专利名称：拜氏梭菌菌株及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物筛选和培养及其应用，特别是拜氏梭菌应用于发酵生产丁醇的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
丁醇作为优良的有机化工原料，主要应用于溶剂、抗氧剂、增塑剂、合成药物精细化工等领域。随着生物质制能源的多元化发展，由于丁醇具有能量密度高，亲水性低，蒸汽压低，辛烷值高等特点，被认为是最有发展潜力的新型液体燃料之一。石油资源的枯竭及原油价格的不断上涨，世界各国对能源安全和资源安全的忧虑日增，所以微生物发酵生产丁醇倍受人们的青睐。
生物丁醇的发酵曾经是世界第二大发酵工业，仅次于乙醇发酵，其主要原料是玉米、小麦和木薯等，丁醇产量约12 g/L。发酵生产丁醇的微生物主要有Clostridium acetobutylicum、Clostridium bei jerinckii、Clostridiumsaccharoperbutylacetonic um 取 Clostridiumsaccharobutylicum 4 矛中(Keis S， Shaheen R， Jones D T. Emended descriptions of Clostridium ace tobu tyli cum and Clostridium bei jerinckii y and descriptions of Clostridium saccharoperbutylacetonicum sp nov and Clostridium saccharobu tyli cum sp nov. Microbiol, 2001，(51): 2095-2103)。国内生产生物丁醇主要以玉米为原料，利用丙酮丁醇梭菌acetobutyIicum')发酵生产丁醇，如华北制药华盈有限公司菌种HY1710(刘力强，杨丽萍，李立强等.生物丁醇燃料产业化制造中的问题及发展趋势.生物产业技术.2008，05 (9): 36-44);中国科学院上海植物生理研究所选育的67(96* tridium ace tobu tylicumEk2Q 18 菌株(中国发明专利CN 1143677A);中国科学院微生物研究所选育的Clostridium acetobutylicum^-l CGMCC No. 2287 菌株(中国发明专利CN 101250496 B)。而国外使用的菌种主要是拜氏梭菌，利用糖蜜发酵生产丁醇，如Armous B A等对拜氏梭菌 {Clostridium bei jerinckii NCIMB8052)进行亚硝基胍诱变，筛选获得优良发酵性能的拜{Clostridium bei jerinckii BAlOl)(Annous B A，Blaschek H P. Isolation and Characterization of Clostridium acetobutylicum Mutants with Enhanced Amylolytic Activity. Applied and environmental microbiology, 1991，57(9): 2544-2548);新西兰David Jones教授选育的拜氏梭菌能同步糖化发酵木质纤维水解液生产丁醇(Qureshi N，Saha B C，Hectora R E, et a I. Butanol production from wheat straw by simultaneous saccharification and fermentation using Cl ostri di um bei jennckii Part I batch fermentation. Biomass and Bioenergy, 2008，32(2): 168-175)。考虑到我国的基本情况以及粮食安全问题，生物丁醇的发展必须遵循“不与人争粮、不与粮争地”的原则。实现原料的多元化与可持续发展非粮生物质为原料生产丁醇。
目前制约丁醇发酵生产的主要因素有原料成本高、转化率低、产量低和生产强度低。为了解决上述问题，各国科研工作者主要围绕菌种的选育、发酵底物、基因工程改造、发酵工艺的优化和产物分离等方面进行研究。随着基因组学和蛋白质组学的快速发展，丙酮丁醇梭菌(CViostrit/iwffi ace tobu tyli cy ATCC824 )菌株的全基因组测序已于 2001 年完成(Nulling J, Breton G, Omelchenko M V, et al. Genomesequence and comparative analysis of the solvent producing bacterium Cl ostri di um ace tobu tyli cum. Bacteriol, 2001, 183(6): 4823-4838),遗传操作系统已经成功构建； 拜氏梭菌bei jerinckii NCIMB8052)菌株的全基因组测序已于2007年完成,分子遗传操作系统正在构建(Copeland A, Lucas S，Lapidus A, et al. Clostridium bei jerinckii NCIMB8052, complete genome, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。国内主要研究丙酮丁醇梭菌的改造，对拜氏梭菌的研究较少。很多研究表明拜氏梭菌的原料谱和适宜P H范围更广，在丁醇发酵产业上具有更大的应用潜力。
糖蜜是食糖生产的副产品。我国每年糖蜜产量达400多万吨，以廉价的糖蜜为原料发酵生产丁醇可降低生物丁醇的成本，具有市场竞争力。本发明公开了一株野生型拜氏梭菌丰富了丁醇生产菌株的资源，其主要优势在于该菌株以糖蜜为原料发酵生产丁醇，丁醇产量最高可达13. 11 g/L，丁醇比例约78. 1%。发明内容
本发明的目的是提供一株拜氏梭菌菌株及其筛选方法和利用。
本发明所提供的拜氏梭菌是在广西南宁采样分离筛选得到的，命名为gxas. 28 CCTCC M 2011454。
以上所述的拜氏梭菌gxas. 28 CCTCC M 2011454分离筛选方法如下 a)采样从广西南宁采集样品。
b)富集每个样品各称取I g置于以糖蜜为主要碳源的培养基中，80°C热激10 min，冷却后37°C静止培养72时间范围h，气相色谱仪检测发酵产物。
C)初筛将检测有丁醇产生的发酵液稀释涂布含质量百分含量为I. 6% 丁醇的TYA 平板培养基(TYA培养基葡萄糖40 g，牛肉膏2 g，酵母粉2 g，蛋白胨6 g，醋酸铵3 g,磷酸二氢钾0.5 g，七水合硫酸镁0.2 g，七水合硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL, PH 6.5,121 1高压灭菌20 min。倒平板前添加16 g的正丁醇)置于37°C厌氧培养箱中培养 24 ho
d)复筛从TYA平板上挑选单菌落于糖蜜发酵培养基中，37°C静止发酵60h，筛选丁醇产量较高的菌株进行优化。
e)鉴定经16S rDNA鉴定本菌株为拜氏梭菌。
本发明的拜氏梭菌gxas. 28 CCTCC M 2011454可用于发酵生产丁醇，所述发酵的方法具体是将拜氏梭菌gxas. 28 CCTCC M 2011454接种到发酵培养基中，于37°C，静止发酵60 h，得到丁醇、丙酮和乙醇溶液。
所述发酵培养基的主要碳源为糖蜜的发酵液；所述糖蜜发酵液中糖蜜的质量百分含量为8% 12%。
所述发酵培养基中还含有含有硫酸铵的质量百分含量为0. 1% 0. 3%，最适量为0.27% ;酵母粉的质量百分含量为0. 5% I. 5%，最适量为I. 2% ;碳酸钙的质量百分含量为0.1% 0. 4%，最适量为0. 34% ;过磷酸钙的质量百分含量为0. 02% 0. 1%，最适量为0. 06%。
所述接种是将生长至对数期的拜氏梭菌gxas. 28按照体积百分含量为10%的接种量接种到发酵培养基中。
本发明的拜氏梭菌gxas. 28以廉价的糖蜜为原料发酵生产丁醇，丁醇产量最高可达13. 11 g/L，丁醇比例达78. 1%，本发明的推广应用可以降低生物丁醇的成本。
保藏信息说明拜氏梭菌gxas. 28，目前保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2011年12月9日，其保藏登记号为CCTCC M 2011454。
具体实施方式
下列实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例I :拜氏梭菌(CViostrit/iwffi bei jerinckii ) gxas. 28的分离、筛选与鉴定第一步采样从广西壮族自治区市南宁采集样品。
第二步富集富集培养基组分糖蜜100 g(糖蜜含糖量约50%，由广西丰浩糖业有限公司提供)，酵母粉5 g,碳酸I丐3. 0 g,过磷酸I丐0. 7 g,硫酸铵3. 0 g,用蒸懼水定容到1000 mL, pH 6. 2 6.5。将以上成份混合均匀，分装于30 mL试管中，胶塞密封，115°C高压灭菌20 min。
每个样品各称取I g分别置于装有糖蜜发酵培养基的试管中，80°C热激10 min杀死不耐热的细菌和营养体细胞，冷却后置于37°C培养箱静止培养72 h,挑选培养过程中有汽泡产生的发酵醪进行气相色谱仪检测。
第三步初筛丁醇平板培养基葡萄糖40 g，牛肉膏2 g，酵母粉2 g，蛋白胨6 g，醋酸铵3 g,磷酸二氢钾0.5 g，七水合硫酸镁0.2 g，七水合硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL, pH 6.5,121 "€高压灭菌20 min。倒平板前添加16 g的正丁醇。
将检测有丁醇产生的发酵液稀释涂布含质量百分含量为I. 6% 丁醇的TYA平板培养基，置于37°C厌氧培养箱中培养24 ho
第四步复筛糖蜜发酵培养基糖蜜100 g，酵母粉5 g，碳酸钙3.0 g，过磷酸钙0.7 g，硫酸铵3.0 g，用蒸懼水定容到1000 mL, pH 6. 2 6. 5。将以上成份混合均勻，分装于30 mL试管中， 胶塞密封，115°C高压灭菌20 min。
从丁醇培养基平板上挑选单菌落于糖蜜发酵培养基中，37°C静止发酵60 h，对发酵醪进行气相色谱检测分析，总共筛选获得产丁醇菌株500余株，通过比较各菌株的丁醇和总容剂产量，最后选定一株利用糖蜜生产丁醇产量较高的菌株命名为gxas. 28。
第五步鉴定生理生化特征检测项目结果检测项目结果革兰氏染色+甘油-细胞形状杆状麦芽糖+内生孢子+L-乳酸+权利要求
1.拜氏梭菌菌株，其分类命名为拜氏梭菌(C/iostrit/itt beijerinckii)gxas. 28,该菌株保存于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号=CCTCC M 2011454。
2.权利要求I所述的拜氏梭菌菌株的筛选方法，其特征在于将采集的样品通过富集培养，气相色谱仪检测发酵液，经检测有丁醇产生的发酵液稀释涂平板获得单菌落，挑单菌落用试管发酵筛选丁醇产量较高的菌株，具体筛选步骤如下a)采样采集样品70余份；b)富集每个样品各称取Ig置于以糖蜜为主要碳源的培养基中，80°C热激10 min，冷却后37°C静止培养72 h，气相色谱仪检测发酵产物；c)初筛将检测有丁醇产生的发酵液稀释涂布含质量百分含量为I.6% 丁醇的TYA平板培养基，置于37°C厌氧培养箱中培养24 h ；d)复筛从TYA平板上挑选单菌落于糖蜜发酵培养基中，37°C静止发酵60h，筛选丁醇产量较高的菌株进行优化。
3.权利要求I所述的拜氏梭菌gxas.28在发酵生产丁醇中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵丁醇的方法是将拜氏梭菌 gxas. 28接种到发酵培养基中，于37°C静止发酵60 h，得到丁醇、丙酮和乙醇溶液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述接种是将生长至对数期的拜氏梭菌 gxas. 28按照体积百分含量为10%的接种量接种到发酵培养基中。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基是以糖蜜为主要碳源的糖蜜发酵培养基，糖蜜发酵培养基中糖蜜的质量百分含量为8% 12%。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述糖蜜发酵培养基中还含有硫酸铵的质量百分含量为0. 1% 0. 3%，最适量为0. 27% ;酵母粉的质量百分含量为0. 5% I. 5%，最适量为I. 2% ;碳酸I丐的质量百分含量为0. 1% 0. 4%,最适量为0. 34% ;过磷酸I丐的质量百分含量为0. 02% 0. 1%，最适量为0. 06%o
全文摘要
本发明公开了一株高产丁醇的野生型拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)，采集样品后，经过富集、初筛、分离和复筛，而获得此菌株。菌株经鉴定结果为拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)，其分类命名为拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)gxas.28，其保藏登记号为CCTCCM2011454。本发明利用拜氏梭菌以糖蜜为原料发酵生产丁醇，丁醇产量达9.42～13.11g/L，丁醇占总溶剂的比例高达70%～85%。
文档编号C12N1/02GK102533612SQ201210034489
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者左文朴, 庞浩, 裴建新, 陈东, 黄志民, 黄日波, 黎贞崇 申请人:广西科学院