专利名称：适用于实验小鼠基因分型的鼠尾dna提取试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鼠尾DNA提取试剂盒及其应用，具有简捷、经济、可靠的特点，特别适用于实验小鼠基因型的准确鉴定。
背景技术：
利用遗传学手段研究各种基因突变小鼠已成为生命科学和医学研究最有力的方法之一，而进入各实验室的转基因小鼠(主要包括基因敲入、敲除和免疫缺陷小鼠等)的品系和数量也呈日益增多的趋势。该现象在有效提高了科研平台和水平的同时，也使得小鼠的基因分型成为长期、大量和频繁的常规工作。目前常用的基因分型中涉及组织DNA提取的方法是鼠尾DNA的提取，其传统方法包括酚/氯仿提取法和高盐提取法。这些方法虽然能够获取较高纯度和得率的鼠尾DNA，但都具有一些共同的不足之处一是步骤较繁琐，例如多次涉及离心；二是涉及的试剂过多， 例如均采用了氯仿、乙醇、蛋白酶K等试剂；三是时间偏长，例如均有实验过夜步骤。即便是文献中报道的其它方法，其所花时间至少也在2h以上。上述特点都在无形中增加了实验成本(包括试剂成本和人力成本)，不利于经费紧张、人力有限的实验室进行相关的基因型分型实验。
发明内容
针对现有技术存在的不足，基于长期、大量、频繁地从事实验小鼠基因分型的实验室工作的实际需要，本发明提供一种操作简便、成本低廉、结果可靠的适用于实验小鼠基因分型的鼠尾DNA提取试剂盒。本发明提供的DNA提取试剂盒，包括A液和B液。所述A液由终浓度为0. 025N的NaOH和终浓度为2mM的EDTA组成；每40ml试剂含有 100 μ 1 ION NaOH 溶液，160 μ 1 0. 5Μ EDTA 溶液和 39. 74ml ddH20。所述B液为终浓度为40mM的Tris溶液；每40ml试剂含有1. 6ml IM Tris溶液和 38. 4ml ddH20。本发明提供一种适合于基因型鉴定的鼠尾DNA提取快捷试剂盒按如下步骤进行
(1)取小鼠尾尖0.2-0. 5cm组织并置于1. 5ml EP管中；
(2)加入180 μ 1 A 液；
(3)置于沸水浴30min，或置于温度设定为100°C的微量恒温器中30min，使组织细胞中的核酸成分在A液和高温的作用下通过裂解而释放出来；
(4)取出EP管，冰浴2min；
(5)加入180μ 1 B液，充分混勻；
(6)4°C保存，即可用于基因型鉴定。本发明是立足于基因分型实验的实际需要，简化常规提取流程，选取A液中的 NaOH溶液和高温因素对组织进行直接裂解，使其DNA得以充分释放，同时采用A液中的EDTA溶液与Mg2+整合，减少Dnase的活性，从而进一步保护DNA样品的完整性，而B液中的 Tris溶液则继续为组织提供一个合适的裂解环境。由于实验小鼠的基因型鉴定对DNA纯度和得率的要求不是太高，因此本发明在没有选用蛋白酶K和酚/氯仿等试剂，也没有采用相应的离心手段，从而大大减少了实验的步骤和时间。同时，本发明注重对A液/样品比例的控制，即可保证所得产物可用于基因型的准确鉴定。发明人在美国哈佛大学医学院和第三军医大学第三附属医院相关实验室使用该试剂盒进行了大量实验，结果可靠。可见，该试剂盒制备方法简单，所用A液和B液成分均为常规生化试剂，整个过程不需蛋白酶K和酚/氯仿等试剂参与，也无多次离心等繁琐步骤，操作时间不超过lh，快捷经济，性价比高，特别适合长期、大量、频繁鉴定实验小鼠基因型的实验室使用。
图1是C57B/6背景的Foxp3-GFPKI小鼠基因型鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果泳道 M 为 DNA Marker (DL2000,至上而下带型分子量依次为 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp和lOObp)，泳道1-9为不同小鼠Foxp3表达结果，泳道NC为阴性对照。其模板为根据本发明提供的试剂盒方法提取的鼠尾DNA.结果显示，除阴性对照外，所有小鼠带型均为 470bp，表明这些样品均为Foxp3-GFPKI纯合子小鼠。图2A和图2B是Foxp3-GFPKI小鼠周围淋巴结和脾细胞悬液的流式细胞分析结^ ο
具体实施例方式以下的实施例是便于更好地理解本发明，但不限定于本发明。下述实施例中的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，若无特殊说明，均为常规生化试剂。实施例1 试剂盒配制
A液40ml 取100 μ 1 10Ν NaOH溶液置于50ml塑料容器中，再分别加入160 μ 1 0. 5Μ EDTA 溶液和 39. 74ml ddH20,混勻。B液40ml 取1. 6ml IM Tris溶液置于50ml玻璃容器中，加入38. 4ml ddH20，混勻，pH 7. 6。实施例2 :C57B/6背景的Foxp3- GFP敲入小鼠基因分型(即将绿色荧光蛋白敲入小鼠，使其和Foxp3基因连锁，这样凡是表达绿色荧光的细胞均为Foxp3阳性细胞)
配对C57B/6背景的Foxp3-GFP敲入成年小鼠由美国哈佛大学医学院馈赠(购自美国 Jackson Laboratory)，置于第三军医大学第三附属医院实验动物中心按照SPF级动物标准饲养和繁殖，幼鼠断奶分笼后进行Foxp3基因鉴定；
(1)取小鼠尾尖0.2-0. 5cm组织并置于1. 5ml EP管中；
(2)加入180 μ 1 A 液;
(3)IOO0C30min ；
(4)取出EP管，冰浴2min；
(5)加入180μ 1 B液，充分混勻；
(6)4°C保存，进行基因型鉴定PCR 引物合成(上海生工):Foxp3-l (common)-CAA AAC CAA GAA AAG GTG GGC, Foxp3-2(wild type reverse)-CAG TGC TGT TGC TGT GTA AGG GTC，Foxp3_3(mutant reverse) -GGA ATG CTC GTC AAG AAG ACA GG ；
按以下要求取样，使总体积为15μ1 模板(由上述试剂盒方法获得)2μ l，2XTag Master Mix (Promega，M712B) 7· 5 μ 1，弓丨物 Foxp3_l 0· 6 μ 1，弓丨物 Foxp3_2 0· 6 μ 1，弓丨物 Foxp3-3 0. 6 μ 1，Ckffl2O 3. 7 μ 1 ；
按以下PCR参数(Jackson Laboratory)完成PCR反应首先94°C 3min，然后按94°C 30sec，64°C lmin，72°C Imin顺序进行35个循环，接着72°C 2min，最终产物置-20°C保存；
2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(参见图1) :510bp单条带为C57B/6野生型小鼠， 470bp单条带为C57B/6背景的Foxp3-GFP敲入纯合子小鼠，470bp和5IObp双条带为 Foxp3-GFPKI杂合子小鼠；
随机选取上述鉴定获得的Foxp3-GFP敲入纯合子小鼠，脱颈椎法处死； 收集周围淋巴结(包括腹股沟、腋窝和颈部淋巴结)和脾，碾磨为细胞悬液； 离心分离1500rpm 5min，弃上清；
加入2ml红细胞裂解液(Tiangen)，混勻后室温静置2min ；
将液体移至预先加有6ml含10% FBS (Hyclone)的RPMI1640培养基(兰州民海)中洗
涤；
离心分离1500rpm 5min，弃上清； 加入400 μ 1含10% FBS的RPMI1640培养基制悬，过滤； 流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测GFP信号及其含该信号的细胞比例； 比较采用本发明获得的鼠尾DNA进行基因分型结果与流式细胞分析结果的差异，推断前者的可靠性，参见图2Α和图2Β。图2Α样本为C57B/6野生型小鼠(对照)，图2Β样本为经图1鉴定为Foxp3-GFPKI纯合子的小鼠。结果显示，流式细胞分析结果与图1结果一致，说明本发明提供的鼠尾DNA提取快捷试剂盒可以用于基因型鉴定，而且结果可靠。
权利要求
1.一种适用于实验小鼠基因型的鼠尾DNA提取试剂盒，其特征在于包括A液和B液， 其中A液40ml，由终浓度为0. 025N的NaOH溶液和终浓度为2mM的EDTA溶液组成，B液 40ml，为终浓度为40mM的Tris溶液，pH 7. 6。
2.权利要求1所述的鼠尾DNA提取试剂盒的配制方法，其特征在于取100μ 1 ION NaOH溶液置于50ml塑料容器中，再分别加入160 μ 1 0. 5Μ EDTA溶液和39. 74ml ddH20,混勻，即获得A液；取1.6ml IM Tris溶液置于50ml玻璃容器中，加入38. 4ml ddH20，混勻，即获得B液。
3.权利要求1所述的鼠尾DNA提取试剂盒的使用方法，其特征在于按如下步骤进行取小鼠尾尖0. 2-0. 5cm组织并置于1. 5ml EP管中；加入180 μ 1 A液;置于沸水浴30min，或置于温度设定为100°C的微量恒温器中30min，使组织细胞中的核酸成分在A液和高温的作用下通过裂解而释放出来；取出EP管，冰浴2min ；加入180 μ 1 B液，充分混勻；4°C保存，即可用于基因型鉴定。
全文摘要
本发明公开一种简捷、经济、可靠的鼠尾DNA提取试剂盒，适用于实验小鼠基因型的准确鉴定。该试剂盒包括A液和B液，其中A液由终浓度为0.025N的NaOH溶液和终浓度为2mM的EDTA溶液组成，B液为终浓度为40mM的Tris溶液，pH7.6。操作步骤如下取小鼠尾尖0.2-0.5cm组织并置于1.5mlEP管中；加入180μlA液，100℃30min；然后冰浴2min，再加入180μlB液，充分混匀，即可获得组织DNA，可用于下一步的基因型鉴定。该试剂盒制备方法简单，所用A液和B液成分均为常规生化试剂，整个过程不需蛋白酶K和酚/氯仿等试剂参与，也无多次离心等繁琐步骤，操作时间不超过1h，快捷经济，性价比高，特别适合长期、大量、频繁鉴定实验小鼠基因型的实验室使用。
文档编号C12Q1/68GK102329791SQ201110294538
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者严军, 曾灵, 杜娟, 杨策, 王海燕, 蒋建新, 顾玮, 高闻达 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院