专利名称：用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液及其制备方法和使用方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液及其制备方法和使用方法。
背景技术：
我国外周动脉疾病(PAD)患病率高，严重PAD患者往往失去介入或外科血运重建术的指征，药物治疗难以改变PAD的自然史，最终导致患者截肢等不良预后。研究表明生长因子、骨髓源性干细胞和祖细胞等具有治疗性血管生成作用，能够促进缺血组织的血管生成、改善血流灌注，即“生物性动脉旁路术”。然而，现有生物治疗方法利用单一基因或生长因子治疗外周动脉疾病的效果不确切，可能原因之一是机体对外周组织缺血的保护性反应相对复杂，单一生长因子干预虽有效但无法完成这一过程；干、祖细胞移植虽能改善缺血组织的血管密度和血流灌注，但主要细胞来源骨髓、脐带血等的获取存在严重局限，而且细胞的在体生存能力极为有限，严重影响其治疗作用的发挥。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液及其制备方法和使用方法，提高移植细胞的存活能力和血管生成效应。本发明所采用的技术方案是
用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液的制备方法，其特征在于 由以下步骤实现
步骤一将取材于8-10周龄？ -actin-luc转基因FVB小鼠腹股沟、腹膜腔和肾周的脂肪组织剪碎，用含有青/链霉素各100 U/mL的无菌磷酸盐缓冲液清洗3次后，加入含 0. 2% I型胶原酶的Dulbecco改良fegle/F12培养基，轻微振摇下37 ！水浴消化60-75 min ；
步骤二 等体积的Dulbecco改良fegle/F12完全培养基终止消化，Dulbecco改良 Eagle/F12完全培养基中含有体积分数为10%的胎牛血清和青/链霉素各100 U/mL ；
步骤三将细胞悬液在室温下200 Xg离心10 min，分离出脂肪组织中基质血管部分， 然后在Dulbecco改良fegle/F12完全培养基中重悬脂肪组织中基质血管部分，以37 °C、体积分数为5%的C02、饱和湿度培养48-72 h后，去除未贴壁细胞；
步骤四贴壁细胞经消化、计数后，以2X 104/cm2密度接种于25cm2培养瓶中，即为原代脂肪间充质基质细胞；将细胞进行体外扩增时，在完全培养基中按2ng/ml的浓度加入人碱性成纤维细胞生长因子；
步骤五细胞生长至培养面积的80%后，采用0. 05%胰蛋白酶和0. 02%乙二胺四乙酸消化传代；收集第3代脂肪间充质基质细胞，在Dulbecco改良fegle/F12完全培养基中重悬，接种到75cm2细胞培养瓶中；然后以lOng/mL的浓度加入血管内皮细胞生长因子，预处理脂肪间充质基质细胞M小时；
步骤六取1.0X106数量、血管内皮细胞生长因子预处理M小时后的脂肪间充质基质细胞，与10. Ong血管内皮细胞生长因子混合，得到目的产物。如所述的制备方法制得的用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液。如所述的用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液的使用方法， 其特征在于
将1. OX 106数量、接受血管内皮细胞生长因子预处理24h的第3代脂肪间充质基质细胞，联合10. Ong血管内皮细胞生长因子，共同加入到60yL无菌磷酸盐缓冲液中，然后将其注射到缺血下肢肌肉组织中；在联合治疗后的第7、14、21和观天，分别于缺血下肢的相同部位多点肌肉注射血管内皮细胞生长因子5.0 ng。本发明具有以下优点
本发明克服了单一因子或单纯干细胞治疗组织缺血的获益局限，保证了干细胞的足量获取，并提高了移植细胞的存活能力和血管生成效应。因此，干细胞联合生长因子注射液及其用法，不仅能保证干细胞在增殖过程中维持其多潜能分化特性，还可提高细胞对缺氧损伤的耐受力，延长细胞在缺氧环境中存活的时间，并增强干细胞的血管生成作用，能够促进缺血下肢的血管新生和血流灌注恢复，有效改善跛行并提高肢体的存活率。
图1为体外人碱性成纤维细胞生长因子干预下培养的脂肪间充质基质细胞，A、B、 C、D分别为原代培养12h、原代培养Mh、第1代和第3代脂肪间充质基质细胞；
图2为脂肪间充质基质细胞的报告基因Fluc体外光学成像，A、B显示细胞绝对数和光学信号强度成正比，C显示细胞在10代以内可稳定表达Fluc ；
图3显示体外血管内皮细胞生长因子预处理可提高细胞的生存活力和对缺氧环境的耐受力；
图4为体内移植脂肪间充质基质细胞的Fluc光学成像示踪监测和定量分析； 图5为脂肪间充质基质细胞、血管内皮细胞生长因子联合治疗后缺血下肢的激光多普勒成像和定量分析；
图6为脂肪间充质基质细胞、血管内皮细胞生长因子联合治疗后缺血下肢微血管的 ⑶31、vWF免疫组织化学染色和定量分析。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行详细的说明。月旨肪间充质基质细胞(adipose derived mesenchymal stromal cell，ADMSC)具有多系分化的潜能，特定条件下可以分化为脂肪、骨、软骨或骨骼肌细胞等间充质系细胞， 还能够横向分化为血管内皮细胞、心肌细胞等非间充质系细胞。同时，脂肪组织易于通过低侵入性手段(如脂肪抽吸术等)大量获取，可能是用于组织缺血治疗较理想的细胞来源。人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种多功能生长因子，在损伤部位有明显的细胞趋化活性，能够刺激成纤维细胞、血管内皮细胞等向损伤部位移动；同时，bFGF能够维持体外培养干细胞的生物学活性稳定和多向分化特性。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)作为血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，是目前发现的最强效促血管生成因子，具有促缺血组织血管形成和抗缺血组织凋亡的功能，能够促进血管新生和功能的恢复，并可以改善干细胞的存活与增殖，对干细胞具有保护作用。本发明利用多种生长因子稳定并提高移植细胞的干细胞特性和体内存活能力，以最大程度地发挥ADMSCs的治疗性血管生成作用；联合干细胞和生长因子以提高缺血组织的血管新生与侧支代偿，进一步促进缺血组织的血流恢复并改善预后。用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液的制备方法，全过程均在无菌状态下完成
步骤一将取材于8-10周龄？ -actin-luc转基因FVB小鼠腹股沟、腹膜腔和肾周的脂肪组织剪碎，用含有青/链霉素各100 U/mL的无菌磷酸盐缓冲液清洗3次后，加入含 0. 2% I型胶原酶的Dulbecco改良fegle/F12培养基，轻微振摇下37 ！水浴消化60-75 min ；
步骤二 等体积的Dulbecco改良fegle/F12完全培养基终止消化。Dulbecco改良 Eagle/F12完全培养基中含有体积分数为10%的胎牛血清和青/链霉素各100 U/mL ；
步骤三将细胞悬液在室温下200 Xg离心10 min，分离出脂肪组织中基质血管部分， 然后在Dulbecco改良fegle/F12完全培养基中重悬脂肪组织中基质血管部分，以37 °C、体积分数为5%的CO2、饱和湿度培养48-72 h后，去除未贴壁细胞；
步骤四贴壁细胞经消化、计数后，以2X IOVcm2密度接种于25cm2培养瓶中，即为原代脂肪间充质基质细胞；将细胞进行体外扩增时，在完全培养基中按2ng/ml的浓度加入人碱性成纤维细胞生长因子；
步骤五细胞生长至培养面积的80%后，采用0. 05%胰蛋白酶和0. 02%乙二胺四乙酸消化传代；收集第3代脂肪间充质基质细胞，在Dulbecco改良fegle/F12完全培养基中重悬，接种到75cm2细胞培养瓶中；然后以lOng/mL的浓度加入血管内皮细胞生长因子，预处理脂肪间充质基质细胞M小时；
步骤六取1.0X106数量、血管内皮细胞生长因子预处理M小时后的脂肪间充质基质细胞，与10. Ong血管内皮细胞生长因子混合，得到目的产物。脂肪间充质基质细胞的形态、生长情况、表面标志和报告基因成像鉴定 1)形态和生长情况
原代脂肪间充质基质细胞(ADMSCs)在接种后8-12h，倒置相差显微镜下可见散在的单个细胞开始贴壁，最初呈规则或不规则圆形，然后部分细胞伸展呈梭形，见附图IA ； 12-24h 贴壁细胞逐渐增多并进一步伸展成长梭形，见附图1B;48 h首次传代，传代后的第1代 ADMSCs 6-12h即贴壁，增殖速度较快，并逐渐融合成单层簇状分布，见附图IC ；第3代后细胞成分较均一，易形成集落生长，见附图1D。脂肪间充质基质细胞的体积较大，呈成纤维细胞样，核较大居中，近似卵圆形，偶见双核，多为1个核仁。平均群体倍增时间约为Mh，约 48-7 可达80-90%融合。第1-5代细胞的增殖速度逐渐加快，第5代后趋于稳定，生存期有限，可传代8-10代。2)表面标志
流式细胞仪检测第3代ADMSCs的表面标志，结果显示ADMSCs的⑶44、⑶90、⑶四、 CD49d 和 ka-Ι 的阳性率分别为 99. 6%,98. 9%,89. 3%,49. 3% 和 39. 9%,而 CD31、CD34、CD45 的阳性率分别为1. 02%、1. 10%和3.对％，表明体外分离培养的ADMSCs高表达间充质干细胞的表面标志。3)细胞的报告基因成像鉴定
IVIS Xenogen Kinetic系统对第3代ADMSCs进行萤火虫荧光素酶(Fluc)生物发光成像，采用Fluc平均辐射强度定量光信号强度，单位为光子·秒―1 厘米_2 ·单位角―1 (P · s—1 · cm_2 · sr—1)。结果显示，ADMSCs的细胞绝对数与Fluc平均辐射强度成较强的正直线相关关系(相关系数r2=0.94)，见附图2A、2B。荧光素酶定量检测(Flue assay)表明体外扩增培养的ADMSCs在10代以内可稳定表达Fluc，见附图2C。血管内皮细胞生长因子预处理对脂肪间充质基质细胞存活能力的影响
体外生物发光成像显示，缺氧/复氧(H/R)损伤可以显著降低ADMSCs的存活能力，而血管内皮细胞生长因子(VEGF)预处理能够提高ADMSCs对H/R损伤的耐受力，从而提高缺氧环境下ADMSCs的生存活力。H/R损伤后，无VEGF预处理的ADMSCs其Fluc平均辐射强度较正常培养条件下的 ADMSCs降低，差异具有统计学意义0°<0. 01);而H/R损伤后，采用4.0 M 10. 0 ng/mL浓度 VEGF预处理的ADMSCs其Fluc平均辐射强度较无VEGF预处理的ADMSCs增强，具有统计学意义0°<0. 05)，提示4. 0至10. 0 (ng/mL) VEGF预处理可提高细胞缺氧损伤后的生存活力，见附图3A，B)。量效曲线分析显示，不同VEGF浓度(1.0至10.0 ng/mL)与H/R损伤后 ADMSCs的光信号强度成一定的正相关关系，其效应具有一定的递增趋势(r2=0. 82)，见附图 3C。脂肪间充质基质细胞联合血管内皮细胞生长因子注射液的使用方法和疗效评价
1)将1. OX IO6数量、接受血管内皮细胞生长因子预处理Mh的第3代脂肪间充质基质细胞，联合10. Ong血管内皮细胞生长因子，共同加入到60μ L无菌磷酸盐缓冲液中，然后将其注射到缺血下肢肌肉组织中；在联合治疗后的第7、14、21和观天，分别于缺血下肢的相同部位多点肌肉注射血管内皮细胞生长因子5.0 ng。2)联合治疗后，对体内移植的ADMSCs进行连续、动态的分子影像学监测。在移植后即刻及移植后第1、3、5、7、14、21、28、35天，裸鼠腹腔以150mg/kg剂量注射探针荧光素 D-Iuciferin 后，在 IVIS Xenogen Kinetic 系统中成像。结果显示，VEGF、ADMSCs 联合注射治疗的小鼠其体内ADMSCs的Fluc平均辐射强度显著高于单纯ADMSCs治疗的小鼠，差异有统计学意义0°<0. 05)，见附图4A，B。表明VEGF能够增强ADMSCs在缺血组织内的存活能力，有效延长细胞移植后的生存时间。3) VEGF、ADMSCs联合治疗后，对裸鼠缺血下肢进行血流灌注的激光多普勒成像和血管生成的组织学监测。治疗后第0、3、7、14天采用激光多普勒成像(LDPI)对裸鼠下肢的血流灌注进行监测，采用LDPI指数(LDPI index)对血流定量；⑶31、vffF免疫组织化学检测缺血下肢的血管生成情况，采用毛细血管/肌纤维比值(capillary/muscle fiber ratio index)定量毛细血管数量；同时，计算缺血下肢的跛行率和自截肢率。 结果表明，组织缺血后第1至14天，无论是否接受治疗，缺血下肢的血流灌注和毛细血管密度均逐渐改善。但是，单纯ADMSCs注射治疗较PBS注射治疗能进一步提高缺血下肢的LDPI指数和毛细血管/肌纤维比值；而接受VEGF、ADMSCs联合注射治疗的小鼠其缺血下肢的LDPI指数、毛细血管/肌纤维比值显著高于单纯ADMSCs治疗小鼠(7X0. 05)，见附图 5A，B和附图6A，B ；接受VEGF、ADMSCs联合注射治疗的小鼠其跛行率和缺血肢体自截肢率显著低于单纯ADMSCs治疗小鼠(/X0. 05)。证实联合生物疗法较干细胞移植治疗能进一步改善缺血下肢血流灌注和血管生成、降低跛行率并提高肢体存活率。
权利要求
1.用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液的制备方法，其特征在于由以下步骤实现步骤一将取材于8-10周龄？ -actin-luc转基因FVB小鼠腹股沟、腹膜腔和肾周的脂肪组织剪碎，用含有青/链霉素各100 U/mL的无菌磷酸盐缓冲液清洗3次后，加入含 0. 2% I型胶原酶的Dulbecco改良fegle/F12培养基，轻微振摇下37 ！水浴消化60-75 min ；步骤二等体积的Dulbecco改良fegle/F12完全培养基终止消化，Dulbecco改良 Eagle/F12完全培养基中含有体积分数为10%的胎牛血清和青/链霉素各100 U/mL ；步骤三将细胞悬液在室温下200Xg离心10 min，分离出脂肪组织中基质血管部分， 然后在Dulbecco改良fegle/F12完全培养基中重悬脂肪组织中基质血管部分，以37 °C、体积分数为5%的CO2、饱和湿度培养48-72 h后，去除未贴壁细胞；步骤四贴壁细胞经消化、计数后，以2X IOVcm2密度接种于25cm2培养瓶中，即为原代脂肪间充质基质细胞；将细胞进行体外扩增时，在完全培养基中按2ng/ml的浓度加入人碱性成纤维细胞生长因子；步骤五细胞生长至培养面积的80%后，采用0. 05%胰蛋白酶和0. 02%乙二胺四乙酸消化传代；收集第3代脂肪间充质基质细胞，在Dulbecco改良fegle/F12完全培养基中重悬，接种到75cm2细胞培养瓶中；然后以lOng/mL的浓度加入血管内皮细胞生长因子，预处理脂肪间充质基质细胞M小时；步骤六取1.0X106数量、血管内皮细胞生长因子预处理M小时后的脂肪间充质基质细胞，与10. Ong血管内皮细胞生长因子混合，得到目的产物。
2.如权利要求1所述的制备方法制得的用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液。
3.如权利要求1所述的用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液的使用方法，其特征在于将1. OX IO6数量、接受血管内皮细胞生长因子预处理Mh的第3代脂肪间充质基质细胞，联合10. Ong血管内皮细胞生长因子，共同加入到60 μ L无菌磷酸盐缓冲液中，然后将其注射到缺血下肢肌肉组织中；在联合治疗后的第7、14、21和观天，分别于缺血下肢的相同部位多点肌肉注射血管内皮细胞生长因子5.0 ng。
全文摘要
本发明涉及一种用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液及其制备方法和使用方法。机体对外周组织缺血的保护性反应相对复杂，单一生长因子干预虽有效但无法完成这一过程；干、祖细胞移植虽能改善缺血组织的血管密度和血流灌注，但主要细胞来源骨髓、脐带血等的获取存在严重局限，而且细胞的在体生存能力极为有限，严重影响其治疗作用的发挥。本发明利用人碱性成纤维细胞生长因子干预脂肪间充质基质细胞，并联合血管内皮细胞生长因子共同作用，促进缺血组织血管生成。本发明克服了单一因子或细胞治疗的获益局限，保证了干细胞的足量获取，并提高了移植细胞的存活能力和血管生成效应，从而能进一步改善缺血下肢的血流灌注，提高肢体存活率。
文档编号C12N5/077GK102274491SQ20111019485
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者刘俊廷, 曹丰, 梁继民, 田捷, 范伟伟 申请人:中国人民解放军第四军医大学