专利名称：一株胶冻样芽孢杆菌及其用途的制作方法
一株胶冻样芽孢杆菌及其用途
技术领域：
本发明属于微生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一株胶冻样芽孢杆菌，还涉及所述胶冻样芽孢杆菌作为生物硅肥的用途。
背景技术：
硅在国际土壤界被列为继氮、磷、钾之后的第四大元素肥料。主要用于水稻、小麦、 玉米等喜硅作物，尤其是水稻对硅最敏感。水稻素有硅酸植物之称，在缺硅土壤上施用硅肥可以增加水稻分蘖数，提高有效收获穗数，还可以提高结实率，促进干物质的累积进而增加产量，并有改善米质的作用；另外，硅肥抗稻瘟病的效果最显著，主要表现为增加水稻自身抗病能力，即使水稻感染某些病害，也可以使病斑硅质化，控制病斑发展；其次是抗褐变穗、 纹枯病。目前，田间施用的硅肥主要是含硅酸盐的工业废渣，如钢铁冶炼渣、炼铜渣、炼铝赤泥、粉煤灰硅钙肥和黄磷渣以及水泥窑灰和硅镁钾肥等，这些肥料的有效硅含量不稳定， 而且其中的重金属离子也难以除去。所以长期施用这些肥料会对土质造成严重的影响。土壤中含有大量的硅，二氧化硅重量百分含量是20% -80%，但其绝大部分处于结晶体中，不能被植物吸收利用。土壤有效硅是指能被当季作物吸收利用的硅，其中包括土壤溶液中的单硅酸及各种易于转化为单硅酸的硅形态，例如多硅酸、交换态硅以及一部分胶态硅等。胶冻样芽孢杆菌通常又称之为硅酸盐细菌，其重要特性是能够分解长石、云母等矿物，释放出钾和硅，也能分解磷灰石，释放出磷，还能够分泌出植物生长刺激素及多种酶， 增强作物对一些病害的抵抗力。目前，这类细菌是用作生物肥料的最好菌种，它能够促进土壤无效硅磷钾的转化，增加土壤硅磷钾的供给，提高作物产量。CN101781152A公开了一种多效活性硅肥及其生产工艺，它主要以富含二氧化硅的固体废弃物或矿物为原料，经过理化处理后复配具有溶硅能力的硅酸盐细菌及其保护促进剂并选择性地添加作物生长所需营养元素。该肥料产品可直接使用或掺混其他化肥、复合肥或有机肥料使用，可获得显著的增产增收、抗病抗逆、改良品质的综合效果。CN1504563A公开了一种生产高密度硅酸盐细菌菌剂的工艺。该种微生物为胶质芽孢杆菌。通过固体发酵方法生产出高密度的胶质芽孢杆菌菌剂。CN1379083公开了硅酸盐细菌及含有硅酸盐细菌的肥料，该菌是土壤芽胞杆菌。菌体为长杆状(1.0-1. 5X3-5 μ m)，两端钝圆，幼龄时周生鞭毛，革兰氏反应阴性，菌体外有肥厚的荚膜，菌体内往往有1-2个颗粒体。具有高效分解释放矿物和土壤中钾、磷，固定空气中的氮素，产生多种生理活性物质的能力。以该细菌为有效成分的生物钾肥，可改善作物钾素营养，提高作物产量和品质，改良土壤。本发明提供一株具有较强解硅能力的胶冻样芽孢杆菌，该菌施入土壤后能有效地分解含硅矿物。该胶冻样芽孢杆菌菌株对以后微生物肥料的生产具有非常重要的指导意义。
发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一株具有较强解硅能力的胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，其保藏编号 CGMCCN0. 4667。本发明的另一个目的是所述胶冻样芽孢杆菌在制备微生物肥料中的用途。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一株胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，它已于2011年3月 15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号CGMCC No. 4667。本发明胶冻样芽孢杆菌CGMCC No. 4667的获得方法，其特征在于该方法的步骤如下A、制备出发型菌株的菌悬液挑取出发菌株ACCC 10013单菌落，接入由酵母浸膏粉5g/l、蛋白胨10g/l与氯化钠5g/l，pH7. 2-7. 4组成的简单培养基中，在温度32°C与ISOrpm的条件下恒温摇床上培养 16-20h ；然后，取5ml培养菌液加到装有玻璃珠和45ml无菌水三角瓶中，以转速ISOrpm进行震荡培养20min，制成均勻的菌悬液，再用无菌水稀释至10_4后备用；B、紫外线诱变及强解硅性能菌株的选育将步骤(A)制备的菌悬液加入到平板中，菌液厚度为0. 2cm，让其在距20瓦紫外灯30cm处照射5min，进行紫外诱变，紫外诱变结束后，立即将该菌液涂布在含有二氧化硅的固体培养基上，在温度恒温培养箱中避光培养5-7d ；所述的固体培养基是由蔗糖10_20g/l、磷酸氢二钾0. 5_5g/l、氯化钠0. 2_5g/l、 二氧化硅l-10g/l、硫酸镁0. 2-5g/l、碳酸钙l-10g/l、酵母膏0. 4_5g/l、琼脂粉18g/l， pH7. 2-7. 4 组成的；C、摇瓶解硅能力的验证挑取在步骤(B)得到的解硅圈透明带最大6mm单菌落接入种子培养基中，同时挑取其他解硅圈透明带较窄的2、3、4mm的三个单菌落进行对照试验，使用恒温摇床在温度 32°C与180rpm的条件下培养3d，然后取发酵液10ml，稀释2倍，在12000-18000rpm的条件下离心5min，去除菌体；取上清液，然后测定该上清液中可溶性硅含量；根据该上清液中可溶性硅含量判断这些菌的解硅能力大小；所述的种子培养基是由淀粉5_20g/l、磷酸氢二钾3-10g/l、硫酸铵l_5g/l、酵母膏0. 5-5g/l、蔗糖3-10g/l、硫酸镁2-5g/l、碳酸钙l_5g/l、二氧化硅Ι-lOg/l、三氯化铁 0. 02-lg/l，ρΗ7· 2-7. 4 组成的。所述胶冻样芽孢杆菌CGMCC No. 4667的培养方法，其特征在于该方法步骤如下(1)菌种活化接种胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO. 4667至斜面培养基，在温度下培养48h ；所述的斜面培养基组成如下蔗糖10_20g/l、磷酸氢二钾0.5_5g/l、氯化钠 0. 2-5g/l、二氧化硅l-10g/l、硫酸镁0. 2-5g/l、碳酸钙Ι-lOg/l、酵母膏0. 4_5g/l、琼脂粉 10-20g/l, ρΗ7· 2-7. 4 ；
(2)种子培养在500ml三角瓶中装入IOOml液体种子培养基，灭菌，然后把步骤 (1)得到的活化菌种接至种子培养基中，在温度32°C与ISOrpm的条件下培养16_20h，制得种子液；所述种子培养基组成如下淀粉5_20g/l、磷酸氢二钾3-10g/l、硫酸铵l_5g/l、酵母膏0. 5-5g/l、蔗糖3-10g/l、硫酸镁2-5g/l、碳酸钙l_5g/l、二氧化硅1-lOg/l、三氯化铁
0.02-lg/l, pH 7. 2-7. 4 ；(3)发酵培养将培养好的种子液取5ml接入IOOml发酵培养基中，在温度32°C恒温摇床中ISOrpm培养10h，得到发酵液；所述发酵培养基组成如下蔗糖l_5g/l、磷酸氢二钾l_5g/l、酵母膏0. 7_5g/l、硫酸铵 0. 2-5g/l、大豆蛋白胨 l_5g/l、硫酸镁 0. 2-5g/l，ρΗ7· 2-7. 4。本发明还涉及所述胶冻样芽孢杆菌在制备微生物肥料中的用途。根据本发明的一种优选实施方式，所述的微生物肥料是微生物硅肥。下面将更详细地描述本发明。本发明是以ACCC10013胶冻样芽孢杆菌菌株作为出发型菌株，通过紫外诱变方法，以平板解硅圈大小进行特征菌落挑选，再通过摇瓶解硅实验进行验证，并在土壤中进行解硅能力的测定，最终获得了这株胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，该菌株已于2011年3月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO. 4667。所述的胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC 4667具有如下特征1)菌体形态特征菌体粗、稍弯曲长杆状，有厚荚膜。菌体大小为(1.0
1.2) X (2. 5 7. 0) μπι ；2)芽孢形态特征芽孢囊微膨大。椭圆形中生，芽孢内不着色。3)菌落形态特征在硅酸盐细菌专用培养基平板上菌落为圆形，如半粒玻璃球； 凸起，凸起度大于45度；无色透明，5-6天后中部有淡黄色的浑浊点，边缘透明；表面光滑， 粘稠，弹性大，可拉成丝状。好氧或兼性厌氧生长。4)生理生化特性革兰氏染色阴性，在植物根际具有解磷、解钾、解硅矿物作用， 有一定固氮作用。5)微生物学特征好氧或兼性厌氧生长，接触酶反应阳性，氧化酶或卵磷脂酶反应阴性，在无氮培养基上生长良好，能很好地利用葡萄糖、蔗糖作为碳源，在酵母浸膏粉蛋白胨氯化钠培养基中生长略弱，只能形成很薄的荚膜，能水解淀粉，生长温度10-45°C。ACCC10013胶冻样芽孢杆菌菌株作为出发型菌株进行诱变步骤如下A、制备出发型菌株的菌悬液挑取出发菌株(ACCC 10013)单菌落，接入下面将要描述的简单培养基(a)中，在 32°C与ISOrpm的恒温摇床上培养16_20h。然后，取5ml培养菌液加到装有一些玻璃珠和 45ml无菌水三角瓶中，以转速ISOrpm进行振荡培养20min，制成均勻的菌悬液，再用无菌水稀释至10_4后备用。所述培养时所使用的培养装置是本技术领域的技术人员熟知的培养装置。胶冻样芽孢杆菌平板培养设备可以是恒温培养箱，像实验室用的恒温培养箱，例如上海森信实验仪器有限公司，上海人和科学仪器有限公司生产的恒温培养箱。菌悬液制备使用恒温摇床，例如北京安必升发展有限公司，北京恒奥科技有限公司等销售的恒温摇床。B、紫外线诱变及强解硅性能菌株的选育将步骤(A)制备的菌悬液加入到平板中，菌液厚度为0. 2cm，让其在距20瓦紫外灯30cm处照射5min，进行紫外诱变，紫外诱变结束后，立即将该菌液涂布在下面将要描述的含有二氧化硅的固体培养基(b)上，在恒温培养箱中避光培养5-7d。使用的诱变设备是本技术领域技术人员熟知的超净工作台，例如北京昌平长城空气净化设备工程公司生产的超净工作台。使用的玻璃仪器和实验工具都是本技术领域技术人员熟知的实验室常用器具，如三角瓶，平板，酒精灯，玻棒等。胶冻样芽孢杆菌在含有石英粉、长岭石、玻璃粉等含有二氧化硅的培养基中能够合成出有机酸、氨基酸、多糖等各种代谢产物。摇瓶试验表明，这些有机酸、氨基酸、多糖代谢产物具有络合矿物中各种金属离子的有机基团，并且它们本身也具有一定的酸溶作用， 因此它们均能够破坏高岭石晶体结构，释放出其晶体中存在的铝、硅。这些试验还表明，各种代谢产物在浸出硅酸盐矿物时具有一种协同作用，三者混合物的浸出硅酸盐矿效果明显好于它们各自效果(参见文献孙德四、张贤珍、张强，“硅酸盐细菌代谢产物对硅酸盐矿物的浸溶作用研究”，《矿冶工程》2006年第沈卷第3期)，所以在初筛固体平板培养基中加入二氧化硅，经过培养后在平板上会出现明显的解硅透明圈。经过5-7d的培养后，平板上会出现明显的环状解硅圈透明带，根据紫外光诱变效果差异，解硅圈透明带宽度2-5mm，经过二十多次反复实验，终于发现一株透明带宽约6mm 的单菌落，挑取该单菌落进行下一步的摇瓶验证试验。C、摇瓶解硅能力的验证挑取解硅圈6mm的单菌落接入种子培养基(c)中，同时挑取其他透明带较窄的2、 3,4mm的三个单菌落做对照试验，使用恒温摇床在温度32°C与ISOrpm的条件下培养3d，然后取发酵液10ml，稀释2倍，在12000-18000rpm的条件下离心5min，去除菌体。取上清液， 然后采用本技术领域技术人员熟知的钼蓝比色法(参见“土壤农化分析第三版”，中国农业出版社出版，2000年)测定该上清液中的可溶性硅。根据在该上清液中可溶性硅含量可以判断这些菌的解硅能力大小。在本发明中，所用的离心设备为sigma公司生产的离心机，也可以使用其他公司生产的同类产品，例如上海化工机械厂、长沙英泰仪器有限公司等销售的离心机。经过测定，本发明的胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO. 4667在摇瓶中的解硅能力可以达到25.6yg/ml，比所述的出发菌株(摇瓶解硅能力4.8yg/ml)提高了 533%，比其他对照菌株分别提高了(解硅圈2mm的单菌落摇瓶解硅能力14.79yg/ml)173%，(解硅圈 3mm的单菌落摇瓶解硅能力16. 8μ g/ml) 152%与(解硅圈4mm的单菌落摇瓶解硅能力为 21. 33 μ g/ml) 120. 7%。本发明胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO. 4667培养方法的步骤如下(1)菌种活化接种胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO. 4667至斜面培养基(b)，在温度 280C下培养48h。使用的培养设备与前面提到的恒温培养箱相同，使用的实验器具为常用的实验室器具，例如接种环，玻璃试管，酒精灯等。(2)种子培养在500ml三角瓶中装入IOOml液体种子培养基(c)，灭菌，然后把步骤(1)得到的活化菌种接至种子培养基(c)中，在温度32°C与ISOrpm的条件下培养16_20h，制得种子液。其中灭菌使用的灭菌锅是一般化验室所使用的普通型号灭菌锅，例如北京华威兴业厂，北京京仪东方科技有限公司等销售的灭菌锅。恒温培养使用的恒温摇床与前面提到的相同。(3)发酵培养将培养好的种子培养液取5ml接入发酵培养基中(500ml三角瓶装 IOOml培养液)，将接好种的发酵液放入32°C恒温摇床中ISOrpm培养10h，即获得发酵液。本发明胶冻样芽孢杆菌CGMCC 4667培养使用的培养基组成如下(a)简单培养基酵母浸膏粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l，pH7. 2-7. 4。(b)斜面培养基(与固体平板培养基相同)蔴糖10_20g/l、磷酸氢二钾0. 5-5g/ 1、氯化钠0. 2-5g/l、二氧化硅l-10g/l、硫酸镁0. 2-5g/l、碳酸钙Ι-lOg/l、酵母膏0. 4_5g/ 1、琼脂粉 18g/l，pH7. 2-7.4。(c)种子培养基淀粉5_20g/l、磷酸氢二钾3-10g/l、硫酸铵l_5g/l、酵母膏 0. 5-5g/l、蔗糖3-10g/l、硫酸镁2-5g/l、碳酸钙l_5g/l、二氧化硅Ι-lOg/l、三氯化铁 0. 02-lg/l, pH 7. 2-7. 4。(d)发酵培养基的成分为蔗糖l_5g/l、磷酸氢二钾l_5g/l、酵母膏0. 7_5g/l、硫酸铵 0. 2-5g/l、大豆蛋白胨 l_5g/l、硫酸镁 0. 2-5g/l、pH7. 2-7. 4。其中所涉及的各种实验药品试剂均为普通的实验用试剂，在化学试剂公司均可购买到。例如所用酵母浸膏粉是由北京奥博星公司生产销售的，氯化钠、七水硫酸镁等是从秦皇岛化学试剂公司直接购得的。本发明还涉及胶冻样芽孢杆菌菌株CGMCC 4667在制备微生物肥料中的用途，特别地在制备微生物硅肥中的用途。下面对本发明胶冻样芽孢杆菌菌株CGMCC 4667进行了土壤培养试验与水稻盆栽试验。一、胶冻样芽孢杆菌的土壤培养试验试验步骤如下(1)取水稻土阴干，过2mm筛；(2)测定该水稻土的饱和含水量；土壤饱和含水量测定方法如下取一定量试验土壤放入布什漏斗中，不断加水至基本不再滴水，过夜。取试验土放入铝盒中称重后用酒精灼烧至干，再称重。根据试验前后土壤重量计算含水量。(3)菌剂解硅制备胶冻样芽孢杆菌菌剂草炭与胶冻样芽孢杆菌种子液重量比5 2的条件下用草炭吸附在前面制备的胶冻样芽孢杆菌种子液上；取两份上述水稻土 500g，分别加入2g胶冻样芽孢杆菌ACCC 10013菌剂和本发明胶冻样芽孢杆菌CGMCCN0. 4667菌剂，完全混勻后装入500ml烧杯中，加水至土壤达到饱和含水量状态，烧杯口用塑料膜封口后扎少量孔，最后放到25°C培养箱中，分别在第1、2、4、 6、8周测定土壤中有效硅、水溶性硅含量。根据“土壤农化分析”(中国农业出版社，2000年，第三版)描述的钼蓝比色法测
定有效硅、水溶性硅含量。与此同时进行不加胶冻样芽孢杆菌菌剂的对照试验，试验步骤与前面相同。
二、胶冻样芽孢杆菌的水稻盆栽试验1)取水稻土阴干，过2mm筛；2)测定该土的饱和含水量，测定方法同前；3)试验处理
权利要求
1.一株胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，它已于2011年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号CGMCC No. 4667。
2.根据权利要求1所述胶冻样芽孢杆菌CGMCCNo. 4667的获得方法，其特征在于该方法的步骤如下A、制备出发型菌株的菌悬液挑取出发菌株ACCC 10013单菌落，接入由酵母浸膏粉5g/l、蛋白胨10g/l与氯化钠 5g/l，pH7. 2-7. 4组成的简单培养基中，在温度32°C与ISOrpm的条件下恒温摇床上培养 16-20h ；然后，取5ml培养菌液加到装有玻璃珠和45ml无菌水三角瓶中，以转速ISOrpm进行振荡培养20min，制成均勻的菌悬液，再用无菌水稀释至10_4后备用；B、紫外线诱变及强解硅性能菌株的选育将步骤(A)制备的菌悬液加入到平板中，菌液厚度为0.2cm，让其在距20瓦紫外灯 30cm处照射5min，进行紫外诱变，紫外诱变结束后，立即将该菌液涂布在含有二氧化硅的固体培养基上，在温度28°C恒温培养箱中避光培养5-7d 所述的固体培养基是由蔗糖10-20g/l、磷酸氢二钾0. 5-5g/l、氯化钠0. 2-5g/l、 二氧化硅l-10g/l、硫酸镁0. 2-5g/l、碳酸钙l-10g/l、酵母膏0. 4_5g/l、琼脂粉18g/l， pH7. 2-7. 4 组成的；C、摇瓶解硅能力的验证挑取在步骤⑶得到的解硅圈透明带最大6mm单菌落接入种子培养基中，同时挑取其他解硅圈透明带较窄的2、3、4mm的三个单菌落进行对照试验，使用恒温摇床在温度32°C与 180rpm的条件下培养3d，然后取发酵液10ml，稀释2倍，在12000-18000rpm的条件下离心 5min，去除菌体；取上清液，然后测定该上清液中的可溶性硅；根据在该上清液中可溶性硅含量判断这些菌的解硅能力大小；所述的种子培养基是由淀粉5-20g/l、磷酸氢二钾3-10g/l、硫酸铵l_5g/l、酵母膏0. 5-5g/l、蔗糖3-10g/l、硫酸镁2-5g/l、碳酸钙l_5g/l、二氧化硅Ι-lOg/l、三氯化铁 0. 02-lg/l，ρΗ7· 2-7. 4 组成的。
3.根据权利要求1所述胶冻样芽孢杆菌CGMCCNo. 4667的培养方法，其特征在于在于该方法步骤如下(1)菌种活化接种胶冻样芽孢杆菌CGMCCNO. 4667至斜面培养基，在温度下培养48h ；所述的斜面培养基组成如下蔗糖10_20g/l、磷酸氢二钾0. 5-5g/l、氯化钠0. 2-5g/l、 二氧化硅l-10g/l、硫酸镁0. 2-5g/l、碳酸钙l-10g/l、酵母膏0. 4_5g/l、琼脂粉10_20g/l， ρΗ7· 2-7. 4 ；(2)种子培养在500ml三角瓶中装入IOOml液体种子培养基，灭菌，然后把步骤(1)得到的活化菌种接至种子培养基(c)中，在温度32°C与ISOrpm的条件下培养16-20h，制得种子液；所述种子培养基组成如下淀粉5-20g/l、磷酸氢二钾3-10g/l、硫酸铵l_5g/l、酵母膏0. 5-5g/l、蔗糖3-10g/l、硫酸镁2-5g/l、碳酸钙l_5g/l、二氧化硅Ι-lOg/l、三氯化铁 0. 02-lg/l, pH 7. 2-7. 4 ；(3)发酵培养将培养好的种子液取5ml接入IOOml发酵培养基中，在温度32°C恒温摇床中ISOrpm培养10h，得到发酵液；所述发酵培养基组成如下蔗糖l_5g/l、磷酸氢二钾l_5g/l、酵母膏0. 7-5g/l、硫酸铵 0. 2-5g/l、大豆蛋白胨 l_5g/l、硫酸镁 0. 2-5g/l，ρΗ7· 2-7. 4。。
4.根据权利要求1所述的胶冻样芽孢杆菌在制备微生物肥料中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的微生物肥料是微生物硅肥。
全文摘要
本发明涉及一株经过紫外诱变获得的具有较强解硅能力的胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，其保藏编号为CGMCCNO.4667。本发明还涉及所述菌株的用途。通过试验证明，该菌株使土壤中有效硅、水溶性硅含量提高20％以上；能促进根系生长，根系干重增加可达30％以上；水稻分蘖数增加20％以上；水稻的产量提高10％以上；同时能够使收获水稻植株中全氮含量增加7.4％、全磷含量增加7.41％、全钾含量增加3.72％、全硅含量增加7.89％。
文档编号C12R1/07GK102212496SQ201110124488
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月13日 优先权日2011年5月13日
发明者孙杉杉, 庄钟娟, 张财源, 徐志文, 朱瑞艳, 杜迎辉, 苏海榆 申请人:领先生物农业股份有限公司