专利名称：伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及维生素C生物发酵领域，具体为一种Vc 二步发酵中发酵水平的调控方法，即伴生菌活性胞外液制剂的制取及在Vc 二步发酵中的应用。
背景技术：
维生素C第二步发酵是两种菌的混合发酵过程，是一类介质依赖型发酵。发酵中伴生菌通过释放介质(活性蛋白质)促进产酸菌的产酸(古龙酸)，产酸量随其介质的释放而变化。发酵和转化中所依赖介质本身具有生物活性，其释放和发挥作用有其特定规律混菌发酵开始阶段，伴生菌(如巨大芽孢杆菌)培养4-6小时进入对数生长期，12小时进入稳定期至M小时，之后转入衰亡期，细胞破裂，芽孢释出，不再进行生长和代谢过程，也不再有介质释放，因为在发酵过程中介质的活性可保持12小时，故伴生菌高效促进产酸菌产酸的最佳时段当为12-40小时。受巨大芽孢杆菌生物活性释放的制约，产酸菌(即氧化葡萄糖酸杆菌)初期生长较慢，产酸很少，处于准闲置状态；进入发酵中期，随伴生菌活性蛋白质大量泌出，产酸菌生长加速，产酸率大幅提高；进入发酵后期，因不再有新的介质补充，产酸菌活性逐渐减弱至终止，发酵40小时后其产酸量仅为前M小时的25%。为提高发酵效率、增加产量，需充分挖掘发酵中期和后期的发酵潜能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种伴生菌活性胞外液制剂在Vc 二步发酵中的应用，解决现有技术中发酵过程可控性差、发酵水平高低波动过大、生产不稳定，生产效率难以进一步提高等问题。本发明的技术方案是一种伴生菌活性胞外液制剂在Vc 二步发酵中的应用，包括如下步骤(1)选Vc 二步发酵伴生菌接入牛肉膏蛋白胨培养基中，33°C震荡培养至生长稳定期，收集发酵醪液，以0. 45 μ m滤膜过滤弃菌体，滤液用截留分子量3-10万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至蛋白含量为10-20mg/ml，制成活性胞外液制剂，无菌分装、低温保藏；(2)在Vc 二步发酵中，当发酵进入中期和/或后期时，分别向发酵罐注入活性胞外液制剂10-12L/100M3，同时补加山梨糖水溶液至终山梨糖浓度达IO-Ilwt^。所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc 二步发酵中的应用，伴生菌为巨大芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、掷孢酵母、类脱发假丝酵母、苏云金芽孢杆菌或啤酒酵母菌等。所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc 二步发酵中的应用，伴生菌的生长稳定期为培养20-30小时。所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc 二步发酵中的应用，无菌滤液用截留分子量为3-10万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至内含10-20mg蛋白质/ml，即制成活性胞外液制剂，无菌分装、20°C以下可保藏3-5日，4°C可保藏10-20日左右。所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc 二步发酵中的应用，Vc 二步发酵进入中期和后期(35-50小时)，向发酵罐内加入活性胞外液制剂10-12L/100M3，同时应补加10-20Wt% 的发酵山梨糖水溶液。本发明具有如下优点1、Vc 二步发酵是两种菌的混合发酵，这种混菌发酵，在生产上已应用50多年，但由于对混菌间的相互作用未完全查清，实际生产中暴露出了不少问题，主要包括过程可控性差、发酵水平高低波动过大、生产不稳定，严重影响生产效率的进一步提高等。本发明可从根本上解决发酵水平高低、波动过大的难题，稳定了生产，使其真正步入高产、稳产的轨道。2、本发明依据伴生菌-巨大芽孢杆菌生物活性的释放及活性变化，开发出伴生菌活性胞外液制剂；依据产酸菌，即氧化葡萄糖酸杆菌的发酵特性，在发酵的特定阶段适量添加活性胞外液制剂，补足届时活性介质的缺失，保持发酵的高效运转。3、在Vc 二步发酵中，当发酵进入中期和后期时，适量添加活性胞外制剂和山梨糖液，可有效调节发酵朝预定的方向发展，发酵底物山梨糖浓度提高20-40%，发酵收率提高 2-4个百分点。
具体实施例方式本发明伴生菌活性胞外液制剂在Vc 二步发酵中的应用，包括如下步骤(1)选Vc 二步发酵伴生菌(巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、掷孢酵母、类脱发假丝酵母、苏云金芽孢杆菌或啤酒酵母菌等)接入牛肉膏蛋白胨培养基中，33°C 震荡培养至生长稳定期O0-30小时)，收集发酵醪液，以0. 45 μ m滤膜过滤弃菌体，滤液用截留分子量3-5万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至蛋白质含量为10-20mg/ml，制成活性胞外液制剂，无菌分装、低温保藏；(2)在Vc 二步发酵中，当发酵进入中期(发酵35-40小时)和/或后期(发酵41-50小时)时，分别向发酵罐注入活性胞外液制剂10-12L/100M3，同时补加浓度为 10-20wt%的山梨糖水溶液至终山梨糖浓度达10-1 Iwt%，发酵周期50小时，发酵转化率达 92%。实施例1 选Vc发酵组合菌G. O+B2980,组合菌中G. ο与Β2980的个数比例约为1000 1， 接入250ml三角瓶(内含牛肉膏蛋白胨培养基20ml) J9°C，震荡(180转/分)培养35小时，加活性胞外液制剂0. 2ml、山梨糖0. 4g，继续培养8小时，再加入活性胞外液制剂0. 2ml， 山梨糖0. 2g，6小时后发酵结束，发酵收率提高3%，发酵底物浓度提高37%。其中，G. ο (Gluconobacter oxydans)为产酸菌，即氧化葡萄糖酸杆菌，B2980为伴生菌，即巨大芽孢杆菌。实施例2 选组合菌G. o+B^80，组合菌中G. ο与B2980的个数比例约为1000 1，接入250ml 三角瓶(内含牛肉膏蛋白胨培养基20ml) J9°C，震荡(180转/分)培养42小时，加活性胞外液制剂0. 2ml、山梨糖0. 4g，继续发酵6小时，发酵结束，发酵收率提高2.7%，发酵底物浓度提高25%。实施例3-6 与实施例1不同之处在于(表1)表权利要求
1.一种伴生菌活性胞外液制剂在Vc 二步发酵中的应用，其特征在于，包括如下步骤(1)选Vc二步发酵伴生菌接入牛肉膏蛋白胨培养基中，33°C震荡培养至生长稳定期， 收集发酵醪液，以0. 45 μ m滤膜过滤弃菌体，滤液再用截留分子量3-10万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至蛋白含量为10-20mg/ml，制成活性胞外液制剂，无菌分装、低温保藏；(2)在Vc二步发酵中，当发酵进入中期和/或后期时，分别向发酵罐注入活性胞外液制剂10-12L/100M3，同时补加山梨糖水溶液至终山梨糖浓度达IO-Ilwt^。
2.按照权利要求1所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，其特征在于，伴生菌为巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、掷孢酵母、类脱发假丝酵母、苏云金芽孢杆菌或啤酒酵母菌等。
3.按照权利要求1所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，其特征在于，伴生菌的生长稳定期为培养20-30小时。
4.按照权利要求1所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，其特征在于，滤液用截留分子量为3-10万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至内含10-20mg蛋白质/ml，即成活性胞外液制剂，无菌分装、20°C以下保藏3-5日，4°C保藏10-20日。
5.按照权利要求1所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，其特征在于，Vc 二步发酵35-50小时的发酵中期和发酵后期，向发酵罐内加入活性胞外液制剂 10-12L/100M3，同时补加浓度为10-20Wt%的山梨糖水溶液。
全文摘要
本发明涉及维生素C第二步发酵领域，具体为一种伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用。(1)选Vc二步发酵伴生菌接入牛肉膏蛋白胨培养基等中，33℃震荡培养至生长稳定期，收集发酵醪液，以0.45μm滤膜过滤弃菌体，滤液再用截留分子量3-5万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至蛋白含量为10-20mg/ml，制成伴生菌活性胞外液制剂，无菌分装、低温保藏；(2)在Vc二步发酵中，当发酵进入中期和/或后期时，分别向发酵罐注入活性胞外液制剂10-12L/100M3，同时补加山梨糖水溶液至山梨糖终浓度达10-11wt％。本发明可解决现有技术中发酵过程可控性差、发酵水平高低波动过大、生产不稳定、严重影响生产效率等问题。
文档编号C12R1/07GK102181504SQ20111006243
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月15日 优先权日2011年3月15日
发明者姚岚, 姜铭妍, 安海英, 宫英姿, 张忠泽, 张海宏, 徐慧, 徐莹, 杨伟超, 汲涌, 荆士华, 陈宏权, 韩利涛 申请人:东北制药集团股份有限公司, 中国科学院沈阳应用生态研究所