专利名称：一种防治香蕉枯萎病的白刺链霉菌株bwl15-4及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治香蕉枯萎病的菌株及其应用，具体涉及一种防治香蕉枯萎病的白刺链霉菌株BWL15-4及其应用。
背景技术：
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)侵染引起的一种香蕉生产上的毁灭性土传病害。该病原菌有4个生理小种，在我国分布的是1 号和4号两个生理小种，对我国香蕉产业危害最大的是4号生理小种，目前已在海南、广东、 云南、福建大部分香蕉种植区大面积发生，发病面积已超过50万亩。广东和海南香蕉枯萎病发病严重的地方已不能再规模化种植香蕉，不得不改种其它作物。香蕉枯萎病菌是土壤习居菌，它从香蕉的根部侵入，沿维管束往上扩散蔓延，堵塞导管，产生毒素，破坏维管束的水分和养分的输送功能，从而使香蕉植株的地上部分得不到水分和养分而发黄枯萎。病原菌的厚垣孢子可在土壤中存活10多年，是一种积年流行的病害。由于香蕉枯萎病病原菌在维管束内扩展侵染，至今尚无十分有效的化学药剂防治和高抗枯萎病品种。因此，生物防治受到广泛关注。已报道或申请专利的香蕉枯萎病生物防治措施，大部分是采用芽孢杆菌作为生防菌株，这类菌株作为生防菌有许多优点，但也存在一个严重不足，即菌株本身对病原菌的拮抗能力不强，从而有可能影响其生防效果。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种防治香蕉枯萎病的白刺链霉菌株BWL15-4，由于该菌株本身分离自植物根际土壤，是土壤习居菌，根际定殖能力强，生防效果良好，尤其对香蕉枯萎病病原菌的拮抗能力强。本发明的第二个目的在于提供上述白刺链霉菌株BWL15-4在防治香蕉枯萎病中的应用。本发明的第三个目的在于提供一种含有上述白刺链霉菌株BWL15-4的制剂。本发明的第四个目的在于提供上述制剂的制备方法，该制备方法工艺简单，发酵培养基无需贵重原料，成本低，容易推广。本发明的最后一个目的在于提供上述制剂在防治香蕉枯萎病中的应用。本发明的第一个目的是通过如下技术手段来实现的一种防治香蕉枯萎病的白刺链霉菌株BWL 15-4，该菌株BWL 15_4的分类命名为白刺链霉菌(Sti^ptomyces albospinus)，于2011年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No. 4836。该菌株的16S rDNA部分基因序列(1491bp)已提交美国国家生物技术信息中心 (NCBI)的Genebank基因序列数据库，登录号为JN038327 ；该菌株BWL15-4的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
本发明的第二个技术方案是通过如下技术方案来实现的上述白刺链霉菌株 BWL15-4在防治香蕉枯萎病中的应用。本发明的第三个技术方案是通过如下技术方案来实现的一种防治香蕉枯萎病的制剂，含有上述白刺链霉菌株BWL15-4的液体菌剂或固体菌剂。本发明的第四个技术方案是通过如下技术方案来实现的上述制剂的制备方法， 将上述白刺链霉菌株BWL15-4经菌种活化、液体或固体发酵工序制备获得液体菌剂或固体菌剂。 其中在上述制剂的制备方法中，还可以含有种子培养工序，即将上述白刺链霉菌株BWL15-4经菌种活化、种子培养、液体或固体发酵工序制备获得液体菌剂或固体菌剂。具体来说，本发明中的液体菌剂可以通过以下工艺流程获得菌种BWL15-4活化 (即一级种子培养)一菌种培养(即二级种子培养，可选)一液体发酵(发酵罐，无菌空气， 培养液)一液体菌剂。其中液体培养基可以为葡萄糖1_3%、黄豆饼粉1_4%、可溶性淀粉1-4%、酵母 0.2%,NaCl 0.4%、CaC030. 25%、消泡剂0. 1-0.3%，按质量百分含量计。以下仅为优选的培养基，实际上本发明对培养条件和液体培养基并没有特别严格的限制，只要该条件和液体培养基适合菌株的生长即可。具体来说，本发明中的固体菌剂可以通过如下工艺流程获得菌种BWL15-4活化 (即一级种子培养)一菌种培养(即二级种子培养，可选)一固体发酵(固体培养基质)一发酵饼一干燥粉碎，与吸附载体按1 1或者其它比例混合，混勻后适当干燥，制成固体菌齐U。其中吸附载体可为非耕作层土、高岭土等多种载体。其中固体发酵时采用的固体培养基优选为包括大米60-70 %，黄豆粉5-15 %，麦皮10-20%，沙土 5%，按质量百分含量计。以上仅为本发明优选的培养基，实际上本发明对培养条件以及固体培养基的选择其实并没有特别严格的限制，只要该条件和固体培养基适合菌株的生长即可。本发明的最后一个目的是通过如下技术手段来实现的上述制剂在防治香蕉枯萎病中的应用。本发明中的制剂在防治香蕉枯萎病时，可以将液体菌剂或固体菌剂与普通有机肥按2 100的比例混合拌勻后作为底肥施用，每个定植穴施2. 5公斤，在香蕉种植前施用； 在香蕉种植后的生长期，可将液体菌剂或者固体菌剂以稀释5-10倍的比例加入到溶解的常规肥料中，对香蕉植株进行浇灌施肥。或者本发明中的液体菌剂防治香蕉枯萎病可以通过将液体菌剂稀释成2倍或根据需要进行稀释后液灌根或浇施于植株基部，或于香蕉苗移栽前浸根。与现有技术相比，本发明具有如下优点(1)本发明以白刺链霉菌BWL15-4作为拮抗菌株，对香蕉枯萎病菌抑制作用强，对香蕉枯萎病具有良好的防治效果；(2)本发明的制剂对香蕉具有促生长作用；(3)本发明白刺链霉菌菌株BWL15-4培养条件简单，容易保存，易于工业化生产， 有着良好的开发应用前景；(4)本发明制防治香蕉枯萎病的剂制备方法工艺简单，发酵培养基无需贵重原料，成本低，容易推广。
图1是实施例1中筛选得到的白刺链霉菌BWL15-4菌株孢子及孢子链的扫描电镜照片，孢子表面有细刺；
图2是实施例1中制备的白刺链霉菌BWL15-4菌株与香蕉枯萎病菌4号生理小种的室内平板对峙培养的抑菌效果，其中，1为白刺链霉菌BWL15-4菌株，2为香蕉枯萎病菌4 号生理小种；图3是实施例1中制备的白刺链霉菌BWL15-4菌株与香蕉枯萎病菌4号生理小种的室内平板对峙培养的抑菌效果，其中，1为白刺链霉菌BWL15-4菌株，2为香蕉枯萎病菌4 号生理小种。实施例1菌株的分离和鉴定本实施例中的生防菌BWL15-4是从海南岛霸王岭原始森林土壤中筛选分离到的一株链霉菌，该菌株对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)具有强烈的抑制作用，2011年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC,保藏号为CGMCC No. 4836，经鉴定命名为白刺链霉菌BWL 15-4菌株(Sti^ptomyces albospinus BffL 15-4)。菌株BWL15-4的分离筛选过程如下将在海南岛霸王岭原始森林中采集植物根际土壤样品进行风干，用无菌水稀释适当倍数后涂布于筛选培养基上，筛选培养基是添加重铬酸钾、萘啶酸和放线菌酮的PDA固体培养基，28°C培养5天以上，待筛选平板上长出放线菌菌落后，再于平板上适当位置接入1个或多个指示菌香蕉枯萎病菌菌饼，当某个放线菌落具有拮抗作用时，指示菌便不能越过此放线菌生长，呈现明显的拮抗带，挑取具有拮抗作用的放线菌，划线纯化三次，进行平板对峙实验，选择拮抗带较宽的放线菌作为候选菌株， 将候选菌株进行液体发酵，取发酵液IOmL过滤除菌，用牛津杯进行平板对峙实验检验发酵液中抗菌活性物质的产生情况，产生抗菌物质的发酵液再于香蕉枯萎病病圃中进行田间防效筛选，由此筛选出田间防治效果良好的拮抗菌株BWL15-4。菌株BWL15-4的鉴定过程如下首先对其进行16S rDNA序列分析，将本菌株的16S rDNA 序列在线提交至Ij gene bank(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)中进 亍 Blast 比对，发现其与白刺链霉菌(Str印tomyces albospinus)处于同一个进化分支，同源性达 99%以上，本菌株的16S rDNA序列部分基因序列(1493bp)，已提交美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Genebank基因序列数据库，登录号为JN038327，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。然后对BWL15-4菌株进行形态学特征、培养特征和生理生化特性分析鉴定，经分析其形态特征是在扫描电镜下孢子丝呈2-3圈螺旋形，孢子呈卵圆形，表面带细刺(见图 1)；其培养特征是在营养琼脂平板上有丰富的气生菌丝和基内菌丝，气丝灰白色，基丝榄黄色，无可溶性色素；其生理生化特性是能液化明胶，淀粉水解弱，还原硝酸盐，不产硫化氢和黑色素，利用尿素，能利用果糖、木糖、甘油、乳糖、水杨苷、菊糖、葡萄糖、肌醇、甘露醇、 半乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、山梨糖，不利用阿拉伯糖、蔗糖、卫矛醇，在棉子糖、甘露糖为唯一碳源的培养基质上生长差。结果表明本菌株的形态学特征和培养特征和白刺链霉菌完全相同，生理生化特性绝大部分和白刺链霉菌相同。因此，综合16S rDNA序列的比对结果和形态特征、培养特征和生理生化特性分析的结果，将BWL15-4菌株鉴定为白刺链霉菌，命名为白刺链霉菌 BWL15-4 菌株(Streptomyces albospinus BWL15-4)。该菌株抑菌作用强，在室内平板对峙培养实验中抑菌圈直径平均为18mm，被抑制的指示菌香蕉枯萎病菌4号生理小种菌丝尖端膨大，变黑，细胞质液外泄(见图2和图3)， 说明该菌株的代谢产物对病原菌菌丝具杀死作用和很强的抑制作用。实施例2
液体菌剂及其制备方法本实施例提供的含有上述白刺链霉菌株BWL15-4的液体菌剂通过如下方法制备
获得(1)菌种活化，将白刺链霉菌株BWL15-4接种到固体培养基上，培养基为营养琼脂
培养基；(2)种子培养，将活化菌种接种到液体培养基，配方为葡萄糖1 %，黄豆饼粉1 %， 酵母膏0.2%，NaCl 0. 3%, CaCO3O. 1%, K2HPO4O. 05% ；按质量百分含量计，其余为水；pH值 7.0-7.2;在281下三角瓶16011)111摇瓶发酵培养72小时，如果步骤(1)中经菌种活化即一级种子培养后，菌种数量足够多则可以直接进行液体发酵，而不需再经种子培养即二级种子培养工序；(3)液体发酵，将种子液按6% (V/V)添加到液体培养基中，配方为葡萄糖2%、 黄豆饼粉2%、可溶性淀粉2%、酵母膏0.2%、NaCl 0.4%, CaCO3O. 25%、消泡剂0. 1%，按质量百分含量计，其余为水，本实施例中采用的为较佳的培养基，其它培养基也可以，并无特别的限制，PH值7. 2，罐温28°C，罐压0. 07Mpa，搅拌速度200rpm，通氧量> 60%，发酵时间约7天，获得液体发酵制剂，供田间防治病害用。实施例3固体菌剂及其制备方法本实施例提供的含有上述白刺链霉菌株BWL15-4的固体菌剂通过如下方法制备
获得(1)菌种活化将白刺链霉菌株BWL15-4接种到固体培养基上，培养基为营养琼脂
培养基；(2)种子培养将活化菌种接种到液体培养基，配方为葡萄糖1 %，黄豆饼粉1 %， 酵母膏0.2%，NaCl 0. 3%, CaCO3 0.1%, K2HPO4 0. 05%，按质量百分含量计，其余为水；pH 值7. 0-7. 2 ；在28°C下三角瓶160转/分钟摇瓶发酵培养72小时，如果步骤(1)中经菌种活化即一级种子培养后，菌种数量足够多则可以直接进行固体发酵，而不需再经种子培养即二级种子培养工序；(3)固体培养将种子培养液与固体培养基混合，固体培养基配方为大米65%， 黄豆粉15%，麦皮15%，沙土 5%，以上按质量百分含量计，本实施例中采用的为较佳的培养基，其它培养基也可以，并无特别的限制；28°C -30°C培养时间14天左右，此时固体培养基应充分生长且大量产孢；(4)菌剂制备将已充分发酵的固体培养物与非耕作层或高岭土按1 1或者其它比例混合后干燥粉碎，即制成固体菌剂。
实施例4液体菌剂和固体菌剂对香蕉枯萎病田间防治效果试验用菌剂实施例2中制备的白刺链霉菌BWL15-4液体菌剂，实施例3中制备的白刺链霉菌BWL15-4固体菌剂，清水对照。试验地点中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口香蕉枯萎病病圃。
供试香蕉品种感枯萎病品种巴西蕉。施药方法定植穴预处理用上述含白刺链霉菌BWL15-4菌株的液体菌剂2倍稀释液IL浇淋定植穴，然后覆盖薄土；固体菌剂与有机肥按1 1混合后，每个定植穴放用2. 5公斤，与穴内土壤充分拌勻。香蕉苗预施菌剂处理移栽前一天，将香蕉苗用含有白刺链霉菌BWL15-4菌株液体菌剂的2倍稀释液浸根；固体菌剂稀释5倍后用于香蕉苗浸根。移栽将浸根后的香蕉苗移栽于处理过的定植穴中。管理定期施肥，液体菌剂处理每月用液体菌剂的5倍稀释液2L灌根一次，固体菌剂处理每月用固体菌剂的5倍稀释液灌根一次，6个月后记录植株病情指数、发病率，并计算防治效果。发病率％=发病株(叶)数X 100/调查总株(叶)数病情指数％ = Σ (各级病株(叶)数X该病级值)/调查总株(叶)数X最高级值防治效果％ =(对照病情指数-处理病情指数)X 100/对照病情指数香蕉枯萎病病情调查分级标准0级外观无可见症状，解剖假茎维管束组织未见变褐，1级外观无可见症状，解剖假茎维管束组织变褐，2级叶片黄化或倒垂，3级假茎基部开裂，但病株尚未枯死，4级病株枯死。试验结果对照区在香蕉苗定植后40天开始出现香蕉枯萎病症状，经白刺链霉菌BWL15-4菌株液体制剂或固体菌剂处理的香蕉在处理150天后才有个别植株基部叶表现轻度黄叶症状，液体菌剂处理的试验6个月后的防治效果为84% (详见表1)，固体菌剂处理的6个月后的防治效果为80% (详见表2)，表明对香蕉枯萎病具有良好的防治效果。表1白刺链霉菌BWL15-4液体菌剂对香蕉枯萎病的防治效果
~lm发病率(％)病情指数防治效果(％)
CK9062 5~
液体菌齐IJ 201084 表2白刺链霉菌BWL15-4固体菌剂对香蕉枯萎病的防治效果
权利要求
1.一种防治香蕉枯萎病的白刺链霉菌株BWL15-4，其特征是该菌株BWL 15_4的分类命名为白刺链霉菌(Sti^ptomyces albospinus)，于2011年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4836。
2.权利要求1所述的白刺链霉菌株BWL15-4在防治香蕉枯萎病中的应用。
3.一种防治香蕉枯萎病的制剂，其特征是含有权利要求1所述的白刺链霉菌株 BWL15-4的液体菌剂或固体菌剂。
4.权利要求3所述制剂的制备方法，其特征是将白刺链霉菌株BWL15-4经含菌种活化、液体或固体发酵工序制备获得液体菌剂或固体菌剂。
5.根据权利要求4所述制剂的制备方法，其特征是还包括种子培养工序。
6.根据权利要求5所述制剂的制备方法，其特征是液体发酵时采用的培养基包括葡萄糖1-3%、黄豆饼粉1_4%、可溶性淀粉1-4%、酵母膏0. 2%, NaClO. 4%, CaCO3 0. 25%, 消泡剂0. 1-0.3%，按质量百分含量计。
7.根据权利要求5所述制剂的制备方法，其特征是固体发酵时采用的固体培养基包括大米60-70 %，黄豆粉5-15 %，麦皮10-20 %，沙土 5_10 %，按质量百分含量计。
8.权利要求3所述制剂在防治香蕉枯萎病中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种防治香蕉枯萎病的白刺链霉菌株BWL15-4，该菌株BWL15-4的分类命名为白刺链霉菌(Streptomyces albospinus)，于2011年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4836。该菌株对香蕉枯萎病病原菌的拮抗能力强，可用于防治香蕉枯萎病；还公开了含有该菌株的菌剂及其制备方法和应用，该菌剂不仅能抑制香蕉枯萎病，还对植株有一定的促生长作用。
文档编号C12R1/465GK102329756SQ20111029609
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者彭明, 曾会才, 曾涛, 莫坤联, 陈汉清 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所