专利名称：乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及本生物检测技术领域，特别涉及一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针。
背景技术：
乙型肝炎病毒能引起人体的慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，抗病毒治疗是治疗乙型肝炎病毒的主要措施；核苷类似物是最常见的治疗乙肝病毒药物，阿德福韦酯作为一种新型的核苷类抗乙肝病毒药物，于2005年在我国进入临床治疗。阿德福韦酯还是一种很好的拉米夫定治疗无效补救药，其可以抑制乙肝病毒多聚酶或竞争性参与乙肝病毒的复制，从而中止乙肝病毒DNA链的延长；然而由于cccDNA的存在，乙肝的治愈是一个漫长的过程，随着乙肝患者服药时间的延长，很多患者会出现乙肝病毒反弹和肝病加重等耐药症状， 病毒的耐药严重影响着后续抗病毒治疗的疗效。大量研究表明，乙肝病毒阿德福韦酯耐药株的耐药位点主要位于乙肝病毒P基因B区的rtA181V/T位点或D区的rtN236T位点，这些位点的变异显著的导致对阿德福韦酯的敏感性下降；由于乙肝病毒对阿德福韦酯耐药与拉米夫定等药物耐药有着不同的耐药机制，所以，对阿德福韦酯耐药患者进行耐药突变株检测确证，从而提供针对性个性化的药物治疗方案有着十分重要的意义。目前基因型的耐药检测已经是核苷(酸)类似物抗病毒治疗的常规检测手段。 目前已报道的检测乙肝病毒耐阿德福韦酯突变株的方法包括直接测序法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)、基因芯片，焦磷酸测序、实时荧光定量PCR法等方法，这些方法各有利弊，并且有些检测方法的弊端暂时还没有较好的解决办法。1、直接测序法DNA直接测序法一直被认为是检测基因突变的金标准，直接测序包括PCR产物直接测序与克隆测序，PCR产物直接测序是将乙肝病毒基因组的逆转录酶区直接扩增后测序分析的方法，该方法能测定各种突变，并能够发现可能的未知耐药变异位点，也是最常用的基因型耐药检测方法之一。但直接PCR测序对于少量耐药突变株的检测敏感性较差，只有当耐药突变株达到病毒准种的20% -30%以上时才能被检测到。克隆测序即将PCR产物扩增后连接载体转化细菌，挑取单克隆菌落克隆进行测序分析，这种方法虽然灵敏度高，但克隆测序繁琐且价格昂贵，也不适用于大规模筛选。2、PCR和限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)PCR-RFLP法是最早用于核苷类似物的耐药检测的方法之一。RFLP技术是利用限制性内切酶专一性识别并切割DNA序列的特点，不同的序列就会被切割成长短不一的DNA 片断，再通过凝胶电泳观察酶切结果，然后对酶切图像进行多态性分析找出差异，PCR-RFLP 法经济且简便快速，具有较强的灵敏性，能检测出在病毒总体中大于5%的突变株，曾广泛用于检测乙肝病毒拉米夫定的耐药突变，闰杰等(2008)使用该技术能很好的检测乙肝病毒的阿德福韦酯耐药突变株。然而PCR-RFLP的缺陷也是很明显的，该方法没法检测未知的突变位点，对于每一个可能的突变，必须特别设计单独的核酸内切酶，然而某些突变的特异性内切酶可能并不存在，且该方法对多位点联合突变可能无能为力。Hong等将这种技术MALDI-TOF MS结合，从而开发出限制性片段质谱多态性 (RFMP)的方法，即利用MALDI-TOF MS技术来检测PCR-RFLP酶切后的产物，该方法比普通的凝胶电泳有更高的灵敏度、准确度和分辨率。Kim等报道该方法用于拉米夫定YMDD位点耐药检测，最低可检测出的耐药病毒。RFMP的方法虽然比PCR-RFLP灵敏度高，但它还是基于PCR-RFLP的，所以具有PCR-RFLP —样的缺点，且价格昂贵，很难在临床推广应用。3、基因芯片技术 基因芯片技术是根据分子间特异性地相互作用的原理，固体芯片表面按一定的阵列集成了大量的特异目标探针，能与待测的有荧光标记的样品核酸通过碱基互补杂交反应，通过激光共聚焦系统检测到杂交信号，数据通过处理获取基因的序列信息。基因芯片技术广泛应用于基因突变的检测，且检测精度很高，对于检测耐药乙肝病毒是可靠和有用的一种工具；目前已经有通过基因芯片技术检测乙肝病毒拉米夫定耐药的报道，但目前尚无基因芯片方法检测ADV耐药的报道。生物芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、成本低等特点，其缺点是费用很高，数据可能需要专业的生物信息学人员分析，只能检测已知的突变位点，检测低拷贝乙肝病毒不够灵敏等。4、焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术是一种新兴的酶联级联测序技术，由Nyren等人于1987年发明， 该技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在初始的反应体系中不含有四种dNTP，当特异性引物引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，产生的荧光信号强度与聚合的dNTP个数成正比，反应所剩余的dNTP可被三磷酸腺苷双磷酸酶降解，通过检测荧光的释放和强度，从而达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术在检测单核苷酸多态性(SNP)，遗传多态性分析，分子诊断与病毒分型、甲基化分析、法医鉴定等方面有这很好的应用价值。焦磷酸测序技术不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，该方法对待测样品的制备和处理比Sanger测序法要简单更快速，具有大通量、低成本、快速、直观的特点。Lindstrom等报道采用焦磷酸测序法来检测拉米夫定耐药，最低可检出10%变异病毒。宋家武等(2005)应用该技术建立了高通量测定乙型肝炎病毒YMDD突变区的方法，质粒标准品的突变检出率及重复率均达100%，而血清标本达98. 8%。可见， 该技术还有高精度的特点。但由于焦磷酸测序技术一次仅能精确检测大约40bp的碱基，故并不能代替常规的测序技术，且该技术的成本要高于Sanger测序法，针对不同变异位点还要设计相应的特异引物方能检测等缺点；目前尚无焦磷酸测序法检测ADV耐药的报道。现有技术中还没有一种荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸试剂盒。
发明内容
本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种具有高度的特异性、 灵敏度与准确性、且技术操作简便、自动化程度高的乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸试剂盒。为了实现上述目的本发明采取的技术方案是一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒，该试剂盒含有(1)荧光定量PCR反应液其中包括DEPC处理水、具有5，一 3，外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10X荧光定量PCR Buffer、含有Mg2+离子的溶液、rtl81位点正向引物、rtl81位点反向引物、rtl81A 位点探针、rtl81V位点探针、rtl81T位点探针、rtN236T检测试剂盒特有的rt236位点正向引物、rt236位点反向引物、rt236N位点探针和rt236T位点探针；①181位点引物和探针rtl81位点正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示5' TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3'rtl81位点反向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示5' AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3'rtl81A 探针序列如序列表中 SEQ ID 而.3所示5' TTCTCHTGGCTCAGTTT 3'rtl81V 探针序列如序列表中 SEQ ID NO. 4 所示5' TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3'rtl81T 探针序列如序列表中 SEQ ID NO. 5 所示5' TTCTCHTGACTCAGTTTA 3'②236位点引物和探针rt236位点正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示5' TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3'rt236位点反向引物序列如序列表中SEQ ID N0. 7所示5' CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3'rt236N 探针序列如序列表中 SEQ ID N0. 8 所示5' ATACATTTRAACCC 3'rt236T 探针序列如序列表中 SEQ ID N0. 9 所示5' ATACATTTRACCCC 3'；其中，上述探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中，Y = (C/ T)，R = (A/G)，H = A/T/C ；(2) DNA 提取液①溶液A，为聚乙二醇6000 ；②溶液B，其中包括EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tris_HCl、 NP-40(乙基苯基聚乙二醇)；(3)质控品①阴性质控品，为不含外源片段的PSG-TS载体质粒DNA片段；②阳性质控品，检测rtl81 时，为 1. 0 X 106copy/mL 的含有 rtl81A/rtl81V/rtl81T 相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1. 0 X 106copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；③临界阳性质控品，检测rtl81时，为1. 0X 104copy/mL的含有rtl81A/rtl81V/ rtl81T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1. 0 X 104copy/mL的含有rt236N/rt236T 相应基因组的DNA片段；(4)工作标 准品检测rtl81时，为PSG_TSrtl81的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rtl81A/rtl81V/rtl81T区间的162个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测rt236时，为PSG-TS rt236的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt236N/rt236T区间的153个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；该2个重组质粒都在大肠杆菌DH5 α中增殖。具体包括a、工作标准品 1，为 1. OX 107copy/mL 的 PSG-TS rtl81 质粒 DNA 溶液或 1. 0X107copy/mL 的 PSG-TS rt236 质粒 DNA 溶液；b、工作标准品 2，为 1. 0X106copy/mL 的 PSG_TSrtl81 质粒 DNA 溶液或 1. 0X106copy/mL 的 PSG-TS rt236 质粒 DNA 溶液；c、工作标准品 3，为 1. OX 105copy/mL 的 PSG-TS rtl81 质粒 DNA 溶液或 1. 0X105copy/mL 的 PSG-TS rt236 质粒 DNA 溶液；d、工作标准品 4，为 1. OX 104copy/mL 的 PSG-TS rtl81 质粒 DNA 溶液或 1. 0X104copy/mL 的 PSG-TS rt236 质粒 DNA 溶液。其中荧光探针的5，端修饰的荧光染料选自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、VIC、ROX, Cy3、 Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU 或 NEP ；3，端修饰的荧光染料选自=TAMRA, Eclipse、BHQU BHQ2、 BHQ3 或 DABCYL。所述DNA提取液由溶液A和溶液B组成；
所述溶液A，为聚乙二醇6000 ；所述溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。所述具有5’ 一 3’外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。所述荧光定量PCR反应液各组分含量的配比为DEPC处理水用量27. 5 μ L ；浓度为5U/ μ L的热启动Taq酶用量0. 3 μ L ；浓度为lOmmol/L的dNTPs用量1 μ L ;10X荧光定量PCR Buffer用量5 μ L ；浓度为25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L，浓度为10 μ mol/L的正向引物用量1.6yL、浓度为10 μ mol/L的反向引物用量1.6yL、浓度为10 μ mol/L的探针用量lyL。其中检测rtA181V/T时，PCR反应液中包含的引物为rtl81位点正向引物和 rtl81位点反向引物，探针为rtl81A位点探针、rtl81V位点探针和rtl81T位点探针；检测 rtN236T时，PCR反应液中包含的引物为rt236位点正向引物和rt236位点反向引物，探针为rt236N位点探针和rt236T位点探针；所述聚乙二醇6000的浓度为15% ；所述乙二胺四乙酸浓度为0.5% ；所述 Tris-HCl的pH值为8. 0 ；所述乙基苯基聚乙二醇的浓度为0. 1%。本发明实施例还提供利用所述的试剂盒检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸的检测方法，包括下列步骤(1)采集样品采集人血浆样品，离心分离，上清即为血清样品；(2)样品处理取待测血清100 μ L，加入等量15%溶液Α，混勻，13000rpm离心 IOmin,去上清，加入50 μ L裂解溶液B，充分混勻后，在100°C加热lOmin，13000rpm再离心 lOmin，取上清液待测；(3)加样向装有45μ L荧光定量PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品、工作标准品各5 μ L，盖好管盖，5，OOOrpm离心10秒；(4)荧光定量PCR扩增将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行荧光定量PCR扩增；94 "C 5 分 钟；94 °C 30 秒，58 °C 45 秒，5 个循环；940C 30秒，58°C 45秒，35个循环；收集荧光信号，在反应程序的第二步的终了读取荧光Ct值；(5)分析判断Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于或等于 28且小于或等于32的为临界阳性。进一步地，当需要绘制标准曲线时，另取4个反应管，直接加入不同浓度梯度的工作标准品5 μ L，5000rpm离心10秒，放入荧光定量PCR仪器的反应槽内。本发明还提供一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测引物和探针，包括下述正向引物、反向引物和荧光探针的一组序列r1181 位点正向引物5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3 ‘rtl81 位点反向引物5' AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3‘rtl81A 探针序列5' TTCTCHTGGCTCAGTTT 3'rtl81V 探针序列5' TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3'rtl81T 探针序列5' TTCTCHTGACTCAGTTTA 3'rt236 位点正向引物5' TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3‘rt236 位点反向引物5' CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3‘rt236N 探针序列5' ATACATTTRAACCC 3'rt236T 探针序列5' ATACATTTRACCCC 3'；或者在上述序列的5'端和/或3'端有延长的核苷酸片段的一组序列；或者与上述序列的同源性大于85%的一组序列；或者与上述序列的碱基互补的一组序列；上述的任意一组序列可单独使用，或以所有序列组之间的任意组合形式而使用；其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中Y = (C/T)，R = (A/G)，H = A/T/C。其中，荧光探针的5，端修饰的荧光染料选自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、VIC、ROX, Cy3、 Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU 或 NEP ；3，端修饰的荧光染料选自=TAMRA, Eclipse、BHQU BHQ2、 BHQ3 或 DABCYL。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是本发明试剂盒利用特异性的 TaqMan探针来检测乙型肝炎病毒，检测完成后无需开盖电泳，避免了产物污染及对实验室人员的伤害。本发明可用LNA探针、MGB探针、AllGlo 探针来实现。本发明实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时检测克服了扩增产物终点检测所存在的“平台效应”对产物定量的影响；本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测阿德福韦酯耐药毒株，试剂盒可以单用和多重检测乙肝病人的阿德福韦酯耐药情况，荧光定量PCR方法改进为“2步法”，避免了常规PCR延伸的步骤、探针可以标记多种荧光标记，同时还具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。且技术操作简便、自动化程度高； 由于采用闭管操作，不需要PCR产物后处理，有效解决PCR污染问题等特点，结果可靠。
图1是本发明实施例1中提供的阿德福韦酯耐药位点rtl81荧光定量PCR实验结果图；图2是本发明实施例1中提供的阿德福韦酯耐药位点rt236 二重荧光定量PCR实验结果图；图3A、图3B、图3C、图3D、图3E和图3F是本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rtl81重组质粒倍比稀释扩增曲线和标准曲线结果图；图4A、图4B、图4C和图4D是本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rt236 重组质粒倍比稀释扩增曲线和标准曲线结果图；图5A、图5B、图5C、图5D、图5E和图5F是本发明实施例2中提供的阿德福韦酯耐药位点rtl81位点181A/181V/181T分别检测样本的荧光定量PCR实验结果和标准曲线图；图6A、图6B、图6C和图6D是本发明实施例2中提供的阿德福韦酯耐药位点rt236 位点236N/236T分别检测样本的荧光定量PCR实验结果和标准曲线图；图1、图2、图3A、图3C、图3E、图4A、图4C、图5A、图5C、图5E、图6A和图6C中的横坐标表示循环数(Cycle number)、纵坐标表示荧光值(Delta Rn)；图3B、图3D、图3F、图4B、图4D、图5B、图5D、图5F、图6B和图6D中横坐标表示 LogCo (乙肝病毒起始浓度的对数值)、纵坐标表示Ct值。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。本发明提供了一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒，该试剂盒含有荧光定量PCR反应液，其中包括DEPC处理水、Taq酶、dNTPsUOX荧光定量PCR Buffer、含有Mg2+离子的溶液、正向引物、反向引物、探针；溶液A，为聚乙二醇6000 ；溶液 B，其中包括 EDTA、SDS、Tris-HCl, NP-40 ；阳性质控品，检测 rtl81 时，为 1. OX 106copy/mL 的含有rtl81A/rtl81V/rtl81T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1. OX IO6Copy/ mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；临界阳性质控品，检测rt 181时，为 1.0X 104copy/mL的含有rtl81A/rtl81V/rtl81T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为 1.0X104copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；工作标准品，检测rtl81 的工作标准品为PSG-TSrtl81的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了为乙型肝炎病毒基因组中含有rtl81A/rtl81V/rtl81T区间的162个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测Rt236的工作标准品为PSG-TS rt236的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了为乙型肝炎病毒基因组中含有rt236N/rt236T区间的153个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；该2个重组质粒都在大肠杆菌DH5 α中增殖。试剂盒的制造
1.试剂本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司。2.荧光定量PCR反应液制备(1)引物及探针设计与合成选择乙型肝炎病毒耐药相关的P基因的特异突变位点区域片段作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)，获得乙型肝炎病毒目前已有的8个基因型的乙型肝炎病毒耐药突变位点的基因序列，并通过 VectorNTIAdvance 11软件分别对8个基因型的相应耐药突变位点区间进行序列比对，选择保守区域设计引物和探针。rtl81A序列如序列表中SEQ ID NO. 10所示GTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAATTC CTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTT CCCCCACTGTTTGGCTTTrtl81V序列如序列表中SEQ ID NO. 11所示GTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAATTC CTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGTTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTT CCCCCACTGTTTGGCTTTrtl81T序列如序列表中SEQ ID NO. 12所示GTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAATTC CTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGACTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTT CCCCCACTGTTTGGCTTTrt236N序列如序列表中SEQ ID NO. 13所示TTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTATCTTT GGGTATACATTTAAACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGTTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGT TGGGGTACTrt236T序列如序列表中SEQ ID N0. 14所示TTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTATCTTT GGGTATACATTTAACCCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGTTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGT TGG GGTACT利用实时TaqMan荧光定量PCR的专业设计软件Primer Express 3.0设计引物、探针序列，引物、探针序列不仅要满足软件中各项指标，而且要确保引物、探针序列能检测全部8个基因型序列。在本发明中，探针的5，端修饰的荧光染料可选自FAM，HEX，TET，J0E， VIC, ROX, Cy3, Cy5, MAR, JUP, SAT, PLU, NEP 或 URA ；3’ 端修饰的荧光染料可选自TAMRA、 Eclipse, BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL 等。设计结果如下表所示
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有(1)荧光定量PCR反应液其中包括DEPC处理水、具有5，一3，外切活性的DNA聚合酶、dNTPsUOX荧光定量 PCRBuffer、含有Mg2+离子的溶液、rtl81位点正向引物、rtl81位点反向引物、rtl81A位点探针、rtl81V位点探针、rtl81T位点探针、rtN236T检测试剂盒特有的rt236位点正向引物、rt236位点反向引物、rt236N位点探针和rt236T位点探针；①181位点引物和探针r1181 位点正向引物5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3 ‘ r1181 位点反向引物5 ‘ AAAGCCCTRCGAACCACTGA3 ‘ rtl81A 探针序列5' TTCTCHTGGCTCAGTTT 3' rtl81V 探针序列5' TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3' rtl81T 探针序列5' TTCTCHTGACTCAGTTTA 3'②236位点引物和探针rt236 位点正向引物5‘ TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3‘ rt236 位点反向引物5 ‘ CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3 ‘ rt236N 探针序列5, ATACATTTRAACCC 3' rt236T 探针序列5' ATACATTTRACCCC 3'；其中，上述探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中，Y = (C/T), R =(A/G)，H = A/T/C (2)DNA提取液①溶液A，为聚乙二醇6000；②溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。(3)质控品①阴性质控品，为不含外源片段的PSG-TS载体质粒DNA；②阳性质控品，检测rtl81时，为1.0X106copy/mL的含有rtl81A/rtl81V/rtl81T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1. 0 X 106copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；③临界阳性质控品，检测rtl81时，为1.0 X 104copy/mL的含有rtl81A/rtl81V/rtl81T 相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1. 0 X 104copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；(4)工作标准品检测rtl81时，为PSG-TS rtl81的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rtl81A/rtl81V/rtl81T区间的162个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测rt236时，为PSG-TS rt236的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt236N/rt236T区间的153个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；该2个重组质粒都在大肠杆菌DH5 α中增殖。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、VIC、ROX, Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU 或 NEP ；3，端修饰的荧光·染科远目:TAMKA> Eclipse^ BHQU BHQ2> BHQ3 M DABCYLo
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干，所述DNA提取液由溶液A和溶液B组成；所述溶液A，为聚乙ニ醇6000 ；所述溶液B，其中包括乙ニ胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris-HCl和乙基苯基聚乙ニ醇。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干，所述工作标准品包括a、工作标准品1，为 1.0 X IO7CopバmL 的 PSG-TS rtl81 质粒 DNA 溶液或 1. 0 X IO7Copy/ mL 的 PSG-TS rt236 质粒 DNA 溶液；b、工作标准品2，为 1. 0X106copy/mL 的 PSG-TSrt 181 质粒 DNA 溶液或 1. OX IO6Copy/ mL 的 PSG-TS rt236 质粒 DNA 溶液；C、工作标准品 3，为 1. 0X105copy/mL 的 PSG-TSrt 181 质粒 DNA 溶液或 1. OX IO5Copy/ mL 的 PSG-TS rt236 质粒 DNA 溶液；d、工作标准品 4，为 1. 0X104copy/mL 的 PSG-TS rtl81 质粒 DNA 溶液或 1. OX IO4Copy/ mL 的 PSG-TS rt236 质粒 DNA 溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干，所述具有5’一3’外切活性的DNA聚合 酶为Taq酶。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在干，所述荧光定量PCR反应液各组分含量的配比为DEPC处理水用量27. L ；浓度为5U/ U L的热启动Taq酶用量0. 3 y L ；浓度为lOmmol/L的dNIPs用量1 y L ； 10X荧光定量PCR Buffer用量5 ii L ；浓度为25mmol/L的MgCl2溶液用量7 y L，浓度为10iimol/L的正向引 物用量1.6iiL、浓度为lOiimol/L的反向引物用量1.6iiL、浓度为lOiimol/L的探针用量 1 U L0
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在干，所述聚乙ニ醇6000的浓度为15%;所述乙ニ胺四乙酸浓度为0. 5%;所述Tris-HCl的 PH值为8. O ；所述乙基苯基聚乙ニ醇的浓度为0. 1%。
8.ー种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核 酸的检测方法，其特征在干，包括下列步骤(1)采集样品采集人血浆样品，离心分离，上清即为血清样品；(2)样品处理取待测血清IOOiiL,加入等量15%溶液A，混勻，13000rpm离心lOmin， 去上清，加入50 ii L裂解溶液B，充分混勻后，在100°C加热10min，13000rpm再离心lOmin， 取上清液待测；(3)加样向装有45y L荧光定量PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、 阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品、工作标准品各5 yL，盖好管盖，5，OOOrpm离心 10秒；(4)荧光定量PCR扩增将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光 基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行荧光定量PCR扩增；·94 °C 5分钟；940C 30 秒，58°C 45 秒，5 个循环；94°C 30秒，58°C 45秒，35个循环；收集荧光信号，在反应程序的第二步的终了读取荧光Ct值；(5)分析判断Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于或等于28且小于或等于32的为临界阳性。
9.一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测引物和探针，包括下述正向引物、 反向引物和荧光探针的一组序列r1181 位点正向引物5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3 ‘ r1181 位点反向引物5 ‘ AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3 ‘ rtl81A 探针序列5' TTCTCHTGGCTCAGTTT 3' rtl81V 探针序列5' TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3' rtl81T 探针序列5' TTCTCHTGACTCAGTTTA 3' rt236 位点正向引物5‘ TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3‘ rt236 位点反向引物5 ‘ CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3 ‘ rt236N 探针序列5, ATACATTTRAACCC 3' rt236T 探针序列5' ATACATTTRACCCC 3'；或者在上述序列的5’端和/或3’端有延长的核苷酸片段的一组序列； 或者与上述序列的同源性大于85%的一组序列； 或者与上述序列的碱基互补的一组序列；上述的任意一组序列可单独使用，或以所有序列组之间的任意组合形式而使用； 其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中Y = (C/T)， R = (A/G)，H = A/T/C。
10.根据权利要求9所述的乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测引物和探针， 其特征在于，其中，荧光探针的5，端修饰的荧光染料选自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、VIC、ROX、 〇又3丄75、嫩1 、贝？、541\ 1^或陬？ ；3，端修饰的荧光染料选自TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、 BHQ3 或 DABCYL。
全文摘要
本发明公开了乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针。该试剂盒含有荧光定量PCR反应液，其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×荧光定量PCR Buffer、含有Mg2+离子的溶液、rt181位点正向引物、rt181位点反向引物、rt181A位点探针、rt181V位点探针、rt181T位点探针、rtN236T检测试剂盒特有的rt236位点正向引物、rt236位点反向引物、rt236N位点和rt236T位点探针；试剂盒中还包括DNA提取液、阴性质控品、工作标准品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药毒株，荧光定量PCR方法避免了PCR延伸的步骤；探针可以标记多种荧光标记，同时还具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。
文档编号C12Q1/70GK102304589SQ20111019427
公开日2012年1月4日 申请日期2011年7月12日 优先权日2011年7月12日
发明者刘绪, 唐景峰, 王业富 申请人:武汉百泰基因工程有限公司