专利名称：一种定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及功能基因组学和基因表达检测技术、分析技术。具体而言就是在人类功能基因组表达谱范围内筛选可用于乳腺癌转移和预后分子分型的一类基因，并建立检测技术，制备成试剂盒，应用于乳腺癌患者的转移和预后评估。
背景技术：
乳腺癌是威胁女性的恶性肿瘤之一，在过去的20年里，对肿瘤的发生机制有了更深入的理解，以手术为中心，化疗、放疗、内分泌治疗为辅助的多学科综合治疗的临床模式也得到长足的发展，使乳腺癌的复发和死亡率显著降低，但乳腺癌的诊断及治疗仍然严重依赖传统的组织病理学和免疫组化技术，缺乏能够较为准确地预测患者的复发风险并给予相应治疗的有效检测方法。大型临床试验，如美国乳腺与肠道外科辅助治疗研究组(National SurgicalAdjuvant Breastand Bowel Project, NSABP)的两项试验(B-14 和 B-20)回顾分析显示，雌激素受体阳性、腋下淋巴结阴性的乳腺癌患者可以从服用他莫昔芬和辅助化疗中获益，但是手术后单独服用他莫昔芬的患者10年内远期复发的概率仅为15%，这意味着存在大量患者接受了过度的化疗，造成了不必要的身体伤害。长久以来，临床上治疗方案的选择是以肿瘤的临床病理特征为依据，比如淋巴结的转移以及组织学分级。但淋巴结中的微小转移，以及一些重要的肿瘤特征如雌激素受体的表达和Her2的过表达等因素的不确定性，不但影响着疾病的预后，更影响着机体对治疗方案的反应。近几年来，随着基因组学的研究深入，已发现几个能够比临床病理学指标更能准确预测肿瘤复发的多基因标记物。在美国，针对雌激素受体阳性患者的“21基因检测”已经被证实比临床病理学指标能更准确的定量评估雌激素受体阳性、腋下淋巴结阴性患者术后服用他莫昔芬的远期转移风险，而且可以预测他莫昔芬和CMF化疗或氨甲喋呤/5-氟尿嘧啶/叶酸化疗的疗效。NCCN认为，临床上内分泌治疗和化疗的应用必须先权衡预期的绝对风险降低和患者个人是否愿意承受获得这些收益所要面临的毒性反应。“21基因检测”包含了更多预后/预测的生物标志物，可以再解剖分期、ER/PR和Her2状态之外提供更多预后/预测信息，从而为个体病例提供更为精确的治疗决策与预后信息，使临床医师能够选择出真正能够从内分泌或化疗中获益的患者。ASCO乳腺癌指南提出，雌激素受体阳性、腋下淋巴结阴性患者可以通过“21基因检测”评估他莫昔芬治疗后的复发风险，“21基因检测”可以用于筛选那些可以从他莫昔芬治疗取得最大临床获益因而不需要进一步辅助化疗的患者。这21个基因被分为6组，分别是增殖相关基因(Proliferation组)包括Ki_67、STK15、Survivin、CyclinBU MYBL2 ；侵袭相关基因(Invasion 组)包括 Stromelysin3、Cathepsin L2 ；Her2相关基因(Her2组)包括GRB7、Her2 ；激素相关基因(ER组)包括ER、PR、Bcl-2、SCUBE2 ；其它相关基因(GSTM1、BAG1、CD68)；参考基因(ACTB、GAPDH、RPLP0、⑶S、TFRC)。虽然该检测已被AS⑶和NCCN纳入乳腺癌指南中，日本科学家Toi等报告的研究也首次表明，“21基因检测”可为雌激素受体阳性、腋下淋巴结阴性的亚洲乳腺癌患者提供预后信息。在国外，“21基因检测”还只是作为一种检测服务存在，严重影响了该检测在临床的开展，加之国内的关注还比较少，目前我们国内临床还没有开展这项检测。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂
品.ο本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，由21对引物、21条特异性taqman荧光探针、10 X RT-PCR缓冲液、2. 5mM dNTP混合液、逆转录酶、DNA聚合酶、10 XPCR缓冲液和RNA酶抑制剂组成；所述21对引物序列分别如下(I)CCNBl引物对包括反向引物CCNBlR和正向引物CCNBlF ；所述CCNBlR序列为GCAGCATCTTCTTGGGCACA ；所述 CCNBlF 序列为 AGGTTGTTGCAGGAGACCATGQ)Ki-67引物对包括反向引物Ki-67R和正向引物Ki-67F ；所述Ki_67R序列为CAACTCTTCCACTGGGACGATCCG ；所述 Ki_67F 序列为CGGCGGACTTTGGGTGCGAC(3)MYBL2引物对包括反向引物MYBL2R和MYBL2F ；所述MYBL2R序列为CCTTCCTTTTGATGGTAGAGTTCCAGT ；所述 MYBL2F 序列为TGGGCCGAGATCGCCAAGG)STK15引物对包括反向引物STK15R和正向引物STK15F ；所述STK15R序列为GACCTTCAATCATTTCAGGG ；所述 STK15F 序列为CTCCATCTTCCAGGAGGACC(5) Survivin引物对包括反向引物SURVR和正向引物SURVF ；所述SURVR序列为AGCTGTCAGCTCTAGCAAAAGGG ；所述 SURVF 序列为TGCTGTTTTGATTCCCGGGC(6)Bcl2引物对包括反向引物Bcl2R和正向引物Bcl2F ；所述Bcl2R TTTCCTATGATTTAAGGGCATTTT ；所述 Bcl2F CTTCAGATGGACCTAGTACCCACTG(7) SCUBE2引物对包括反向引物CEGPlR和正向引物CEGPlF ；CEGPlR序列为GACTACAGCCGTGATCCTTATTC ；CEGP IF 序列为GAGTGACAATCAGCACACCTGCT(8)ER引物对包括反向引物htRlR和正向引物EstRlF ；所述htRlR序列为，CTAGTGGGCGCATGTAGGC ；所述 EstRlF 序列为，GAACGTGGTGCCCCTCTATG(9) PR引物对包括反向引物PRR和正向引物PRF ；所述PRR，GTTGTGCTGCCCTTCCATTG ；所述 PRF，GAAGCATCAGGCTGTCATTA(10)HER2引物对包括反向引物HER2R和正向引物HER2F ；所述HER2R序列为TCACCTCTCGCAAGTGCTCC ；所述 HER2F 序列为TGTGAGAAGTGCAGCAAGCC(11)GRB7引物对包括反向引物GRB7R和正向引物GRB7F ；所述GRB7R序列为，CATGGCCACCAGGGTATTAT ；所述 GRB7F 序列为，TCGCCATCTGCATCCATCTT(12) Cathepsin L2引物对包括反向引物CTSL2R和正向引物CTSL2F ；所述CTSL2R 序列为，GCCACCATTGCAGCCCTGA ；所述 CTSL2F 序列为，ACTTGTCTCACTGAGCGAGCA(13) Stromolysin 3引物对包括反向引物STMY3R和正向引物STMY3F ；所述STMY3R 序列为，ATTTACAATGGCTTTGGAGGATA ；所述 STMY3F 序列为，GGCCCTGGAGGCTGCAACAT
(14)⑶68引物对包括反向引物⑶68R和正向引物⑶68F ;所述⑶68R序列为， CCTCTCCTCCACCCTGGGT ;所述 CD68F 序列为，CAATGGTTCCCAGCCCTG(15)BAG 1引物对包括反向引物BAG1R和正向引物BAG1F ;所述BAG1R序列为， TCAACCTCTTCCTGTGGACTGTTC ;所述 BAG1F 序列为，CACCGTTGTCAGCACTTGGAATA(16)GSTM1引物对包括反向引物GSTM1R和正向引物GSTM1F ;所述GSTM1R序列 为CAGGCCCAGCTTGAATITIT ;所述 GSTM1F 序列为CTCAAGCTATGAGGAAAAGAAGTACAC(17)ACTB引物对包括反向引物ACTBR和正向引物ACTBF ;所述ACTBR序列为， GAAGCATTTGCGGTGGAC ;所述 ACTBF 序列为TTCCAGCAGATGTGGATCAGC(18) GAPDH弓丨物对包括反向弓丨物GAPDHR和正向引物GAPDHF ；所述GAPDHR序列 为，GTGATGGGATTTCCATTGATGA ;所述 GAPDHF 序列为ATGAITCCACCCATGGCAAA(19)RPLP0引物对包括反向引物RPLP0R和正向引物RPLP0F ;所述RPLP0R序列 为TITCAGCAAGTGGGAAGGTGTAA ;所述 RPLP0F 序列为ACCCCAITCTATCATCAACGGGTA(20)GUS引物对包括反向引物⑶SR和正向引物⑶SF ；所述⑶SR序列为， GACACGCAGGTGGTATCAGT ;所述⑶SF 序列为，ATCCCCACTCAGTAGCCAAG(21) TFRC引物对包括反向引物TFRCR和正向引物TFRCF ；所述TFRCR序列为 TAAACTCAGGCCCATTTCCT ;所述 TFRCF 序列为ACAGCCAACTGCTITCAITT ；所述21条特异性taqman荧光探针的DNA序列分别如下(1)探针 CCNB1-T 序列为ATGACTGTCTCCATTAITGATCGGITCA ；(2)探针 Ki-67-T 序列为CGGTGGITCGACAAGTGGCCTTG ；(3)探针 MYBL2_T 序列为AGGGAGGACAGACAATGCTGTGA ；(4)探针 STK15-T CTGTGGCACCCTGGACTACCTGC ；(5)探针 SU RV-T TGAGAAGTGAGGGAGGAAGAAGGCAGT ；(6)探针 Bcl2-T TCCACGCCGAAGGACAGCGATG ；(7)探针 CEGP1-T GCTCGGAAGAGGGCCTGAGCTG ；(8)探针 EstRl-T TGCTGGAGATGCTGGACGC ；(9)探针 PR-T CTTACCTGTGGGAGCTGTAAGGTCTTCT ；(10)探针 HER2-T GCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGC ；(11)探针 GRB7-T GGCTCCCCACCCTTGAGAAGTGC ；(12)探针 CTSL2-T GTGGACTGTTCGCGTCCTCAAGGC ；(13)探针 STMY3-T CGGATCCTCCTGAAGCCCTTTTCGC ；(14)探针 CD68-T CCTCCAAGCCCAGATTCAGATTCGAGTC ；(15)探针 BAG1-T GATGGTTGCCGGGTCATGTTAATTGG ；(16)探针 GSTM 1-T GACGCTCCTGATTATGACAGAAGCCAGTGG ；(17)探针 ACTB-T GAGTATGACGAGTCCGGCCCCTC ；(18)探针 GAPDH-T ACCGTCAAGGCTGAGAACGGGA ；(19)探针 RPLP0-T GAGTCCTGGCCTTGTCTGTGGAGAC ；(20)探针⑶S-T TTTGGAAAACAGCCTGTTTACTTGAGC ；(21)探针 TFRC-T GGATCTGAACCAATACAGAGCAGACATA ；所述各条探针的5 ’端有FAM修饰，3 ’端有BHQ-1修饰。
进一步的所述21对引物的浓度分别为10 μ M ；所述21条特异性taqman荧光探针的浓度为10 μ M ；所述逆转录酶活力为4个单位每微升；所述DNA聚合酶活力为5个单位每微升；所述RNA酶抑制剂活力单位为10个单位每微升；所述RT-PCR缓冲液由Tris-Cl,KCl, Mg2+，DTT 组成，ρΗ 为 8. 3 ；所述 PCR 缓冲液由 Tris · Cl，KCl, (NH4)2SO4,15mM MgCl2 组成，pH 为 8. 7。本发明采用逆转录PCR技术结合taqman荧光定量PCR技术，采用自行设计并优化的逆转录引物、实时PCR引物和taqman探针，整合了逆转录PCR试剂、taqman real-timePCR试剂，制成检测试剂盒，操作简单快速，检测结果更为稳定、检测成本也更低。
具体实施例方式一种定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，由21对引物、21条特异性taqman荧光探针、10XRT-PCR缓冲液、2. 5mM dNTP混合液、逆转录酶、DNA聚合酶、10XPCR缓冲液和RNA酶抑制剂组成；所述21对引物序列分别如下(I)CCNBl引物对包括反向引物CCNBlR和正向引物CCNBlF ；所述CCNBlR序列为GCAGCATCTTCTTGGGCACA ；所述 CCNBlF 序列为 AGGTTGTTGCAGGAGACCATGQ)Ki-67引物对包括反向引物Ki-67R和正向引物Ki-67F ；所述Ki_67R序列为CAACTCTTCCACTGGGACGATCCG ；所述 Ki_67F 序列为CGGCGGACTTTGGGTGCGAC(3)MYBL2引物对包括反向引物MYBL2R和MYBL2F ；所述MYBL2R序列为CCTTCCTTTTGATGGTAGAGTTCCAGT ；所述 MYBL2F 序列为TGGGCCGAGATCGCCAAGG)STK15引物对包括反向引物STK15R和正向引物STK15F ；所述STK15R序列为GACCTTCAATCATTTCAGGG ；所述 STK15F 序列为CTCCATCTTCCAGGAGGACC(5) Survivin引物对包括反向引物SURVR和正向引物SURVF ；所述SURVR序列为AGCTGTCAGCTCTAGCAAAAGGG ；所述 SURVF 序列为TGCTGTTTTGATTCCCGGGC(6)Bcl2引物对包括反向引物Bcl2R和正向引物Bcl2F ；所述Bcl2R TTTCCTATGATTTAAGGGCATTTT ；所述 Bcl2F CTTCAGATGGACCTAGTACCCACTG(7) SCUBE2引物对包括反向引物CEGPlR和正向引物CEGPlF ；CEGPlR序列为GACTACAGCCGTGATCCTTATTC ；CEGPlF 序列为GAGTGACAATCAGCACACCTGCT(8)ER引物对包括反向引物htRlR和正向引物EstRlF ；所述htRlR序列为，CTAGTGGGCGCATGTAGGC ；所述 EstRlF 序列为，GAACGTGGTGCCCCTCTATG(9)PR引物对包括反向弓丨物PRR和正向弓丨物PRF ；所述I3RR,GTTGTGCTGCCCTTCCATTG ；所述 PRF，GAAGCATCAGGCTGTCATTA(10)HER2引物对包括反向引物HER2R和正向引物HER2F ；所述HER2R序列为TCACCTCTCGCAAGTGCTCC ；所述 HER2F 序列为TGTGAGAAGTGCAGCAAGCC(11)GRB7引物对包括反向引物GRB7R和正向引物GRB7F ；所述GRB7R序列为，CATGGCCACCAGGGTATTAT ；所述 GRB7F 序列为，TCGCCATCTGCATCCATCTT(12) Cathepsin L2引物对包括反向引物CTSL2R和正向引物CTSL2F ；所述CTSL2R 序列为，GCCACCATTGCAGCCCTGA ；所述 CTSL2F 序列为，ACTTGTCTCACTGAGCGAGCA(13) Stromolysin 3引物对包括反向引物STMY3R和正向引物STMY3F ；所述STMY3R 序列为，ATTTACAATGGCTTTGGAGGATA ;所述 STMY3F 序列为，GGCCCTGGAGGCTGCAACAT(14)⑶68引物对包括反向引物⑶68R和正向引物⑶68F ;所述⑶68R序列为， CCTCTCCTCCACCCTGGGT ;所述 CD68F 序列为，CAATGGTTCCCAGCCCTG(15)BAG 1引物对包括反向引物BAG1R和正向引物BAG1F ;所述BAG1R序列为， TCAACCTCTTCCTGTGGACTGTTC ;所述 BAG1F 序列为，CACCGTTGTCAGCACTTGGAATA(16)GSTM1引物对包括反向引物GSTM1R和正向引物GSTM1F ;所述GSTM1R序列 为CAGGCCCAGCTTGAATITIT ;所述 GSTM1F 序列为CTCAAGCTATGAGGAAAAGAAGTACAC(17)ACTB引物对包括反向引物ACTBR和正向引物ACTBF ;所述ACTBR序列为， GAAGCATTTGCGGTGGAC ;所述 ACTBF 序列为TTCCAGCAGATGTGGATCAGC(18) GAPDH弓丨物对包括反向弓丨物GAPDHR和正向引物GAPDHF ；所述GAPDHR序列 为，GTGATGGGATTTCCATTGATGA ;所述 GAPDHF 序列为ATGAITCCACCCATGGCAAA(19)RPLP0引物对包括反向引物RPLP0R和正向引物RPLP0F ;所述RPLP0R序列 为TITCAGCAAGTGGGAAGGTGTAA ;所述 RPLP0F 序列为ACCCCAITCTATCATCAACGGGTA(20)GUS引物对包括反向引物⑶SR和正向引物⑶SF ；所述⑶SR序列为， GACACGCAGGTGGTATCAGT ;所述⑶SF 序列为，ATCCCCACTCAGTAGCCAAG(21) TFRC引物对包括反向引物TFRCR和正向引物TFRCF ；所述TFRCR序列为 TAAACTCAGGCCCATTTCCT ;所述 TFRCF 序列为ACAGCCAACTGCTITCAITT ；所述21条特异性taqman突光探针的DNA序列分别如下(1)探针 CCNB1-T 序列为ATGACTGTCTCCATTAITGATCGGITCA ；(2)探针 Ki-67-T 序列为CGGTGGITCGACAAGTGGCCTTG ；(3)探针 MYBL2_T 序列为AGGGAGGACAGACAATGCTGTGA ；(4)探针 STK15-T CTGTGGCACCCTGGACTACCTGC ；(5)探针 SURV-T TGAGAAGTGAGGGAGGAAGAAGGCAGT ；(6)探针 Bcl2-T TCCACGCCGAAGGACAGCGATG ；(7)探针 CEGP1-T GCTCGGAAGAGGGCCTGAGCTG ；(8)探针 EstRl-T TGCTGGAGATGCTGGACGC ；(9)探针 PR-T CTTACCTGTGGGAGCTGTAAGGTCTTCT ；(10)探针 HER2-T GCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGC ；(11)探针 GRB7-T GGCTCCCCACCCTTGAGAAGTGC ；(12)探针 CTSL2-T GTGGACTGTTCGCGTCCTCAAGGC ；(13)探针 STMY3-T CGGATCCTCCTGAAGCCCTTTTCGC ；(14)探针 CD68-T CCTCCAAGCCCAGATTCAGATTCGAGTC ；(15)探针 BAG 1-T GATGGTTGCCGGGTCATGTTAATTGG ；(16)探针 GSTM 1-T GACGCTCCTGATTATGACAGAAGCCAGTGG ；(17)探针 ACTB-T GAGTATGACGAGTCCGGCCCCTC ；(18)探针 GAPDH-T ACCGTCAAGGCTGAGAACGGGA ；(19)探针 RPLP0-T GAGTCCTGGCCTTGTCTGTGGAGAC ；(20)探针⑶S-T TTTGGAAAACAGCCTGTTTACTTGAGC ；(21)探针 TFRC-T GGATCTGAACCAATACAGAGCAGACATA ；
所述各条探针的5，端有FAM修饰，3 ’端有BHQ-I修饰。所述21对引物的浓度分别为10 μ M ；所述21条特异性taqman荧光探针的浓度为ΙΟμΜ;所述逆转录酶活力为4个单位每微升；所述DNA聚合酶活力为5个单位每微升；所述RNA酶抑制剂活力单位为10个单位每微升；所述RT-PCR缓冲液由Tris · Cl, KCl, Mg2+, DTT组成，ρΗ 为 8. 3 ；所述 PCR 缓冲液由 Tris · Cl，KCl, (NH4)2SO4,15mM MgCl2 组成，pH 为 8. 7。通过以下实施例详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例1、临床标本的选择和RNA提取取原发位石蜡样本，经组织切片HE染色后筛选合格组织样本，排除肿瘤细胞不足5%的样本。取6片切成10微米厚的石蜡组织片，采用北京华美生科生物技术有限公司(Qiagen，货号:74106)提取其中总RNA0总RNA需用DNase I处理，以除去DNA杂质。使用taqman PCR为 β-actin DNA(ABI，货号401846)检测是否还有 DNA残留，如果还有则需要重新用DNase I处理。定量总RNA。实施例2、逆转录21个基因的特异性引物工作液浓度为10μΜ，21个基因各取反向引物溶液
0.4μ1(终浓度为200ηΜ)混合，加入10 X RT-PCR缓冲液2 μ 1 (10为稀释倍数)，dNTP混合液4 μ 1 (终浓度为500ηΜ)，RNA酶抑制剂1 μ 1 (10个单位)，逆转录酶1 μ 1 个单位)，实施例1中提取的RNA模板50ng，其余体积用水补足。将上扩增体系混合均勻，37°C孵育60分钟。实施例3、taqman-实时荧光定量PCR21个基因分别进行荧光定量PCR检测，一个基因一个PCR反应。反应体系配制如下正向、反向两条特异性引物各200nM，10 X PCR缓冲液2 μ 1，dNTP混合液
1.6 μ 1 (200ηΜ)，DNA聚合酶0. 1 μ 1 (0. 5个单位)，taqman荧光探针ΙΟΟηΜ，实施例2中的逆转录产物0. 8 μ 1 (相当于2ng RNA模板的逆转录产物)，其余体积由水补足。扩增反应在95°C 15 分钟，95°C 10-15 秒，60°C 10-15 秒，72°C 10-15 秒，进行 30 个循环，72°C 7分钟。扩增反应结束后，记录每个基因的Ct值，代表了各个基因的表达水平。实施例4、计算复发指数(RS)根据实施例3中计算得到的各个基因的ACt，计算患者的复发指数(recurrencescore, RS)，根据复发指数判断患者的10年复发风险。具体计算和风险评估标准如下16个乳腺癌相关基因分5组，根据ACt值按组分别计算每组的分指数增值组分数=(ΔCt(Survivin)+ Δ Ct(Ki67)+ Δ Ct(MYBL2)+ Δ Ct(CCNB1)+ Δ Ct(STK15)) +5侵袭组分数=(ACt(CTSL2)+ACt(MMP11))^2HER2 组分数=0. 6* Δ Ct(GKB7)+04* Δ Ct(HEE2)ER 组分数=(0. 5*ACt(EK)+l. 5* Δ Ct(PGE) + Δ Ct(BCL2) + Δ Ct(SCUBE2)) +4未限定范围的复发指数(unsealed RS, RSu)计算方法RSu = 0. 56XHER2 组-0. 24 X ER 组 +1.04 X 增值组 +0. IOX 侵袭组+0. 25XCD68-0. 1*GSTM1_0. 12 X BAGl最终复发指数RS定义为RS = 0 IfRSu < 0
RS = 20* (RSu-6. 7) ifO 彡 RSu 彡 100RS = IOOifRSu > 100复发风险定义RS小于18 低风险大于或等于18和小于31中等风险大于或等于31 高风险本发明的试剂盒测定了人源RNA的表达，样品没有限制如，体液(包括血液、腹水)、组织细胞(肿瘤组织)等，通过提取和纯化这样的样品可制备总RNA。从总RNA中，可利用特异性引物通过逆转PCR获得对应基因的cDNA，随后以cDNA为模板，通过taqman探针-实时荧光定量PCR方法检测基因表达水平。本发明特异性引物为发明点之一。我们通过分析高通量测序数据，比较了各种引物的扩增效率，发现扩增效率除了与Tm值有关外，还与引物和DNA聚合酶的亲和力密切相关，为此我们将这种可计算的亲和力大小命名为DNA聚合酶偏好指数。随后，我们针对每个基因设计了多达数百对引物，并分别计算他们的偏好指数，优选出偏好指数接近的引物，供本发明试剂盒使用，以保实时荧光定量PCR反应过程中各基因的扩增效率保持一致。
权利要求
1. 一种定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，其特征在于由21对引物、21条特异性taqman荧光探针、10XRT-PCR缓冲液、2. 5mM dNTP混合液、逆转录酶、DNA聚合酶、10XPCR缓冲液和RNA酶抑制剂组成；所述21对引物序列分别如下(1)CCNBl引物对包括反向引物CCNBlR和正向引物CCNBlF ；所述CCNBlR序列为GCAGCATCTTCTTGGGCACA ；所述 CCNBlF 序列为 AGGTTGTTGCAGGAGACCATG(2)Ki-67引物对包括反向引物Ki-67R和正向引物Ki-67F;所述Ki-67R序列为CAACTCTTCCACTGGGACGATCCG ；所述 Ki_67F 序列为CGGCGGACTTTGGGTGCGAC(3)MYBL2引物对包括反向引物MYBL2R和MYBL2F；所述MYBL2R序列为CCTTCCTTTTGATGGTAGAGTTCCAGT ；所述 MYBL2F 序列为TGGGCCGAGATCGCCAAG(4)STK15引物对包括反向引物STK15R和正向引物STK15F ；所述STK15R序列为GACCTTCAATCATTTCAGGG ；所述 STK15F 序列为CTCCATCTTCCAGGAGGACC(5)Survivin引物对包括反向引物SURVR和正向引物SURVF ；所述SURVR序列为AGCTGTCAGCTCTAGCAAAAGGG ；所述 SURVF 序列为TGCTGTTTTGATTCCCGGGC(6)Bcl2引物对包括反向引物Bcl2R和正向引物Bcl2F；所述Bcl2R TTTCCTATGATTTAAGGGCATTTT ；所述 Bcl2F CTTCAGATGGACCTAGTACCCACTG(7)SCUBE2引物对包括反向引物CEGPlR和正向引物CEGPlF ；CEGPIR序列为GACTACAGCCGTGATCCTTATTC ；CEGPlF 序列为GAGTGACAATCAGCACACCTGCT(8)ER引物对包括反向引物htRlR和正向引物htRIF ；所述htRlR序列为，CTAGTGGGCGCATGTAGGC ；所述 EstRlF 序列为，GAACGTGGTGCCCCTCTATG(9)PR引物对包括反向引物PRR和正向引物PRF ；所述PRR，GTTGTGCTGCCCTTCCATTG ；所述 PRF，GAAGCATCAGGCTGTCATTA(10)HER2引物对包括反向引物HER2R和正向引物HER2F ；所述HER2R序列为TCACCTCTCGCAAGTGCTCC ；所述 HER2F 序列为TGTGAGAAGTGCAGCAAGCC(11)GRB7引物对包括反向引物GRB7R和正向引物GRB7F ；所述GRB7R序列为，CATGGCCACCAGGGTATTAT ；所述 GRB7F 序列为，TCGCCATCTGCATCCATCTT(12)Cathepsin L2引物对包括反向引物CTSL2R和正向引物CTSL2F ；所述CTSL2R序列为，GCCACCATTGCAGCCCTGA ；所述 CTSL2F 序列为，ACTTGTCTCACTGAGCGAGCA(13)Stromolysin 3引物对包括反向引物STMY3R和正向引物STMY3F ；所述STMY3R序列为，ATTTACAATGGCTTTGGAGGATA ；所述 STMY3F 序列为，GGCCCTGGAGGCTGCAACAT(14)⑶68引物对包括反向引物⑶68R和正向引物⑶68F；所述⑶68R序列为，CCTCTCCTCCACCCTGGGT ；所述 CD68F 序列为，CAATGGTTCCCAGCCCTG(15)BAGl引物对包括反向引物BAGlR和正向引物BAGlF ；所述BAGlR序列为，TCAACCTCTTCCTGTGGACTGTTC ；所述 BAGlF 序列为，CACCGTTGTCAGCACTTGGAATA(16)GSTMl引物对包括反向引物GSTMlR和正向引物GSTMlF；所述GSTMlR序列为CAGGCCCAGCTTGAATTTTT ；所述 GSTMlF 序列为CTCAAGCTATGAGGAAAAGAAGTACAC(17)ACTB引物对包括反向引物ACTBR和正向引物ACTBF ；所述ACTBR序列为，GAAGCATTTGCGGTGGAC ；所述 ACTBF 序列为TTCCAGCAGATGTGGATCAGC(18)GAPDH弓丨物对包括反向引物GAPDHR和正向引物GAPDHF ；所述GAPDHR序列为，GTGATGGGATTTCCATTGATGA ；所述 GAPDHF 序列为ATGATTCCACCCATGGCAAA(19) RPLPO引物对包括反向引物RPLPOR和正向引物RPLPOF ；所述RPLPOR序列为TTTCAGCAAGTGGGAAGGTGTAA ；所述 RPLPOF 序列为ACCCCATTCTATCATCAACGGGTA引物对包括反向引物⑶SR和正向引物⑶SF ；所述⑶SR序列为，GACACGCAGGTGGTATCAGT ；所述 GUSF 序列为，ATCCCCACTCAGTAGCCAAG(21) TFRC引物对包括反向引物TFRCR和正向引物TFRCF ；所述TFRCR序列为TAAACTCAGGCCCATTTCCT ；所述 TFRCF 序列为ACAGCCAACTGCTTTCATTT ；所述21条特异性taqman荧光探针的DNA序列分别如下(1)探针CCNBl-T 序列为ATGACTGTCTCCATTATTGATCGGTTCA ；(2)探针Ki_67_T 序列为CGGTGGTTCGACAAGTGGCCTTG ；(3)探针MYBL2-T 序列为AGGGAGGACAGACAATGCTGTGA ；(4)探针STK15-T CTGTGGCACCCTGGACTACCTGC ；(5)探针SURV-T TGAGAAGTGAGGGAGGAAGAAGGCAGT ；(6)探针Bcl2-T TCCACGCCGAAGGACAGCGATG ；(7)探针CEGPl-T GCTCGGAAGAGGGCCTGAGCTG ；(8)探针EstRl-T TGCTGGAGATGCTGGACGC ；(9)探针PR-T CTTACCTGTGGGAGCTGTAAGGTCTTCT ；(10)探针HER2-T GCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGC ；(11)探针GRB7-T GGCTCCCCACCCTTGAGAAGTGC ；(12)探针CTSL2-T GTGGACTGTTCGCGTCCTCAAGGC ；(13)探针STMY3-T CGGATCCTCCTGAAGCCCTTTTCGC ；(14)探针CD68-T CCTCCAAGCCCAGATTCAGATTCGAGTC ；(15)探针BAGl-T GATGGTTGCCGGGTCATGTTAATTGG ；(16)探针GSTMl-T GACGCTCCTGATTATGACAGAAGCCAGTGG ；(17)探针ACTB-T GAGTATGACGAGTCCGGCCCCTC ；(18)探针GAPDH-T :ACCGTCAAGGCTGAGAACGGGA ；(19)探针RPLPO-T GAGTCCTGGCCTTGTCTGTGGAGAC ；(20)探针GUS-T TTTGGAAAACAGCCTGTTTACTTGAGC ；(21)探针TFRC-T GGATCTGAACCAATACAGAGCAGACATA ；所述各条探针的5’端有FAM修饰，3’端有BHQ-I修饰。
2.根据权利要求1所述的定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，其特征在于所述21对引物的浓度分别为10 μ M。
3.根据权利要求1所述的定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，其特征在于所述21条特异性taqman荧光探针的浓度为10 μ Μ。
4.根据权利要求1所述的定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，其特征在于所述逆转录酶活力为4个单位每微升。
5.根据权利要求1所述的定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶活力为5个单位每微升。
6.根据权利要求1所述的定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，其特征在于所述RNA酶抑制剂活力单位为10个单位每微升。
7.根据权利要求1所述的定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，其特征在于所述RT-PCR 缓冲液由 Tris · Cl，KCl，Mg2+，DTT 组成，pH 为 8. 3。
8.根据权利要求1所述的定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，其特征在于所述PCR 缓冲液由 Tris · Cl, KCl, (NH4)2SO4,15mM MgCl2 组成，pH 为 8. 7。
全文摘要
本发明涉及功能基因组学和基因表达检测技术、分析技术。具体而言就是在人类功能基因组表达谱范围内筛选可用于乳腺癌转移和预后分子分型的一类基因，并建立检测技术，制备成试剂盒，应用于乳腺癌患者的转移和预后评估。一种定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，由21对引物、21条特异性taqman荧光探针、10×RT-PCR缓冲液、2.5mM dNTP混合液、逆转录酶、DNA聚合酶、10×PCR缓冲液和RNA酶抑制剂组成。本发明采用逆转录PCR技术结合taqman荧光定量PCR技术，采用自行设计并优化的逆转录引物、实时PCR引物和taqman荧光探针，整合了逆转录PCR试剂、taqman荧光定量PCR试剂，制成检测试剂盒，操作简单快速，检测结果更为稳定、检测成本也更低。
文档编号C12Q1/68GK102586410SQ20111002014
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者侯青, 姬云, 张泓 申请人:苏州科贝生物技术有限公司