专利名称：在转基因单子叶植物中产生重组胰岛素样生长因子-i(igf-i)和胰岛素样生长因子结合 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及在单子叶植物中产生哺乳动物，特别是人的蛋白质。通过在转基因稻中成功产生IGF-I和IGFBP-3加以说明。
背景技术：
胰岛素样生长因子-I (IGF-I)和胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP_3)是调节细胞和组织的存活、生长和分化的重要蛋白质。人IGF-I是70个氨基酸残基的单链多肽，它由染色体12上的一个基因编码。它与胰岛素原和胰岛素具有48%氨基酸序列相同性。IGF-I含有三个链内二硫桥键，位于 A20-B18、A6-A11和A7-B6，但没有糖基化位点。大部分循环IGF-I在肝脏中合成，并且受生长激素(GH)、胰岛素和营养摄取的调节。循环IGF-I水平相对稳定，主要由于其组成型的分泌模式和IGF-I与高亲和结合蛋白的结合。然而，IGF-I调节异常可能在胰岛素耐受和其它代谢异常的发生中起到一定作用。IGF-I在糖代谢调节中的确切作用尚不清楚，但在调节代谢中非常重要。在健康志愿者中，重组的人IGF-I (rhIGF-I)可行使急性低血糖作用，但rhIGF_I比相同剂量的胰岛素的强度低10倍。相反，与胰岛素相比IGF-I对蛋白质代谢的作用更明显，与相同的葡萄糖剂量的胰岛素相比，它能降低整体净氨基酸流。而且，IGF-I是胰腺释放胰岛素的强效抑制剂。在1型糖尿病患者中，使用rhIGF-I导致循环IGF-I水平上升、GH分泌过多的逆转、 胰岛素需求下降和血糖控制的改善。在2型糖尿病患者中，需要较高剂量的rhIGF-I来降低禁食后的血浆葡萄糖、胰岛素和C-肽水平。此外，rhIGF-I治疗与脂肪质量降低相关联， 这可部分解释上述对胰岛素敏感性的有益影响。
已鉴定到六种人IGF-结合蛋白。在这六种结合蛋白中，IGFBP-3结合血浆中95% 以上的IGF-I。它含有264个氨基酸残基，计算分子量约为^kD。有三个可能的N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)，分别位于IGFBP-3中心区的Asn89、Asn1(l9和Asn172上，但糖单位似乎对IGF结合并不重要。IGF-I/IGFBP-3 二聚体与“酸不稳定性亚基”形成三元络合物，这能延长IGF-I的半衰期并滴定IGF-I对其受体的供应。IGFBP-3是许多组织中局部产生的40_45kDa的糖蛋白，在这些地方其用作调节细胞生长和凋亡的自分泌和旁分泌调节物。IGFBP-3通过结合IGF抑制细胞增殖和存活，防止它们激活靶细胞上的IGF-I受体。还发现，IGFBP-3能以IGF依赖方式负向调节细胞增殖并诱导凋亡。不存在IGF-I时，IGFBP-3能够与多种生长抑制性蛋白质和物质如p53、视黄酸、肿瘤坏死因子-α和转化生长因子-β相互作用。IGFBP-3的过度表达会抑制细胞增殖并减少肿瘤形成，但对正常器官的生长抑制作用很小。近年来的研究表明，IGFBP-3会抑制乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌和结直肠癌，因此IGFBP-3能用作有效的抗癌剂。因此，人IGF-I和人IGFBP-3均有药用价值。使用IGF-I和IGFBP-3的主要障碍是其生产成本。这些蛋白质主要由微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)重组产生；或者由肉瘤细胞系或红细胞样细胞提取和/或在转基因小鼠中产生。这些系统不适合大规模生产，因为设备和生产成本很高并且可能被病原体污染。IGF-I和IGFBP-3也出现在其他哺乳动物中，起到类似功能。可工程改造植物细胞以接受和表达来自各种生物体的遗传信息，包括来自原核和真核来源的基因。因为植物细胞是真核细胞，所以它们能够产生哺乳动物蛋白质，对于合适的蛋白质或酶功能而言常常需要适当的翻译后修饰(如糖基化、异戊烯化和形成二硫桥)。 此外，许多植物的种子是可以食用的，并且可能在种子中富集重组蛋白质。在一些情况下， 重组蛋白质可能不需要进一步加工和纯化就能口服递送，只要控制剂量水平和频率，因为每种蛋白质具有特征性的酸和蛋白酶抗性。可利用递送运载体如生物包囊和植物组织来防止蛋白质在胃和内脏中降解(Daniell，H.等，Trends Plant Sci. (2001)6 =219-226) 已经开发基于种子的平台，用于药用蛋白质的生物组装和生产(Sardana，R. K.，等，Transgenic Res. (2002) 11 :521-531)。他们的结果提示，使用植物种子作运载体通过“种子药丸(seed as pill) ”产生和递送生物药品是一种可行的选择。已经在转基因烟草中产生重组人IGF-I和重组人IGFBP-3，第五届香港糖尿病和心血管风险因素东西方交流大会，2003年10月上的三个海报演讲中报道了这些结果(“在转基因烟草中表达人胰岛素样生长因子I(IGF-I)和胰岛素样生长因子结合蛋白 3(IGFBP_3)，，(Expression of Human Insulin-like Growth Factor I (IGF I) and Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3 (IGFBP 3) in Transgenic Tobacco))；第64届美国糖尿病协会科学会议，2004年6月(“植物作为表达人胰岛素样生长因子I(IGF-I)和胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的生物反应器”(Plants as Bioreactors for Expressing Human Insulin-like Growth Factor I(IGF I)and Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3 (IGFBP 3))；和 2004年美国植物生物学家协会年会，2004年7月(“人胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)在烟草中的转基因表达，，(Transgenic Expression of Human Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3 (IGFBP 3) in Tobacco Seeds))。在烟草植物中产生这些蛋白质无法提供在诸如玉米、稻、小麦和大麦等可食用单子叶植物中产生的优点。单子叶植物也包括诸如甘蔗、菠萝、椰枣和香蕉等重要的食用作物。这些单子叶植物代表可食用物质的多产来源。每天超过40%的世界人口消耗的稻是世界上农业生产实践中良好鉴定的，被认为是产生药用和市售的重要蛋白质和疫苗的模式生物反应器(Fischer，R.等，Transgenic Res. (2000)9:279-299).它不含有害的化学物质，如烟草所含的烟碱和毒性生物碱，并且具有较低的变应原性。稻中重组蛋白质可以占到粒重的1%。使用特异性启动子和信号序列靶向重组蛋白质在稻胚乳区(至多占全部种粒的91%)中的生产和储存，蛋白质累积可以提高至粒重的 2. 7% (Liu, Q.Q.，Thesis Department of Biology(2002)中国扬州大学(Yangzhou University)禾口香港的香港中文大学(the Chinese University of Hong Kong)。一个稻植株可以具有高达100个分蘖，产生超过10，000个谷粒，能够快速生产大量种子和重组蛋白质。此外，快速生长(每年3-4轮)的稻日本亚种可用作生产的生物反应器植物。干燥种子的储存和销售很简单，在室温下储存5个月以上后，谷粒中的产率和重组蛋白质活性没有明显降低(Stoger，E.，等，Plant Mol. Biol. (2000)42 :583-590)。 在水分含量低的条件下，谷粒可储存3-5年而不损失活性(Huang，N.，BioProcess International (2002) 1 月54-59)。如果蛋白质设计用于家畜，那么在其他谷物，如燕麦中生产可能更合适。以前的研究证明，密码子使用偏见与基因表达水平强烈相关。高表达的基因优选使用一小组称为“优化”密码子的密码子(Moriyama, E.N.，等，J. Mol Evol (1997)45 514-523)。而且，这些优化密码子对应于最丰富的tRNA，导致翻译的准确率和效率提高 (Marais, G.，等，J. MoIEvoI (2001) 52 :275-280)。在以下实施例中，根据两种种子贮藏蛋白质所用的植物优选密码子修饰人IGF-I和IGFBP-3的DNA序列，以便提高这些蛋白质在稻中的产量。选择来自四菱豆的富含赖氨酸的蛋白质(LRP)和来自捉猴果坚果(Paradise nut)的富含甲硫氨酸的2S清蛋白(PN2S)的密码子用法作为修饰基础，因为在先前的研究中观察到它们在转基因拟南芥(Arabidopsis)中高表达和稳定累积(LRP和PN2S分别占可提取种子蛋白总量的3-10%和3-15% )。另一种提高以下实施例所用的靶蛋白产率的方案是将重组蛋白质导向特定部位， 以防止被细胞的蛋白质水解系统降解。已报道，连接信号肽序列导致内质网(ER)分泌， 通常需要作为外来基因的N-和C-末端的ER保留信号的四肽KDEL以便高水平地累积产物(Wandelt，C. I.等，Plant J. (1992) 2 181-192 ；和 Herman，Ε. Μ.等，Planta (1990) 182 305-312)。KDEL四肽通过与高尔基复合物和ER之间循环的受体相互作用，进行蛋白质定位。KDEL信号对于可溶性蛋白质在植物ER中的累积而言是足够的(Wandelt，C. I.等，同上； Frigerio, L.等，Plant Cell (2001) 13 :1109-1126 ；和 Napier，J.等，Planta(1997) 203 488-494)。已发现，相对于不含KDEL的构建物，含有KDEL的构建物转化的细胞中scFv水平为 6-14 倍(Conrad, U.等，Plant Mol. Biol. (1998)38:101-109)。
发明内容
本发明提供了两种重要的哺乳动物蛋白质-IGF-I和IGFBP-3的经济实用的来源。 优选产生人形式。通过在单子叶植物中产生这些蛋白质，本发明第一次提供能够产生足量的适合人类治疗应用或兽医应用的形式的有用来源。
5
因此，在一个方面，本发明涉及经修饰产生人IGF-I和/或人IGFBP-3的单子叶植物细胞。在另一方面，本发明涉及含有这类细胞的植物或植物部分。附图简要说明
图1显示编码人IGF-I的核苷酸序列(SEQ ID NO 1),如Jansen, M.等， Nature (1983) 306 :609-611 所述。图2显示编码人IGFBP-3的核苷酸序列(SEQ ID NO :2)，如Wood，W. I.等，Mol. Endocrinol. (1988)2 :1176-1185 所述。图3显示根据植物中的密码子优选性修饰的编码人IGF-I的核苷酸序列(SEQ ID NO 3)。图4显示根据植物中的密码子优选性修饰的人IGFBP-3的核苷酸序列(SEQ ID NO 4)。图5显示人IGF-I的氨基酸序列(SEQ ID NO :5)。图6显示人IGFBP-3的氨基酸序列(SEQ ID NO :6)。图7是显示稻中产生的人IGF-I在L6细胞中造成边缘波动的能力和这种作用对市售人IGFBP-3的易感性的实验结果。图8显示稻中产生的人IGFBP-3抑制MCF-7细胞生长的有效性。本发明实施方式如下所述，第一次在单子叶植物中产生了两种重要的人蛋白质IGF-I和IGFBP-3。 因为单子叶植物包括主要营养来源且不含有害化合物，所以非常适合产生用于人类治疗的蛋白质。它们也非常适合产生用于治疗食草性或杂食性哺乳动物的相应蛋白质。通过适当设计包含表达系统的DNA构建物来提高这些蛋白质的产量，所述表达系统具有操作性连接于合适控制序列以便表达的编码这些蛋白质的核苷酸序列。对植物细胞进行遗传修饰和重建完整植株的技术已经为本领域熟知一段时间。参见例如，Gelvin 等，《植物分子生物学手册》(Plant Molecular BioIory Manual), (1990))； Dashek,《植物生物化学和分子生物学中的方法》(Methods in Plant Biochemistry and Molecular BioIory) (CRC出版社，1997)。本领域在这个方面的发展状态的有用小结可参见 2004年1月14日公开的美国专利公开2004/0009476，将该文献中有关植物遗传操作的技术内容通过引用纳入本文。一旦获得含有重组构建物的转化的植物细胞，则可由其重新产生转基因植物，评价所需蛋白质的产量水平。可利用几种技术优化非天然核苷酸序列在植物中的表达。如以下实施例的进一步描述，可按照植物细胞中表达的密码子优选性修饰编码的核苷酸序列。这种修饰基于描述植物密码子优选性的公开数据。其次，可延伸编码核苷酸序列以加入信号和保留序列，并将编码蛋白质导向内质网并实现保留。这也对产率产生有益的影响。通常，在所需蛋白质的 N末端产生信号传导肽，在其C末端产生保留信号。使用这些技术能显著提高所需的IGF-I和IGFBP-3的产率。使用合适启动子实现表达也是有用的。例如，合适启动子包括35S CaMV、稻肌动蛋白启动子、泛素启动子或胭脂碱合酶(N0Q启动子。提高种子中的产量的组织特异性启动子包括种子特异性谷蛋白启动子(Gt-Ι·)，但也可采用其他种子特异性启动子。也可使用终止信号，例如胭脂碱合酶终止信号。如下所述设计两组构建物，以驱动植物优化的编码序列并通过土壤杆菌 (Agrobacterium)介导的转化引入稻中。一组构建物仅含有谷蛋白信号肽(SP)，而另一组含有SP以及靶向的四肽KDEL信号。合成这些构建物以提高蛋白质表达并使蛋白质靶向储存部位，以及提高蛋白质稳定性。利用种子特异性谷蛋白启动子(Gt-IpJ驱动IGF-I 和IGFBP-3在转基因稻中的表达，分析转基因的表达。由转基因稻谷粒产生的rhIGF-I和 rhIGFBP-3有生物活性。也可修饰该构建物以包含纯化辅助物，如组氨酸标签或FLAG序列，和/或包含标记物，如荧光蛋白质，以便随后进行纯化。也可在编码蛋白质和纯化标签和/或标记物之间工程设计切割位点。如果需要可采用标准的纯化技术，或者在某些情况下，可口服给予植物组织，以利用植物的营养价值和其低毒的优点。在1型或2型糖尿病患者中，利用重组产生的IGF-I降低胰岛素需求和提高血糖控制水平。IGFBP-3能实施凋亡，并可用于治疗恶性肿瘤。因此，如果需要，可将重组产生的蛋白质配制到给予需要用这些蛋白质治疗的对象的组合物中。配制蛋白质和其他药物的通用方法可参见《雷明顿药物科学》(Remington，s Pharmaceutical Sciences),最新版,马克出版公司(Mack Publishing Co.)，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton，PA)，通过参考纳入本文。该蛋白通常通过注射或透皮或跨粘膜递送途径以胃肠道外的方式全身给药，或者在某些情况下可以口服给药。可使用根据特定给药方式设计的不同剂型，包括脂质体制剂和含有脂质或聚合物基纳米颗粒的制剂等。提供以下实施例是为了说明而非限制本发明。实施例1用IGF-I和IGFBP-3构建物转化土壤细菌根据两种种子贮藏蛋白质所用的优选密码子修饰人IGF-I (图1)和IGFBP_3(图 2)的DNA序列。选择来自四菱豆的富含赖氨酸的蛋白质(LRP)和来自捉猴果坚果的富含甲硫氨酸的2S清蛋白(PN2S)的密码子用法(表1)作为修饰基础，因为在先前的研究中观察到它们在转基因拟南芥(Arabidopsis)中高表达和稳定累积(LRP和PN2S分别占可提取种子蛋白总量的3-10%和3-15% )。与初始对应物编码相同氨基酸序列(图5和6)的经修饰的IGF-I (图3)和 IGFBP-3(图 4)基因由 MWG 生物技术公司(MWG Biotechnology Company)获得。IGF-1 禾口 IGFBP-3的密码子改变分别为28. 6%和14. 8%。表1 根据LRP和PN2S序列优先化的密码子优选性的小结
权利要求
1.一种在单子叶植物细胞中产生蛋白质的方法，所述蛋白质是简称IGF-I的胰岛素样生长因子I，所述方法包括培养如下所述的单子叶植物细胞该植物细胞经修饰包含用于表达编码IGF-I的核苷酸序列的DNA构建物，所述DNA构建物中，所述编码核苷酸序列与控制序列操作性连接以使所述编码序列在单子叶植物细胞中得以表达。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IGF-I是人蛋白。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述控制序列包含在单子叶植物种子中可操作的启动子和在单子叶植物种子中可操作的终止序列。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在N末端延伸有编码导致内质网分泌途径的信号肽的核苷酸序列。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在C末端延伸有编码内质网保留信号的核苷酸序列。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞是稻细胞。
7.一种在单子叶植物中产生IGF-I的方法，所述方法包括培养如下所述的转基因植物，该植物经修饰而含有表达编码IGF-I的核苷酸序列的DNA构建物，所述DNA构建物中， 所述编码核苷酸序列与控制序列操作性连接以使所述编码序列在单子叶植物细胞中得以表达。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述IGF-I是人蛋白。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述控制序列包含在单子叶植物种子中可操作的启动子和在单子叶植物种子中可操作的终止序列。
10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在N末端延伸有编码导致内质网分泌途径的信号肽的核苷酸序列。
11.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在C末端延伸有编码内质网保留信号的核苷酸序列。
12.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述植物是稻。
13.一种在植物部分中产生IGF-I的方法，所述方法包括培养如下所述的植物部分，该植物部分经修饰而含有表达编码IGF-I的核苷酸序列的DNA构建物，所述DNA构建物中，所述编码核苷酸序列与控制序列操作性连接以使所述编码序列在单子叶植物细胞中得以表达。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述IGF-I是人蛋白。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述控制序列包含在单子叶植物种子中可操作的启动子和在单子叶植物种子中可操作的终止序列。
16.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在N末端延伸有编码导致内质网分泌途径的信号肽的核苷酸序列。
17.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在C末端延伸有编码内质网保留信号的核苷酸序列。
18.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述植物部分是稻的种子。
全文摘要
已经在单子叶植物中生产出两种重要的人类蛋白，即胰岛素生长因子I(IGF-I)和胰岛素生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)。重组产生的蛋白质具有天然形式的已知活性。
文档编号C12P21/02GK102352397SQ20111025394
公开日2012年2月15日 申请日期2008年2月20日 优先权日2007年2月20日
发明者P·C·Y·童, 张振佳, 辛世文 申请人:香港中文大学