单个核细胞(PBMCs)的外周血；培养PBMCs，然后PBMCs转化为胚胎样干细胞；分离胚胎样干细胞；和将胚胎样干细胞附着于反应器的表面。
44.一种如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述反应器的表面带有正电荷。
45.一种如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述调节性T细胞受到干细胞表达的程序性死亡配体-1 (PD-Ll)的调节。
46.一种如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述调节性T细胞通过由干细胞释放的一氧化氮(NO)来活化。
47.一种如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述调节性T细胞通过与干细胞的细胞与细胞接触活化。
48.一种如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述调节性T细胞通过反应器里的干细胞分泌的可溶性因子来活化。
49.一种如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述调节性T细胞通过表达CD4， ⑶25，⑶62L和⑶69分子标志被标记。
50.一种如权利要求36所述的方法，其特征在于，抽取血液和给患者回输处理后的淋巴细胞的步骤是一个连续的过程。
51.一种如权利要求50所述的方法，其特征在于，连续处理患者的血液，需要足够时间抽取出至少1升的血液。
52.一种活化调节性T细胞的方法，通过将调节性T细胞暴露于表达羧肽酶M(CPM)的干细胞。
53.一种活化调节性T细胞的方法，通过将调节性T细胞暴露于表达缓激肽Bl受体的干细胞。
54.一种活化调节性T细胞的方法，通过将调节性T细胞暴露于表达自免疫调节因子(AIRE)蛋白的干细胞。
全文摘要
该发明揭示了单个核细胞和/或淋巴细胞通过与干细胞共培养，来调节它们功能的方法和设备。该发明也披露了采用干细胞的免疫教育作用，纠正自身免疫反应细胞的功能紊乱机制，以治疗自身免疫性疾病和免疫紊乱相关的疾病，例如糖尿病。该发明的一个方面，揭示了生物反应器(干细胞教育器)调节淋巴细胞并抑制自身反应T细胞。该生物反应器包括一个培养室，这个培养室至少拥有一层带正电和/或疏水性表面的基材，一群干细胞贴壁附着在基材表面，一个将单个核细胞和/或淋巴细胞导入这个培养室的进口管道，和一个用于导出经过干细胞共培养处理过的单个核细胞和/或淋巴细胞的出口管道。
文档编号C12N5/0783GK102471753SQ201080029802
公开日2012年5月23日 申请日期2010年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者赵勇 申请人:伊利诺伊大学理事会