专利名称：生物酶手性合成立普妥中间体ats-5的制作方法
技术领域：
本发明涉及手性(R)-4-氰基-3-羟基-丁酸こ酯(ATS-5，立普妥中间体)及其衍生物的酶法制备，属于酶在手性合成中的应用领域，本方法也属于绿色化学及基因工程领域。
背景技术：
(S)-4-氰基-3-羟基-丁酸こ酯(ATS-5)是生产立普妥的关键手性中间体之一，中国大多用化学法在生产。成本高，纯度低，污染尤其严重，对环境的影响非常大。用生物转化来生产这些中间体，有明显的优势。目前，Ciba, Diverva, DSM, Codixis等公司在ATS-5合成中采用酶法エ艺。在已有エ艺和知识的基础上，我们筛选得到关键酶，包括卤代醇脱卤酶，在已知蛋白结构的基础上通过半随几饱和突变和定向突变等方法增加酶活性，手性反应选择性(光学纯度e. e值上升)，热稳定性和对有机溶剂耐受能力。因此，生物催化活性 得以大大提高，反应的手性选择性也得到了加强，这就使得ATS-5的生产成本大大降低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是将提供ー种反应步骤短、成本较低、产品光学纯度高的(R)-4-氰基-3-羟基-丁酸こ酯(ATS-5)及其衍生物的制备方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是所述的手性(S)-4_氰基-3-羟基-丁酸こ酯(ATS-5)及其衍生物的制备方法，其制备过程用以下反应式表示
权利要求
1.手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(ATS-5，立普妥中间体)及其衍生物的制备方法，其制备过程用以下反应式表示
2.Agrobacterium tumefaciens齒代醇脱齒酶变体的基因和蛋白序列。变体和野生型的序列有2-12个氨基酸改变。这些变体可更高效催化反应。
3.根据权利要求I所示的手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物，其特征在于利用大肠杆菌高效表达卤代醇脱卤酶。
4.根据权利要求I所示的手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物，其特征在于利用这个大肠杆菌工程菌直接催化。
5.根据权利要求I所示的手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物，其特征在于所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、叔丁醇、己丙醇、四氢呋喃、甲基叔丁醚。
6.根据权利要求I所示的手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物，其特征在于所用缓冲溶液为无机磷酸及无机磷酸盐。
7.根据权利要求I所示的手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物，其特征在于保持体系温度在25-40摄氏度之间。
8.根据权利要求I所示的手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物，其特征在于所用的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾。
全文摘要
本发明公开了一种酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基-丁酸乙酯(ATS-5，立普妥中间体)及其衍生物的制备方法，其制备过程用以下反应式表示上式中，R为甲基，乙基(ATS-5)，丙基，丁基，或苄基，以及其它C1-C8任意取代烷基。其主要原理是在缓冲溶液中，利用基因重组的卤代醇脱卤酶催化取代化合物I中的氯，得到氰基取代的手性化合物II(ATS-5，R为乙基)。
文档编号C12P13/00GK102676597SQ20111006242
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者姚亦明, 徐霆, 韩国霞 申请人:苏州国镝医药科技有限公司