专利名称：一种克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法
技术领域：
一种克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法，具体涉及一种在大肠杆菌BL21中表达腈水合酶调控蛋白的方法。
背景技术：
腈水合酶(Nitrilehydratase，简称 NHase，EC 4. 2. 1. 84)，是一种催化腈基化合物转变为酰胺基化合物的金属酶。用这种酶所生产的丙烯酰胺已近百万吨，占整个丙烯酰胺产量的三分之一。生物技术相对于传统的化学法有着成本低、能耗少、少污染的优势。目前，在美国、日本、法国等发达国家，这项生物技术正在取代传统的化学法。在我国，腈水合酶合成丙烯酰胺的生物技术虽然起步较晚，但发展很快，2008年数据统计，我国生物法生产的丙烯酰胺占整个丙烯酰胺产量的41%。丙烯酰胺是一种应用广泛的基础化工原料，在石油开采、造纸、装潢等方面发挥着重要的作用。随着市场的不断拓展，对丙烯酰胺的需求也在不断增长。另外这种酶也被应用在尼克酰胺的生产上。尼克酰胺是一种B组维生素，以辅酶I及辅酶II的形式参与机体代谢，在人体和动物代谢方面起着十分重要的作用，广泛应用在医药、食品添加剂及饲料生产上。腈水合酶的广泛应用促使科学工作者开始研究这种金属酶的合成机制和催化机理。腈水合酶按所含金属离子的不同分为含铁和含钴两种，按基因结构的不同又可以分为四类。虽然它们催化的是同一类化学反应，这几类酶的合成模式却不同，这些不同突出表现在金属离子摄取方式的不同。其中第一类和第二类腈水合酶中钴离子的摄取机理已经判明，而第三类还没有报道，第四类腈水合酶(含铁型)的相关结论也不明确。阻碍探明第三类钴离子摄取机理的关键原因就是该类腈水合酶(以恶臭假单胞菌腈水合酶为代表)调控蛋白目前尚无成功克隆表达的方法。其原因在于目前恶臭假单胞菌中腈水合酶调控基因序列的ORF部分报道有误，而且即使正确识别该调控蛋白的0RF，该调控蛋白在SDS-PAGE上也很难检测到。
发明内容
本发明提供了一种识别腈水合酶调控蛋白的开放阅读框，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。本发明还提供了一种应用上述开放阅读框克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法。为解决上述问题，提供技术方案如下1)从NCBI上下载GenBank号为U89363. 1的序列并且识别SEQ ID NO. 1 ；2)在调控蛋白基因序列前加SD序列(AAGGAG)和His-tag序列；3)将上一步骤中构建的序列串联在腈水合酶成熟酶下游克隆到pET_Ma(+)，导入大肠杆菌BL21诱导表达；4) HPLC检测改造后腈水合酶酶活。本发明所述腈水合酶基因是来源于恶臭假单胞菌(I^eudomonas put i da)NRRL-18668 ( "A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase，，发表在 1997 的 Biochemistry)。
本发明的详细的步骤为
(1)获得正确的调控蛋白基因序列并识别正确的ORF
通过查阅恶臭假单胞菌中腈水合酶基因序列设计引物分别正确扩增成熟酶基因序列和调控蛋白基因序列。由于目前恶臭假单胞菌中腈水合酶调控基因序列的ORF部分报道有误(该调控蛋白基因序列有3种可能的0RF)，而且该调控蛋白在SDS-PAGE很难检测到，所以给正确识别调控蛋白的ORF增大了难度。通过尝试各种ORF并且在该调控蛋白N端加His-tag保护，对成功表达出有活性调控蛋白的0RF，最终确定为正确的调控蛋白ORF ；
(2)调控蛋白基因序列N端加His-tag
大肠杆菌BL21中表达恶臭假单胞菌中天然的腈水合酶全序列，国际上已多有报道其调控蛋白不能成功表达，通过在调控蛋白基因序列N端加His-tag，可成功表达调控蛋白；
(3)重叠PCR串联腈水合酶成熟酶与调控蛋白基因序列
通过重叠PCR将腈水合酶N端加有His-tag的调控蛋白基因序列串联在成熟酶基因序列下游；
(4)克隆到pET_Ma(+)导入大肠杆菌BL21中表达
将上一步骤中构建的腈水合酶全序列克隆到pET_Ma(+)导入大肠杆菌BL21中诱导表达；
(5) HPLC检测改造后腈水合酶酶活
腈水合酶HPLC检测条件流动相磷酸乙腈缓冲液；检测波长210nm ；色谱柱采用 C18 柱；
(6)腈水合酶调控蛋白N端测序
将表达出来的蛋白过镍柱纯化后N端测序，测序结果(见附图幻为His-tag对应序列，而这个His-tag是我们人为添加的，这就说明该蛋白就是腈水合酶调控蛋白，为进一步解析腈水合酶金属离子摄取机理和改进腈水合酶的工业化生产工艺打下良好的基础。
本发明的有益效果本发明提供了一种克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法，该方法能在大肠杆菌BL21中成功表达腈水合酶调控蛋白。
图1.腈水合酶全基因PCR
1、蛋白分子量标准；2、腈水合酶全基因PCR(调控蛋白基因N端加His-tag)。
图2.腈水合酶表达的SDS-PAGE电泳图
1、蛋白分子量标准；2、(含pET_Ma(+)和腈水合酶基因全序列其中调控蛋白N端加His-tag)全细胞。
图3.腈水合酶调控蛋白纯化后N端测序图
具体实施例方式
材料和检测方法
菌种为恶臭假单胞菌(I^seudomonasputic^NRRL-lSeeS，相关文献"A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase，，发表在 1997 的 Biochemistry上。腈水合酶HPLC检测条件流动相磷酸乙腈缓冲液；检测波长210nm ；色谱柱为C18柱。实施例11)获得正确的调控蛋白基因序列并识别正确的ORF通过查阅恶臭假单胞菌中腈水合酶基因序列设计引物分别正确扩增成熟酶基因序列和调控蛋白基因序列。由于目前恶臭假单胞菌中腈水合酶调控基因序列的ORF部分报道有误(该调控蛋白基因序列有3种可能的0RF)，而且该调控蛋白在SDS-PAGE很难检测到，所以给正确识别调控蛋白的ORF增大了难度。通过尝试各种ORF并且在该调控蛋白N端加His-tag保护，对成功表达出有活性调控蛋白的0RF，最终确定为正确的调控蛋白ORF ；2)调控蛋白基因序列N端加His-tag大肠杆菌BL21中表达恶臭假单胞菌中天然的腈水合酶全序列，国际上已多有报道调控蛋白不能成功表达，通过在调控蛋白基因序列N端加His-tag，可成功表达调控蛋白；3)重叠PCR串联腈水合酶成熟酶与调控蛋白基因序列通过重叠PCR将腈水合酶N端加有His-tag的调控蛋白基因序列串联在成熟酶基因序列下游；4)克隆到pET_Ma(+)导入大肠杆菌BL21中表达将上一步骤中的腈水合酶全序列克隆到pET_Ma(+)导入大肠杆菌BL21中诱导表达；5) HPLC检测改造后腈水合酶酶活腈水合酶HPLC检测条件流动相磷酸乙腈缓冲液；检测波长210nm ；色谱柱采用 C18 柱；6)腈水合酶调控蛋白N端测序将表达出来的蛋白过镍柱纯化后N端测序，测序结果(见附图3)为His-tag对应序列，而这个His-tag是我们人为添加的，这就说明该蛋白就是腈水合酶调控蛋白，为进一步解析腈水合酶金属离子摄取机理和改进腈水合酶的工业化生产工艺打下良好的基础。
权利要求
1.一种识别腈水合酶调控蛋白的开放阅读框，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
2.一种克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法，是在权利要求1所述开放阅读框前端加SD 序列和His-tag，与腈水合酶成熟酶基因串联，在大肠杆菌BL21中共表达。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述腈水合酶基因序列来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL-18668。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，构建pUC19-AB(his-tag)P克隆载体和 pET-24a(+) -AB (his-tag)P 表达载体。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达宿主菌为大肠杆菌BL21。
6.如权利要求2-5所述的任一方法，其特征在于，所述表达腈水合酶调控蛋白的重组大肠杆菌发酵培养基为1.2%胰蛋白胨，2.4(%酵母提取物，0.4(%甘油，1711111^2 04， 72mMK2HP04。
全文摘要
本发明公开了一种克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法，是采用在腈水合酶调控蛋白基因序列N端加His-tag，与腈水合酶成熟酶基因串联，在大肠杆菌BL21中共表达，属于基因克隆技术领域。本发明方法操作简单，具有较高的效率和成功率。
文档编号C12R1/19GK102492697SQ201110384089
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者刘义, 周哲敏, 崔文璟 申请人:江南大学