专利名称：一种嗜酸乳杆菌抗冻培养基及其应用方法
技术领域：
本发明属于嗜酸乳杆菌制品生产技术领域，涉及一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率及菌粉活菌数的抗冻培养基及其应用方法。
背景技术：
嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)是人和动物肠道内的主要微生物之一，也是目前乳酸菌家族中极为重视研究开发的益生菌。当存在一定数量时，它能有效地调节肠道内有益和有害微生物菌群间的平衡，从而达到促进宿主健康的功效。大量科学研究证明嗜酸乳杆菌具有①缓解乳糖不耐症；②抑制肠道中的致病菌，预防腹泻发生；③增进机体的免疫能力；④降低血清胆固醇水平；⑤抑制诱导肿瘤细胞生成的前体物质，预防癌变细胞的形成。真空冷冻干燥具有以下几个优点①蛋白质、微生物不产生或较少变性或失去活力；②物料中的挥发性成分或热敏性营养成分损失少；③在低温下，能最好地保持物质原来的性状④干燥后体积、形状变化，物料呈海绵状，无干缩，复水时，能迅速回复到原来的性状；⑤能除去物料中95% -99%的水分，制品保存期长。目前，利用冻干技术制备和贮存嗜酸乳杆菌菌粉已有很多报道。然而，由于嗜酸乳杆菌特有的生理性状，菌体细胞在冷冻和干燥过程中死亡率很高，造成菌粉中活菌含量低而影响产品质量。同时，要提高菌粉的常温稳定性，还必须把冻干过程对活菌的不良损伤尽可能减少。要实现此目的，可在冻干前的菌泥中加入复合保护剂，这是目前主要采用的方法，如CN200910236172. 8中公开了一种嗜酸乳杆菌冻干复合保护剂，其配方如下9 11 重量份脱脂奶粉、10 12重量份乳糖、0. 3 0. 6重量份甘油、1. 5 2. 5重量份谷氨酸钠和0. 15 0. 25重量份维生素C ；CN200910056871. 4中也公开了一种嗜酸乳杆菌冻干保护剂，保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠0. 1 5. 0%、乳糖0. 1 8. 0%、海藻糖1 15%、抗氧化剂0. 1 1%、脱脂奶粉1 20%、甘油或吐温-800. 1 5. 0%，其余为水。文献“PVPK-30对嗜酸乳杆菌的冻干保护研究”中公开了一种嗜酸乳杆菌保护剂配方为4% PVP !(。。。(^脱脂乳^^海藻糖、。.5%谷氨酸钠和4%甘油。除此之外，还可以在培养基中添加一些物质，这些物质可在培养的过程中积累在嗜酸乳杆菌体内或转化成其它物质，抑制冻干过程中共晶现象的发生，这些物质的添加也可改变嗜酸乳杆菌细胞膜脂肪酸组成，甚至诱导细胞产生大量的抗冻蛋白，从而有效提高嗜酸乳杆菌菌体的抗冷冻能力，可以达到减少甚至避免菌体冻干损伤、提高活菌存活率和菌粉活菌数、延长冻干嗜酸乳杆菌菌粉常温保存期的目的。目前还没有检索到有关嗜酸乳杆菌抗冻培养基方面的发明专利。
发明内容
本发明的目的在于提供一种嗜酸乳杆菌抗冻培养基及其应用方法，解决了嗜酸乳杆菌在冻干过程中存在的冻干存活率不高，活菌数低的问题。
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为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案一种嗜酸乳杆菌抗冻培养基，该抗冻培养基的配方组成包括以下组分16-20g葡萄糖、0. 4-0. Sg蒺藜多糖、3-5g酵母提取物、4-6g氯化钠、0. 3-0. 5g甘露醇、0. 8-1. 2g谷氨酸钠，8-12g大豆蛋白胨、0. 5-2. Og柠檬酸氢二铵、0. 2-0. 5g甜菜碱、1. 0-2. 5g磷酸氢二钾、 0. 1-0. 2g MgS04、0. 5-1. Oml 吐温 80 和 IOOOml 蒸馏水。所述抗冻培养基的配方组成包括以下组分18g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖、3. 5g酵母提取物、5. Og氯化钠、0. 35g甘露醇、1. Og谷氨酸钠，9. Og大豆蛋白胨、1. 5g柠檬酸氢二铵、 0. 4g甜菜碱、1. 5g磷酸氢二钾、0. Ig MgS04、0. 8ml吐温80和IOOOml蒸馏水。所述抗冻培养基的配方组成包括以下组分20g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖、4. 5g酵母提取物、4. Og氯化钠、0. 4g甘露醇、1. 2g谷氨酸钠，8. Og大豆蛋白胨、2. Og柠檬酸氢二铵、 0. 5g甜菜碱、1. 5g磷酸氢二钾、0. Ig MgSO4U. Oml吐温80和IOOOml蒸馏水。所述嗜酸乳杆菌抗冻培养基的制备方法，包括以下步骤(1)将按量称取的谷氨酸钠、甜菜碱和甘露醇溶解于50mL蒸馏水中，然后用 0. 22 μ m滤膜过滤除菌得滤液；(2)向950mL蒸馏水中加入按量称取的葡萄糖、蒺藜多糖、酵母提取物、氯化钠、大豆蛋白胨、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、MgSO4和吐温80，加热溶解并混合均勻，调节pH至 5. 6-6. 0，然后装于厌氧瓶中，装量为90%，并在厌氧瓶盖的橡胶塞上插Iml注射器针头，于 118-121°C灭菌15-20min，灭菌后拔下注射器针头，冷却至室温得培养基A ；(3)在超净工作台中用无菌注射器将滤液与培养基A混合均勻，得嗜酸乳杆菌抗冻培养基。上述嗜酸乳杆菌抗冻培养基的应用方法，包括以下步骤将已活化三次的嗜酸乳杆菌按5%的接种量接入嗜酸乳杆菌抗冻培养基中于 37°C恒温培养16-1 1，然后在6000rpm离心10-15min，弃去上清液，得嗜酸乳杆菌菌泥，向菌泥中加入脱脂奶粉、核黄素和磷酸缓冲液，核黄素和磷酸缓冲液的加入有利于进一步提高冻干存活率，每克菌泥中加入0. 2g脱脂奶粉、0. 006g核黄素和0. 8ml pH6. 8的磷酸缓冲液，混合均勻后于_40°C预冻3-12h，然后放入冻干机中于-56°C、4-6I^a下进行冷冻干燥 18-24h，得嗜酸乳杆菌菌粉。本发明所述嗜酸乳杆菌抗冻培养基含有甘露醇，氯化钠以及甜菜碱等组分，将各个组分按照比例混合后制得抗冻培养基，用该培养基获得的嗜酸乳杆菌具有更高的抗冷冻能力，与现有技术相比，本发明至少具有以下优点采用该抗冻培养基培养嗜酸乳杆菌后， 可使其冻干存活率最高达79. M%，菌粉活菌数最高达4. OgXlO^cfu/g，而以嗜酸乳杆菌常用的商业培养基MRS肉汤培养，制备的菌粉冻干存活率最高仅为49. 72%，活菌数最高仅为 1. 24X10ncfu/go
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例1准确称取18g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖，3. 5g酵母提取物、5. Og氯化钠、9. Og大豆蛋白胨、1.5g柠檬酸氢二铵、1.5g磷酸氢二钾、0. Ig MgSO4和0.8ml吐温80溶解于950mL蒸馏水中，加热溶解并混合均勻，用Imol/LNaOH调节pH至5. 6，然后装于厌氧瓶中，装量为 90%，并在厌氧瓶盖的橡胶塞上插Iml注射器针头，在118°C灭菌15min，灭菌后拔下注射器针头，冷却至室温得培养基A ；所述蒺藜多糖的制备方法，包括以下步骤将干燥的蒺藜粉碎后过40目筛得蒺藜粉末，向IOOg蒺藜粉末中加入1400mL蒸馏水，调节pH值为4. 8后在55°C水浴保温下添加蒺藜粉末质量2.0%的酶活力为6000U/g的纤维素酶反应3. 0h，反应后置于电磁炉上，将功率调至2000W加热至沸腾，然后调至1000W并保持20min，然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液得蒺藜多糖提取液，将蒺藜多糖提取液经旋转蒸发仪浓缩至IOOg得浓缩液，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇后在冰箱中静置16h，然后抽滤，收集滤渣得粗多糖，将粗多糖用质量分数80%的乙醇水溶液洗涤，再用氯仿、正丁醇依次洗涤，洗涤后用滤纸过滤，收集滤渣得湿多糖，将湿多糖在45°C烘干至恒重，然后粉碎得蒺藜多糖；准确称取0. 4g甜菜碱、0. 35g甘露醇和1. Og谷氨酸钠溶解于50ml蒸馏水中，然后用0. 22 μ m无菌滤膜进行过滤除菌得滤液；按照无菌操作要求，在超净工作台中用无菌注射器将滤液与培养基A混合均勻， 得嗜酸乳杆菌抗冻培养基。将活化好的嗜酸乳杆菌按5% (ν/ν)的接种量分别接入上述抗冻培养基和商业 MRS培养基(对照培养基)中于37°C培养18h，然后在6000r/min离心lOmin，弃去上清液， 获得嗜酸乳杆菌菌泥，称量菌泥质量，向菌泥中加入脱脂奶粉、核黄素和磷酸缓冲液，其加量按每克菌泥添加0. 2g脱脂奶粉、0. 006g核黄素和0. 8ml的pH6. 8的磷酸缓冲液，混合均勻后于-40°C预冻4h，然后放入冻干机中于-56°C、5I^下进行冷冻干燥20h，即得嗜酸乳杆菌菌粉，冻干存活率为78. 32% (对照培养基为48. 52% )，菌粉活菌数为3. 79 X IO11Cfu/ g(对照培养基为1. 12X10ncfu/g)o实施例2准确称取20g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖，4. 5g酵母提取物、4. Og氯化钠、8. Og大豆蛋白胨、2. Og柠檬酸氢二铵、1.5g磷酸氢二钾、0. Ig MgSO4和1.0ml吐温80溶解于950mL 蒸馏水中，加热溶解并混合均勻，用Imol/LNaOH调节pH至6. 0，然后装于厌氧瓶中，装量为 90%，并在厌氧瓶盖的橡胶塞上插Iml注射器针头，在118°C灭菌15min，灭菌后拔下注射器针头，冷却至室温得培养基A ；所述蒺藜多糖的制备方法，其中，水浴保温的温度为55°C，湿多糖的烘干温度为 55 °C，其他步骤同实施例1 ；准确称取0. 5g甜菜碱、0. 4g甘露醇和1. 2g谷氨酸钠溶解于50ml蒸馏水中，然后用0. 22 μ m无菌滤膜进行过滤除菌得滤液；按照无菌操作要求，在超净工作台中用无菌注射器将滤液与培养基A混合均勻， 得嗜酸乳杆菌抗冻培养基。将活化好的嗜酸乳杆菌按5% (ν/ν)的接种量分别接入上述抗冻培养基和商业 MRS培养基(对照培养基)中于37°C培养16h，然后在6000r/min离心lOmin，弃去上清液， 获得嗜酸乳杆菌菌泥，称量菌泥质量，向菌泥中加入脱脂奶粉、核黄素和磷酸缓冲液，其加量按每克菌泥添加0. 2g脱脂奶粉、0. 006g核黄素和0. 8ml的pH6. 8的磷酸缓冲液，混合均勻后于-40°C预冻4h，然后放入冻干机中于-56°C、5I^下进行冷冻干燥Mh，即得嗜酸乳杆菌菌粉，冻干存活率为76. 69 % (对照培养基为47. 21 % )，菌粉活菌数为3. 62 X IO11Cfu/ g(对照培养基为1.20X10ncfu/g)o实施例3准确称取19g葡萄糖、0. 4g蒺藜多糖，5. Og酵母提取物、6. Og氯化钠、12. Og大豆蛋白胨、0. 5g柠檬酸氢二铵、1. Og磷酸氢二钾、0. 2g MgSO4和0. 5ml吐温80溶解于950mL 蒸馏水中，加热溶解并混合均勻，用Imol/LNaOH调节pH至5. 8，然后装于厌氧瓶中，装量为 90%，并在厌氧瓶盖的橡胶塞上插Iml注射器针头，在120°C灭菌15min，灭菌后拔下注射器针头，冷却至室温得培养基A ；所述蒺藜多糖的制备方法，其中，水浴保温的温度为50°C，湿多糖的烘干温度为 50°C，其他步骤同实施例1 ；准确称取0. 3g甜菜碱、0. 3g甘露醇和0. Sg谷氨酸钠溶解于50ml蒸馏水中，然后用0. 22 μ m无菌滤膜进行过滤除菌得滤液；按照无菌操作要求，在超净工作台中用无菌注射器将滤液与培养基A混合均勻， 得嗜酸乳杆菌抗冻培养基。将活化好的嗜酸乳杆菌按5% (ν/ν)的接种量分别接入上述抗冻培养基和商业 MRS培养基(对照培养基)中于37°C培养18h，然后在6000r/min离心15min，弃去上清液， 获得嗜酸乳杆菌菌泥，称量菌泥质量，向菌泥中加入脱脂奶粉、核黄素和磷酸缓冲液，其加量按每克菌泥添加0. 2g脱脂奶粉、0. 006g核黄素和0. 8ml的pH6. 8的磷酸缓冲液，混合均勻后于-40°C预冻12h，然后放入冻干机中于-56°C、6I^a下进行冷冻干燥18h，即得嗜酸乳杆菌菌粉，冻干存活率为75. 47% (对照培养基为46. 83% )，菌粉活菌数为3. 57X IO11Cfu/ g(对照培养基为1. 15X10ncfu/g)o实施例4准确称取16g葡萄糖、0. 8g蒺藜多糖，3. Og酵母提取物、6. Og氯化钠、10. Og大豆蛋白胨、1. Og柠檬酸氢二铵、2. 5g磷酸氢二钾、0. 15g MgSO4和0. 5ml吐温80溶解于950mL 蒸馏水中，加热溶解并混合均勻，用Imol/LNaOH调节pH至6. 0，然后装于厌氧瓶中，装量为 90%，并在厌氧瓶盖的橡胶塞上插Iml注射器针头，在121°C灭菌20min，灭菌后拔下注射器针头，冷却至室温得培养基A ；所述蒺藜多糖的制备方法，其中，水浴保温的温度为53°C，湿多糖的烘干温度为 60°C，其他步骤同实施例1。准确称取0. 2g甜菜碱、0. 5g甘露醇和0. Sg谷氨酸钠溶解于50ml蒸馏水中，然后用0. 22 μ m无菌滤膜进行过滤除菌得滤液；按照无菌操作要求，在超净工作台中用无菌注射器将滤液与培养基A混合均勻， 得嗜酸乳杆菌抗冻培养基。将活化好的嗜酸乳杆菌按5% (ν/ν)的接种量分别接入上述抗冻培养基和商业 MRS培养基(对照培养基)中于37°C培养17h，然后在6000r/min离心12min，弃去上清液， 获得嗜酸乳杆菌菌泥，称量菌泥质量，向菌泥中加入脱脂奶粉、核黄素和磷酸缓冲液，其加量按每克菌泥添加0. 2g脱脂奶粉、0. 006g核黄素和0. 8ml的pH6. 8的磷酸缓冲液，混合均勻后于-40°C预冻3h，然后放入冻干机中于-56°C、4I^下进行冷冻干燥22h，即得嗜酸乳杆菌菌粉，冻干存活率为77. 28 % (对照培养基为47. 91 % )，菌粉活菌数为3. 71 X IO11Cfu/
6g(对照培养基为1. 19X10ncfu/g)o
权利要求
1.一种嗜酸乳杆菌抗冻培养基，其特征在于该抗冻培养基的配方组成包括以下组分16-20g葡萄糖、0. 4-0. 8g蒺藜多糖、3-5g酵母提取物、4-6g氯化钠、0. 3-0. 5g甘露醇、0. 8-1. 2g谷氨酸钠，8-12g大豆蛋白胨、0. 5-2. Og柠檬酸氢二铵、0. 2-0. 5g甜菜碱、 1. 0-2. 5g 磷酸氢二钾、0. 1-0. 2g MgS04、0. 5-1. Oml 吐温 80 和 IOOOml 蒸馏水。
2.根据权利要求1所述一种嗜酸乳杆菌抗冻培养基，其特征在于所述抗冻培养基的配方组成包括以下组分18g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖、3. 5g酵母提取物、5. Og氯化钠、0. 35g 甘露醇、1. Og谷氨酸钠，9. Og大豆蛋白胨、1. 5g柠檬酸氢二铵、0. 4g甜菜碱、1. 5g磷酸氢二钾、0. lgMgS04、0. 8ml 吐温 80 和 IOOOml 蒸馏水。
3.根据权利要求1所述一种嗜酸乳杆菌抗冻培养基，其特征在于所述抗冻培养基的配方组成包括以下组分20g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖、4. 5g酵母提取物、4. Og氯化钠、0. 4g 甘露醇、1. 2g谷氨酸钠，8. Og大豆蛋白胨、2. Og柠檬酸氢二铵、0. 5g甜菜碱、1. 5g磷酸氢二钾、0. IgMgSO4U. Oml 吐温 80 和 IOOOml 蒸馏水。
4.根据权利要求1、2或3所述一种嗜酸乳杆菌抗冻培养基，其特征在于所述嗜酸乳杆菌抗冻培养基的制备方法，包括以下步骤(1)将称取的谷氨酸钠、甜菜碱和甘露醇溶解于50mL蒸馏水中，然后用0.22μπι滤膜过滤除菌得滤液；(2)向950mL蒸馏水中加入称取的葡萄糖、蒺藜多糖、酵母提取物、氯化钠、大豆蛋白胨、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、MgSO4和吐温80，加热溶解，调节pH至5. 6-6. 0,然后于 118-121°C灭菌15-20min，灭菌后冷却至室温得培养基A ；(3)将滤液与培养基A混合均勻，得嗜酸乳杆菌抗冻培养基。
5.一种如权利要求1所述嗜酸乳杆菌抗冻培养基的应用方法，其特征在于包括以下步骤将活化的嗜酸乳杆菌按5%的接种量接入嗜酸乳杆菌抗冻培养基中于37 °C培养 16-1他，然后在6000rpm离心10-15min，得嗜酸乳杆菌菌泥，向菌泥中加入脱脂奶粉、核黄素和磷酸缓冲液，每克菌泥中加入0. 2g脱脂奶粉、0. 006g核黄素和0. 8ml pH6. 8的磷酸缓冲液，混合均勻后于_40°C预冻3-12h，然后放入冻干机中于-56°C、4-6I^a下进行冷冻干燥 18-24h，得嗜酸乳杆菌菌粉。
全文摘要
本发明提供一种嗜酸乳杆菌抗冻培养基及其应用方法包括16-20g葡萄糖、0.4-0.8g蒺藜多糖、3-5g酵母提取物、4-6g氯化钠、0.3-0.5g甘露醇、0.8-1.2g谷氨酸钠，8-12g大豆蛋白胨、0.5-2.0g柠檬酸氢二铵、0.2-0.5g甜菜碱、1.0-2.5g磷酸氢二钾、0.1-0.2g MgSO4、0.5-1.0ml吐温80和1000ml蒸馏水。本发明具有以下优点采用该抗冻培养基培养嗜酸乳杆菌后，可使其冻干存活率最高达79.54％，菌粉活菌数最高达4.09×1011cfu/g，而以嗜酸乳杆菌MRS肉汤培养，制备的菌粉冻干存活率仅为49.72％，活菌数仅为1.24×1011cfu/g。
文档编号C12N1/04GK102408992SQ201110376538
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者张华 , 王娟, 秦涛, 舒国伟, 蔡宁冈, 陈合, 马齐 申请人:陕西农产品加工技术研究院