专利名称：酮化合物的立体选择性的酶促还原的方法
酮化合物的立体选择性的酶促还原的方法本发明涉及酮化合物至对应的手性羟基化合物的立体选择性的、尤其是对映选择性的酶促还原的方法，其中用对映选择性的、NADH-特异性的氧化还原酶还原酮化合物。本发明具体地涉及选出的氧化还原酶在该方法中的应用。光学活性的羟基化合物是有价值的手性结构单元，被广泛地用于合成药理学活性的化合物、芳族物质、信息素、农用化学品和酶抑制剂。因此，在制药领域中可以特别地发现对手性化合物、和因而对手性合成技术的日益增加的需要，因为在将来，外消旋的化合物难以用作药品。前手性的酮化合物的不对称还原是立体选择性的催化的一个领域，其中与化学催化相比，生物催化构成有力的竞争技术。不对称的化学氢化需要使用高毒性的且环境有害的重金属催化剂、极端的且因而能源密集的反应条件、以及大量有机溶剂。此外，这些方法经常以副反应和不足的对映体过量为特征。在自然界，前手性的酮化合物至羟基化合物的还原和逆转进行的氧化发生在许多生化途径中，在初级代谢中和在次级代谢中，在每个生物体中，且由不同类型的仲醇脱氢酶 (ADH)和氧化还原酶催化。一般而言，这些酶是辅因子依赖性的。在不同的测序计划中，在每种情况下，已经鉴别出不同生物体的许多氨基酸序列， 其中它们大抵涉及未知活性、功能和对映选择性和化学选择性的氧化还原酶。最近，基于许多实例，可以证实氧化还原酶用于工业过程的原则适用性。最近，已经能够证实，分离的氧化还原酶在含有有机溶剂的含水/有机两相系统中的应用，也是非常有效的、经济的和即使在高浓度(> 5%)也是可行的。在描述的系统中， 通常难溶于水的要还原的酮化合物因而与有机溶剂一起形成有机相。另外，可以部分地省掉有机溶剂本身。在该情况下，有机相由要还原的酮化合物形成(EP 1 383 899)。通过同时进行的仲醇氧化，实现辅酶再生，为此，在大多数情况下，使用廉价的水混溶的2-丙醇(W0 2006/087235)。2-甲基_4_戊醇或2-辛醇用于再生辅因子NADH或NADPH同样是有利的 (W0 2007/036257)。在近年来的专利文献中，可以发现许多具有不同特异性和选择性的氧化还原酶。 已经发现S-特异性的氧化还原酶和具有高对映选择性的脱氢酶的不同实例，它们几乎毫无例外地使用NADH作为辅因子，因而可以非常经济地用于上述工艺条件下。这样的S-特异性的氧化还原酶的实例是来自近平滑念珠菌(Candida parapsilosis ) (CPCR) (US 5，523，223 和 US 5，763，236; EnzymeMicrob. Technol. 1993 年 11 月；15(11):950-8) 和荚膜毕赤酵母O0ZcAia capsulata) (DE 10327454. 4)的羰基还原酶，来自红串红球菌 {Rhodococcus erythropolis) (RECR) (US 5，523，223)、褐色诺卡氏菌GVorcart/ia fusca) (Biosci. Biotechnol. Biochem. , 63(10) (1999)，第 1721-1729 页；Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003年9月；62(4) :380-6; 2003年4月洸日电子出版物)和赤红球菌 (.Rhodococcus ruber) (J. Org. Chem. 2003 年 1 月 24 日；68 O) 402-6)的羰基还原 BS° 此夕卜，描述了来自/PAot/oio/Y^/a muciIlaginosa>WtfMM (.Microbacterium spec.)、 Gordonia /Y/^ri/ 6 rii/7cia、丰对干毕赤酵母{Pichia stipitis) %WPichia trehalophila 白勺S-特异性的羰基还原酶(W0 2007/012428) 0从乳杆菌属(Lac ο如以7ΛΛ5)的生物体中鉴别出R-特异性的仲醇脱氢酶的实例 高加索酸奶乳杆菌(LacioAaci^Az1S kefir、(US 5，200，335)、短乳杆菌 GacioAaciBw1S brevis) (DE 19610984 Al; Acta CrystalIogr. D Biol. CrystalIogr. 2000 年 12 月； 56 Pt 12:1696-8)、稍小乳杆菌(L^c o如c27ΛΛs組·/7or)(DE 10119274)和肉色明串珠菌 Ueuconostoc carnosum) (W0 2007/012428) 所有这些酶具有下述缺点，即需要NADPH作为辅因子，所述NADPH实际上比NADH更昂贵，因而涉及相对高的工艺成本。"R-特异性的”氧化还原酶是指这样的酶，其将未取代的羰基化合物(例如，2- 丁酮、2-辛酮或苯乙酮)还原成对应的R-羟基化合物(即，R-2- 丁醇、R-2-辛醇和R-2-苯基乙醇)。例如，R-特异性的氧化还原酶将4-卤素-3-氧代丁酸酯还原成S-4-卤素-3-羟基丁酸酯。“S-特异性的氧化还原酶”是将未取代的羰基化合物(例如，2- 丁酮、2-辛酮或苯乙酮)还原成对应的S-羟基化合物(即，S-2- 丁醇、S-2-辛醇和S-2-苯基乙醇)的ADH。例如，S-特异性的氧化还原酶将4-卤素-3-氧代丁酸酯还原成R-4-卤素-3-羟基丁酸酯。在本申请中，术语”特异性的”是指，形成的对应的对映异构体>95%。此外，在最近的专利文献(EP1152054 Al、WO 2007/033928、WO 2006/046455、WO 2005/033094)中，描述了来自木兰假丝酵母magnoliae)属的酵母的许多非特异性的NADPH-依赖性的酶。除了 NADPH-依赖性以外，它们具有下述主要缺点，即它们不能用于具有底物偶联的辅酶再生的方法中，而是总是需要第二个酶系统来进行辅酶再生。使用葡萄糖作为协同底物的葡萄糖脱氢酶优选地用于该目的。另外，这些酶具有下述缺点，即它们通常是非特异性的，即，未取代的羰基化合物(例如，2-丁酮、2-辛酮或苯乙酮)的还原通常产生外消旋的醇；仅在例外情况下，这些酶会选择性地工作。因此，使用这些酶，通常不可能对映选择性地还原底物，诸如4-卤素-3-氧代丁酸酯、3-氧代酯或脂族酮，例如，2-辛酮。仅有非常有限数目的稳健的、NADH-依赖性的和明显R-特异性的氧化还原酶可供使用，它们可用于具有底物偶联的辅酶再生的方法中，使用仲醇、优选2-丙醇作为协同底物。描述了例如来自芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)的NADH-依赖性的R-特异性的氧化还原酶(EP 1179 595 Al)。但是，它表现出对2-丙醇非常低的活性，因此不适用于具有底物偶联的辅酶再生的方法。在WO 2007/012428 中，描述了来自粉状毕赤酵母(PicAia farinosa)和 Candida nemodendra的另外2种NADH-依赖性的R-特异性的氧化还原酶。其中已经能证实，对于来自粉状毕赤酵母的酶，使用2-丙醇的辅酶再生也是可能的，但是仅在至多15%(v/v)异丙醇的浓度。此外，已知来自赖氏菌fcei/soflia) (US 7，172,894 B2, Biosci. Biotechnol. Biochem.，70 (2)，2006,第 418_似6 页)和 iferasia (W0 2004/027055)的 NADH-依赖性的酶，其中至少来自赖氏菌的酶是R-特异性的，且据信能够实现底物偶联的辅酶再生。但是，现在已知的氧化还原酶、尤其是明显R-特异性的酶，远远不足以用于开发酮化合物的立体选择性还原的整个市场潜力。一方面，这出于下述原因关于底物范围、最佳PH以及温度稳定性和溶剂稳定性，各个酶具有非常不同的性质，它们经常相互补充。因此，即使相对类似的同源酶也可能对一种特定底物表现出完全不同的转化行为。另一方面， 并非几乎所有描述的酶都被克隆并可在足够的程度上过表达，这意味着，这些酶不可用于工业用途。为了尽可能宽广地开发酶促的不对称氢化的合成潜力，因此必须尽可能广泛地拥有一系列不同的工业上可利用的氧化还原酶。同时，可以清楚地限定对能有利地在工业上应用的酶的要求。因此，本发明的目的是，鉴别和提供稳定的、NADH-依赖性的和R-特异性的氧化还原酶，它们适用于使用底物偶联的辅酶再生将酮化合物还原为手性醇的方法。为此目的，必须提供对仲醇、尤其是对异丙醇具有尽可能高的稳定性的氧化还原酶。此外，要提供的酶应当以在大肠杆菌(Escherichia coli)中良好的表达能力(>500单位/g大肠杆菌湿生物质)为特征。由于对在大肠杆菌中的稳定性和表达能力的高要求，在本发明中已经假定，细菌酶比来自酵母的酶更优选。此外，本发明的目的是，鉴别氨基酸序列或基因序列，它们是重组表达稳定的 NADH-依赖性的、(R)-特异性的氧化还原酶，且适用于在使用酶-偶联的辅酶再生情况下的工艺技术。发明人已经发现，这样的序列通常表现出“短链”脱氢酶的已知特征，例如，用于辅因子结合的N-端Rossmann卷曲(Rossmann-Fold) GxxxGxG、在位置87处的NAG-基序(其用于稳定化中央的β-折叠片结构)和在活性中心中的由S 139、Y 152和K 156组成的高度保守的催化三联体。为了本申请的目的，使用kore Matrix BL0SUM62，通过“多路蛋白比对算法(multi-way protein alignment algorithm) ”，对蛋白序列中的各个同源氨基酸基团进行数字分配，并使用来自Sti^ptomyces hydrogenans (登记代码2bhd_Mrex)的 3 α，20 β -羟基固醇脱氢酶作为参照。由于在因特网上可得到多个具有该标签(Signatur)的氨基酸序列，需要定义其它特征，以便限制该序列库。发明人因此声明，具有所述性质的(R)-特异性的氧化还原酶必须另外表现出下述序列特征和模式
在位置37处的带负电荷的氨基酸基团
在二聚化结构域中的2个C-端基序[A; S]-S-F和[V; I]-DG-[G; A]-Y-[Τ; C; L]-[A; Τ; S]-[Q; V; R; L; P]
在位置 204-208 处的 R-ADH-标签H-[P; A]-[I; A; Q; V; L]-[G; K]-R 在位置159 (在K 156下游4个位置)处的Val或Leu 在位置178处的Asn 在位置188处的脯氨酸基团。根据该模式，从由测序计划可得到的序列库中，选择没有现有的功能分配的下述序列，克隆，并表征它们的功能。表 权利要求
1.酮化合物至对应的手性羟基化合物的立体选择性的、尤其是对映选择性的酶促还原方法，其中用对映选择性的、NADH-特异性的氧化还原酶还原酮化合物，其特征在于，为了还原该酮化合物，使用这样的多肽，其在位置204-208处表现出R-ADH-标签H-[P; A]-[I; A; Q； V; L]-[G; K]-R，且它们整体表现出下述其它结构特征⑴ N-端 Rossmann 卷曲 GxxxGxG ,(ii)在位置87处的NAG-基序，(iii)由S139、Y 152和K 156组成的催化三联体，(iv)在位置37处的带负电荷的氨基酸基团，(ν)在二聚化结构域中的2个C-端基序[A; S]-S-F和[V; I]-DG-[G; A]-Y-[Τ; C; L]-[A; Τ; S]-[Q; V; R; L; P],(vi)在位置159(在K 156下游4个位置)处的Val或Leu，(vii)在位置178处的Asn，*(viii)在位置188处的脯氨酸基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用这样的多肽来还原酮化合物，(a)该多肽包含氨基酸序列SEQID NO: 1至SEQ ID N0:7之一，或(b)其中，至少70%的氨基酸与氨基酸序列SEQID NO: 1至SEQ ID NO:7之一的氨基酸相同，或(c)该多肽由选自SEQID N0:8至SEQ ID NO: 14的核酸序列编码，或(d)编码该多肽的核酸序列在严格条件下与在(c)中提及的核酸序列之一杂交。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用通式I的酮化合物，
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用通式II的二酮作为酮化合物，
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，-由氧化还原酶/脱氢酶形成的氧化的辅因子NAD被连续再生，且-具有通SI^xRyCHOH的仲醇被用于辅因子再生，其中&和&彼此独立地是支链的或直链的C1-C8-烷基，且C总数彡3。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，选自2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇和2-辛醇的醇、优选2-丙醇分别被用作协同底物或仲醇。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，基于总体积，所述酮化合物以 3%-50%、优选5%-40%、尤其是10%-30%的量使用。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，TTN(总转化数=酮化合物的摩尔数/使用的辅因子的摩尔数)>103。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，它是在含水有机两相系统中进行。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，另外使用选自乙醚、叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷和环己烷的有机溶剂。
全文摘要
在酮化合物至对应的手性羟基化合物的立体选择性的、尤其是对映选择性的酶促还原方法中，其中用对映选择性的、NADH-特异性的氧化还原酶还原酮化合物，为了还原酮化合物，使用这样的多肽，其在位置204-208处表现出R-ADH-标签H-[P;A]-[I;A;Q;V;L]-[G;K]-R，且它们整体表现出下述其它结构特征(i)N-端Rossmann卷曲GxxxGxG，(ii)在位置87处的NAG-基序，(iii)由S139、Y152和K156组成的催化三联体，(iv)在位置37处的带负电荷的氨基酸基团，(v)在二聚化结构域中的2个C-端基序[A;S]-S-F和[V;I]-DG-[G;A]-Y-[T;C;L]-[A;T;S]-[Q;V;R;L;P]，(vi)在位置159(在K156下游4个位置)处的Val或Leu，(vii)在位置178处的Asn，和(viii)在位置188处的脯氨酸基团。
文档编号C12P41/00GK102341501SQ201080010291
公开日2012年2月1日 申请日期2010年3月3日 优先权日2009年3月5日
发明者古普塔 A., 辰切尔 A., 博布科瓦 M. 申请人:Iep 有限责任公司