专利名称：一种β-葡萄糖苷酶产生菌的快速高通量筛选技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于96孔板高通量筛选β -葡萄糖苷酶产生菌的方法。
背景技术：
纤维素是地球上丰富且可再生的生物聚合物。由于其结构复杂，所以纤维素降解过程依靠复杂的多酶体系即内切纤维素酶、外切纤维素酶与β -葡萄糖苷酶三种酶的协同作用才能完成，其中葡萄糖苷酶是此过程的限速酶。纯培养分离技术与构建基因文库技术是用于挖掘环境样品中微生物资源的主要策略。目前对于葡萄糖苷酶产生菌的主要筛选方法是基于功能筛选，已有文献报道采用功能筛选法挖掘β -葡萄糖苷酶产生菌的研究策略是基于荧光法与七叶苷显色底物平板法。使用荧光底物(如MUGG-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷))筛选葡萄糖苷酶产生菌费力、经济成本高；使用七叶苷平板法筛选β-葡萄糖苷酶产生菌工作量大、效率低、费时费力；而选用对硝基酚葡萄糖苷 (PNPG)作为底物用于葡萄糖苷酶产生菌的高通量筛选尚未有文献报道。日前pNPG(对硝基酚-β-葡萄糖苷)主要用于葡萄糖苷酶的酶活测定，本发明基于PNPG与β-葡萄糖苷酶可发生黄色显色反应，并且反应产物在400-420nm处有最大吸光值。选用pNPG作为反应底物筛选葡萄糖苷酶产生菌，具有简便、快速、廉价、结果可信等特点。
发明内容
针对目前筛选葡萄糖苷酶产生菌的方法存在耗时、费力、效率低以及成本较高等问题，本发明通过提供一种基于96孔板高通量筛选β -葡萄糖苷酶产生菌的方法，从而有效解决上述存在的问题，仅限应用于葡萄糖苷酶产生菌的快速高通量初筛，复筛需进一步验证。本发明将公开一种过程简单，操作方便，成本低，菌株初筛快且适合于工业化大规模从备选材料中筛选出β -葡萄糖苷酶产生菌的方法，它以动物粪便或土壤样品为初筛物，经菌株复活培养、扩培、加入PNPG反应、显色后根据颜色为初步指标判断该菌株是否产 β-葡萄糖苷酶。本发明所述的是一种基于96孔板高通量筛选β -葡萄糖苷酶产生菌的方法，其操作步骤如下(1)将待筛选的单菌落在20-50°C，120-220rpm下液体培养基进行菌株复活；(2)复活菌液在 20-50°C，120-220rpm 下进行扩培 4_18h ；(3)取一 96孔板添加一定体积菌种生长培养基，按比例转接复活菌液，20-50°C， 120-220rpm培养4-1 进行扩培；(4)向96孔板扩培菌液中加入一定体积的反应底物pNPG(同时设置阳性对照与阴性对照)，20-50 0C，120-220rpm,反应一定时间；(5)添加一定体积Na2CO3溶液终止反应；(6)室温下将反应液转接96孔酶标板在酶标仪上检测其吸光值，以阳性对照、阴性对照吸收值为参照，可据数值大小判断不同菌株所产的葡萄糖苷酶的酶活力，确认初筛结果。上述基于96孔板高通量筛选β -葡萄糖苷酶产生菌的方法中，所述96孔板高通量筛选β -葡萄糖苷酶产生菌一般指细菌；菌种生长培养基一般指细菌生长培养基。上述基于96孔板高通量筛选β -葡萄糖苷酶产生菌的方法中，所述待筛选菌株的复活与扩培具体步骤是向菌种生长培养基中转接接种液比例为0. 5% -10%。上述基于96孔板高通量筛选β-葡萄糖苷酶产生菌的方法中，所述显色是向扩培菌液中添加反应底物PNPG的比例一般为-5%，pNPG的终浓度范围一般为0. I-IOmmol/ L，与pNPG显色反应时间在10-90min。上述基于96孔板高通量筛选β-葡萄糖苷酶产生菌的方法中，所述终止反应是向扩培菌液中添加0. 5-2. 5倍体积Na2CO3溶液，Na2CO3溶液的终浓度范围一般为0. 5-2. 5mol/ L0上述基于96孔板高通量筛选β-葡萄糖苷酶产生菌的方法中，所述阴性对照是细菌培养基中转接0.5%-10%不产β-葡萄糖苷酶菌的菌液；阳性对照是细菌培养基中转接 0. 5% -10%浓度为200U/mL的β -葡萄糖苷酶或β -葡萄糖苷酶产生菌的菌液。上述基于96孔板高通量筛选β -葡萄糖苷酶产生菌的方法中，所述细菌培养基一般指LB培养基、SOB培养基、SOC培养基、TB培养基、2 X YT培养基、YPD培养基、GYT培养基、Μ9培养基、NXCYM培养基、NZNM培养基或NZM培养基。技术效果1、该法采用简单的化学物质反应，使其筛选方法简单、可靠。2、与MUG荧光法、七叶苷平板法相比，采用pNPG显色成本低廉，耗费试剂少。3、该法充分利用酶标仪与96孔酶标板的高通量特性，使其筛选方法非常快速准确，大大节省了实验人员的时间。
具体实施例方式实施例1 从牛粪便微生物质粒宏基因组文库中快速筛选产β -葡萄糖苷酶的活性克隆将芒草喂养牛粪便微生物质粒宏基因组文库(含8，115个单克隆)样品使用96 孔板保存于_80°C低温冰箱。配制IOOmL的含Ampicillin(氨苄青霉素)(100mg/mL)LB 培养基并灭菌，随机从其文库中取部分样品370个单菌落进行复活，在96孔板中分别加入10(^1^含々11^(^11111(氨苄青霉素)(1001^/1^)的LB培养基与5 μ L保存菌液，37 °C， 120-150rpm培养10-1 ；复活菌液进行扩培，向96孔板每个微孔中分别加入93 μ L含 Ampicillin (100mg/mL) LB 培养基与待筛菌样品菌液 4 μ L，37°C，120_150rpm 培养 6_8h ；进行显示反应，在96孔板每个微孔中加入3 μ L IOmM pNPG,同时设置阴性对照与阳性对照。 阴性对照为93 μ L含Ampicillin (100mg/mL)LB培养基中转接4 μ L不产β -葡萄糖苷酶的菌液，阳性对照为93 μ L含Ampicillin (100mg/mL) LB培养基中转接4 μ L 200U/mL标准浓度的β -葡萄糖苷酶。反应液37°C，120-150rpm,反应60min ；加入100 μ L IM Na2CO3溶液终止反应5min。观察溶液颜色变化，以溶液显黄色为初步指标判断该重组子是否含编码 β -葡萄糖苷酶的功能基因。将反应液转到96孔酶标板上使用普通酶标仪于405nm处测定样品吸光值。同时，测定阴性对照与阳性对照在405nm处的吸光值。结果表明初筛获得 3株(M16、B5、L9)阳性克隆。对比施例1 用七叶苷平板法从牛粪便微生物质粒宏基因组文库中快速筛选产 β-葡萄糖苷酶的活性克隆配制40mL的含Ampicillin (氨苄青霉素)(100mg/mL) LB培养基并灭菌，随机从其文库中取部分样品370个单菌落进行复活，在96孔板中分别加入100 μ L含Ampicillin (氨苄青霉素)(100mg/mL)的LB培养基与5 μ L保存菌液，37°C，120-150rpm培养10_12h ；配制 3700mL七叶苷培养基灭菌后制370个培养平板；各取5 μ L复活菌液直接点在含有七叶苷培养基的平板上，于37°C倒置培养Μ-4 !后，对已接种的370个培养平板进行逐个观察。 根据菌落周围出现黑色水解圈初步判该菌株是否产葡萄糖苷酶。结果用七叶苷平板法筛选文库初筛得到1株(Μ16)阳性克隆。实施例2 白蚁肠道微生物中产β -葡萄糖苷酶功能菌株的快速筛选湖南省植物园朽木林中收集白蚁，在超净工作台中取白蚁肠道微生物并将其溶于无菌水中，充分震荡混勻，然后将其梯度稀释105，IO6倍，再分别吸取0. ImL的稀释液涂布到 LA平板上，置37°C培养12-24h ；分离得到243株细菌。配制300mL LB培养基并灭菌，将243株细菌分别接种于ImL LB液体培养基中， 37°C，180-200rpm培养ΙΟ-ia!进行复活；复活菌液进行扩培，即在96孔板中分别加入 93 μ L LB培养基与4μ L复活菌液，37°C，120_150rpm培养8_12h ；在96孔板中依次加入 3μ L IOmM反应底物pNPG，37°C，120-150rpm反应40min，同时设置阴性对照和阳性对照。阴性对照为93 μ L LB培养基中转接4 μ L不产β -葡萄糖苷酶的菌液，阳性对照为93 μ L LB 培养基中转接4μ L 200U/mL标准浓度的β -葡萄糖苷酶，37°C，120_150rpm，反应30min ； 加入100 μ L IM NaCO3溶液终止反应5min。观察溶液颜色变化，以溶液显黄色为指标判断菌落含编码β-葡萄糖苷酶功能基因。将反应液转到96孔酶标板上使用酶标仪于405nm 处测定样品吸光值。同时，测定阴性对照与阳性对照在405nm处的吸光值。以pNPG为显色底物，96孔板高通量筛选初筛得到89株产β -葡萄糖苷酶的菌株。对比施例2 用七叶苷平板法从白蚁肠道微生物中产β -葡萄糖苷酶功能菌株的筛选配制M30mL含七叶苷的LB培养基并灭菌，制作成243个平板，将243株细菌分别接种于平板上，于37°C倒置培养对-4他后，对已接种的对3个培养平板进行逐个观察，初筛选得到73株功能菌株。实施例3 从牛瘤胃微生物Cosmid文库中快速筛选产生β -葡萄糖苷酶的活性克隆芒草喂养牛瘤胃Cosmid宏基因组文库(约5，500个单克隆)样品使用96孔板保存于-80°C低温冰箱。随机取部分文库样品O70个)进行复活，在96孔板中分别加入10(^1^含々11^(^11111(氨苄青霉素)(1001^/1^)的LB培养基与5 μ L保存菌液，37°C， 120-150rpm培养10-1 ；复活菌液进行扩培，向96孔板每个微孔中分别加入93 μ L含 Ampicillin (100mg/mL) LB 培养基与待筛菌样品菌液 4 μ L，37°C，120_150rpm 培养 6_8h ；进行显示反应，在96孔板每个微孔中加入3 μ L IOmM pNPG,同时设置阴性对照与阳性对照。 阴性对照为93 μ L含Ampicillin (100mg/mL) LB培养基中转接4 μ L不产β -葡萄糖苷酶的菌液，阳性对照为93 μ L含Ampicillin (100mg/mL) LB培养基中转接4 μ L 200U/mL标准浓度的β-葡萄糖苷酶。反应液37°C，120-150rpm，反应90min ；加入IOOyL IM Na2CO3溶液终止反应5min。观察溶液颜色变化，以溶液显黄色为初步指标判断菌落含编码β-葡萄糖苷酶的功能基因。将反应液转到96孔酶标板上使用酶标仪于405nm处测定样品吸光值。以 PNPG为显示底物，使用96孔板高通量筛选文库初筛没有得到阳性克隆。对比施例3 用七叶苷平板法从牛瘤胃微生物Cosmid文库中筛选产生β -葡萄糖苷酶的活性克隆配制2700mL的含Ampicillin (氨苄青霉素)(100mg/mL) LB培养基并灭菌，配制 270个培养平板，将270株复活细菌分别接种于平板上，于37°C倒置培养后，对已接种的270个培养平板进行逐个观察，初筛没有得到有编码β -葡萄糖苷酶的阳性克隆。表1各实验所消耗的化学试剂表
实施例1对比施例1实施例2对比施例2实施例3对比施例3所耗培养基约 IOOmL约 37OOmL约 300mL约 M30mL约 IOOmL约 2700mLpNPG4mg4mg4mg七叶苷370g243g270gAmpicillin6g3g6g3gβ-葡萄糖苷酶2 OU2 OU2 OUNa2CO3 (碳酸钠)IgIgIg 附各种试剂配方LB培养基的配方为每IOOOmL蒸馏水中，以质量体积百分比浓度计，添加蛋白胨 1. O%，酵母提取物0. 5%, NaCl 1. 0%，121°C灭菌30min，室温放存。IOmM pNPG的配方为每ImL去离子水中，以质量体积百分比浓度计，添加3. Olmg PNPG，溶解后过滤除菌，-20°C保存。IM Na2CO3溶液的配方为每IOOmL蒸馏水中，以质量体积百分比浓度计，添加 10. 6g Na2CO3,121°C 灭菌 30min，室温放存。100mg/mL Ampicillin 配方为称取 Ig Ampicillin 置于 IOmL离心管中，加 5mL灭菌水，充分混合溶解后，定容至10mL，用0. 22 μ m滤器过滤除菌，小份分装后，_20°C保存。七叶苷培养基的配方为每IOOOmL蒸馏水中，以质量体积百分比浓度计，添加蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，NaCl 1. 0%，琼脂糖1. 0-1. 5%，七叶苷0. 10%，柠檬酸高铁铵0. 25%，121°C灭菌30min，室温放存。
权利要求
1.本发明提供一种基于96孔板高通量筛选β-葡萄糖苷酶产生菌的方法，步骤包括(1)将待筛选的单菌落在20-50°C，120-220rpm下液体培养基进行菌株复活；(2)复活菌液在20-50°C，120-220rpm下进行扩培4_18h；(3)取一96孔板添加一定体积菌种生长培养基，按比例转接复活菌液，20-50°C， 120-220rpm培养4-1 进行扩培；(4)向96孔板扩培菌液中加入一定体积的反应底物pNPG(同时设置阳性对照与阴性对照)，20-50 0C，120-220rpm,反应一定时间；(5)添加一定体积Na2CO3溶液终止反应；(6)室温下将反应液转接96孔酶标板在酶标仪上检测其吸光值，以阳性对照、阴性对照吸收值为参照，可据数值大小判断不同菌株所产的葡萄糖苷酶的酶活力，确认初筛结果。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤1所述的筛选菌株为细菌。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤2、3中所述待筛选菌株的复活与扩培具体步骤是向菌种生长培养基中转接接种液比例为0. 5% -10%。
4.根据权利要求3的方法，其中步骤4中显色是向扩培菌液中添加反应底物pNPG的比例一般为_5%，pNPG的终浓度范围一般为0. l-10mmol/L,与pNPG显色反应时间在 10-90min。
全文摘要
本发明提供一种基于96孔板高通量筛选β-葡萄糖苷酶产生菌的方法，尤其将pNPG用于β-葡萄糖苷酶的高通量筛选。具体包括(1)菌株复活；(2)复活菌液扩培；(3)显色反应；(4)吸光值测定等步骤。本发明能够以纯培养分离技术与构建基因文库技术从不同样品中挖掘产β-葡萄糖苷酶的微生物菌株。本发明使用pNPG用于β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选，与目前文献所报道用于β-葡萄糖苷酶筛选的七叶苷平板法与荧光法相比较，具有方便、快速、结果准确、廉价等优点。
文档编号C12Q1/34GK102392072SQ20111040561
公开日2012年3月28日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者刘虎虎, 卢向阳, 田云, 赵飞, 辛盛 申请人:湖南农业大学