抑制鳞翅目靶多核苷酸的组合物和方法

专利名称：：抑制鳞翅目靶多核苷酸的组合物和方法抑制鳞翅目靶多核苷酸的组合物和方法发明领域本发明通常涉及控制害虫的分子生物学方法和基因沉默方法。发明背景虫害是农业生产的重要问题。它们破坏数百万英亩的主要农作物，如玉米、大豆、豌豆、棉花。每年仅在美国，这些害虫造成的农作物损害超过1000亿美元。在持续的季节性斗争中，农作业者必须使用数十亿加仑合成的杀虫剂来抵御这些害虫。过去所用的其他方法通过微生物或者在转基因植物中表达的来自微生物的基因送递杀虫活性。例如，已知芽孢杆菌属(Bacillus)的某些微生物种类就对范围较宽的虫害具有杀虫活性，包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等。事实上，微生物杀虫剂，特别是从芽孢杆菌属菌株所获得的杀虫剂，作为化学害虫控制的替代品，在农业生产中发挥了重要作用。通过对农作物进行基因工程产生来自芽孢杆菌属的杀虫蛋白，农业科研人员已经研究出害虫抗性增强的农作物。例如，经基因工程产生Cry毒素的玉米和棉花植物(Aronson(2002)CellMo1.LifeSc1.59(3):417-425;Schnepfetal.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(3):775-806)已经广泛应用于美国的农业生产中，并且为农作业者提供了传统害虫控制方法的可选方案。但是，这些Bt杀虫蛋白只能保护植物免遭相对狭窄范围害虫的危害。而且，这些杀虫活性模式提供了不同水平的特异性，且在有些情况中，会对环境造成严重影响。因此，现在急需控制害虫的替代方法。发明概述提供了使用沉默元件的方法和组合物，当被害虫例如鳞翅目的害虫摄食后，该沉默元件能降低害虫内靶序列的表达。在具体实施方案中，降低靶序列的表达可以控制虫害，因此，该方法和组合物能限制对植物的损害。本发明提供了编码来自本文其他地方所公开的具体蛋白质家族多肽的各种靶多核苷酸和SEQIDN0S:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所示的各种靶多核苷酸或其活性变体及片段，其中降低靶害虫内一种或多种序列的表达可以控制害虫(具有杀虫活性)。还提供了沉默元件，当被害虫摄食后，其降低一种或多种靶多核苷酸的表达水平。在具体的实施方案中，沉默元件包含SEQIDN0S:1-50中任一序列的至少15、20或22个连续核苷酸。在具体实施方案中，害虫为草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)。本发明亦提供包含沉默元件或其活性变体及片段的植物、植物部分(Plantpart)、细菌及其他宿主细胞。在另一实施方案中，提供了控制害虫例如鳞翅目的害虫的方法。该方法包括喂食害虫包含沉默元件的组合物，其中当被害虫摄食后，该沉默元件降低害虫内靶序列的水平，从而控制害虫。还提供了保护植物免受害虫危害的方法。此类方法包括将本发明的沉默元件弓I入植物或植物部分。当表达沉默元件的植物被害虫摄食后，靶序列的水平得以降低，进而害虫受到控制。发明的详细描述下文将对本发明进行更详细的说明，其中，展示了本发明的某些但不是所有的实施方案。实际上，这些发明可以以不同的形式实施，并不应解释为限于本文所示的实施方案；确切地说，为使本文公开满足应用的合法要求，提供了这些实施方案。在本说明书中，相同的符号表不相同的兀件。根据以上描述所提供的教导，这些发明所属领域的技术人员会会想到本文所提出的本发明的许多修饰和其他实施方案。因此，可以理解的是，本发明并不限于所公开的具体实施方案，规定修饰和其他实施方案包括于所附权利要求的范围内。尽管本文使用了具体术语，但是它们仅采用通用且描述的意义，并非出于限制目的。1.概述提供了使用沉默元件的方法和组合物，当被害虫例如鳞翅目害虫摄食后，该沉默元件能降低害虫内靶序列的表达。在具体实施方案中，降低靶序列的表达可以控制害虫，由此，该方法和组合物能限制对植物或植物部分的损害。本发明提供了编码多种蛋白类别的多肽的靶多核苷酸，例如保幼激素多肽、液泡多肽、钙粘着蛋白多肽、表皮多肽、翻译起始因子、SARl多肽、延伸因子、磷酸寡糖(phosphoroligosaccharide)、肌球蛋白多肽、钾通道氨基酸转运蛋白、内向整流钾通道(potassiuminwardlyrectifier)多肽、氨基酸转运蛋白、微管蛋白多肽、泛素多肽和小核核糖核蛋白。在其他实施方案中，靶多核苷酸列于SEQIDN0S:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50中，或为其活性变体及片段。提供了根据这些靶多核苷酸设计的沉默元件，当被害虫摄食后，该沉默元件降低一种或多种靶序列的表达，进而控制害虫(即具有杀虫剂活性)。参阅，例如SEQIDN0S:51-465。文中所用“控制害虫(controllingapest)”或“控制害虫(controlsapest)，，意指对害虫的任何作用，所述作用限制害虫引起的损害。控制害虫包括但不限于杀死害虫，抑制害虫发育，以害虫对植物提供较少损害的方式改变害虫的繁殖力或生长，减少所产生的后代的数量，产生的健康害虫更少，产生更易受捕食者攻击的害虫，或者阻止害虫啃食植物。“抗病性”是指植物避免植物-病原体相互作用的结果的疾病症状。也就是说，防止病原体引起植物疾病及其相关疾病症状，或者可选地，使病原体所引起的疾病症状最小化或减少。降低害虫内靶多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平，导致抑制、控制和/或杀死入侵的病原生物。降低害虫靶序列的表达水平会使病原体激发所导致的疾病症状降低至少约2%到至少约6%、至少约5%到约50%、至少约10%到约60%、至少约30%到约70%、至少约40%到约80%或至少约50%到约90%或更多。因此，本发明的方法可以应用于保护植物免受疾病特别是由鳞翅目害虫引起的疾病的危害。测量害虫控制的测定在本
技术领域：
通常是公知的，如同对病原体感染后植物的抗病性进行定量的方法。参阅，例如，美国专利第5，614，395号，在此通过引用将其并入。此类技术包括随着时间测量损伤的平均直径、病原体生物量和腐烂植物组织的总百分比。参阅，例如，Thommaetal.(1998)PlantBiology95:15107-15111,在此通过引用并入。还请参阅下文的实施例。本发明涉及保护植物免受害虫如鳞翅目害虫的危害或者在植物中诱导植物害虫如鳞翅目的植物害虫抗性的组合物及方法。鳞翅目昆虫的毛虫(caterpillars)及相关形态包括一群重要的植食性农业害虫，特别是处于幼虫生长阶段时。鳞翅目幼虫的进食方法通常包括咀嚼植物或植物部分。本文所用术语“鳞翅目”用于指鳞翅目的任何成员。在具体实施方案中，本发明的组合物和方法控制鳞翅类幼虫(即毛虫)。因此，本发明的组合物和方法还用于保护植物防御任何鳞翅类，包括例如菜粉蝶(Pierisrapae)、棉红铃虫(Pectinophoragossypiella)、桃透翅蛾(Synanthedonexitiosa)、Melittiacucurbitae、苹果蠹蛾(Cydiapomonella)、梨小食心虫(Grapholitamolesta)、玉米螟(Ostrinianubilalis)、印度谷螟(Plodiainterpunctella)、大腊螟(Galleriamellonella)、烟草天蛾(Manducasexta)、番爺天蛾(Manducaquinquemaculata)、舞毒蛾(Lymantriadispar)、黄毒蛾(Euproctischrysorrhoea)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)、小地老虎(Agrotisipsilon)、小菜蛾(Plutellaxylostella)>黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、Psuedoplusiaincludens、夜小卷蛾(Epinotiaaporema)、玉米铃夜蛾(Helicoverpazea)、烟芽实夜蛾(Heliothisvirescens)、棉铃实夜蛾(Heliothisarmigera)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、三化螟(Scirpophagaincertulus)、姓莖夜蛾(Sesamiaspp.)、Buseolafusca、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)、二化螟(Chilosuppressalis)或者棉贪夜蛾(Spodopteralittoralis)。在具体实施方案中，方法控制草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)。I1.靶序列本文所用“靶序列”或“靶多核苷酸”包含期望减少表达水平的害虫内的任何序列。在具体实施方案中，降低害虫内靶序列的表达控制害虫。例如，靶序列可以是生长和发育所必需的。尽管靶序列可以在害虫的任何组织中表达，但在本发明的具体实施方案中，在害虫内靶向抑制作用的序列在害虫肠组织细胞、害虫中肠细胞和沿着肠腔或中肠排列的细胞中表达。这类靶序列与肠细胞的代谢、生长和分化有关。在本发明的一个实施方案中，祀序列包含属于一个或多个酶类别的多肽，如保幼激素多肽、液泡多肽、钙粘着蛋白多肽、表皮多肽、翻译起始因子、SARl多肽、延伸因子、磷酸寡糖、肌球蛋白多肽、钾通道氨基酸转运蛋白、内向整流钾通道多肽、氨基酸转运蛋白、微管蛋白多肽、泛素多肽和小核核糖核蛋白。本发明靶序列的非限制性实例包括SEQIDN0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所示的多核苷酸。如本文中其它地方所示例的，降低鳞翅目内这些靶序列或所述酶类别成员的表达水平，控制害虫。II1.沉默元件文中所述的“沉默元件”是指多核苷酸，当被害虫摄食后，其能降低或者消除靶多核苷酸或者由其编码的多肽的表达水平。所用的沉默元件通过影响靶RNA转录物或者可选地影响翻译，进而影响所编码的多肽的表达，而减低或消除靶序列的表达。测定能降低或消除目的序列水平的功能性沉默元件的方法，公开于本文的其他地方。本发明方法所用的单个多核苷酸可以包含相同或不同靶多核苷酸的一个或多个沉默元件。在具体实施方案中，靶序列不是植物内源基因。在其他实施方案中，尽管沉默元件控制害虫，但是优选，沉默元件对正常的植物或植物部分没有影响。如下文进一步详细讨论的，沉默元件可以包括有义抑制元件、反义抑制元件、双链RNA、miRNA或发夹抑制元件，但并不局限于此。可用于减低这些靶鳞翅目序列表达的沉默元件的非限制性实例包含以下所示序列或其生物活性变体或片段的有义或反义序列的片段和变体，或由以下所示序列或其生物活性变体或片段的有义或反义序列组成SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267、270、273、276、279、282、285、288、291、294、297、300、303、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、342、345、348、351、354、357、360、363、366、369、372、375、378、381、384、387、390、393、396、399、402、405、408、411、415、418、421、424、427、430、433、436、439、442、457、460和/或463。在具体实施方案中，沉默元件包含SEQIDN0s:51-465中任一所示的至少一个序列，或由其组成。在其他实施方案中，沉默元件在3’末端可以包含至少一个胸腺嘧啶残基。这有助于稳定。因此，所述的沉默元件在3’末端可以具有至少1、2、3、4、5·、6、7、8、9、10或者更多个胸腺嘧啶残基。在其他实施方案中，所述的沉默元件包含SEQIDNO:52和53、55和56、58和59、61和62,64和65,67和68,70和71,73和74,76和77,79和80,82和83,85和86,88和89、91和92,94和95,97和98,100和101,103和104,106和107,109和110,112和113,115和116,118和119,121和122,124和125,127和128,130和131,133和134,136和137、139和140、142和143、145和146、148和149、151和152、154和155、157和158、160和161、163和164、166和167、169和170、172和173、175和176、178和179、181和182、184和185、187和188、190和191、193和194、196和197、199和200,202和203,205和206、208和209,211和212,214和215,217和218,220和221、223和224,226和227,229和230,232和233,235和236,238和239,241和242,244和245,247和248,250和251,253和254,256和257,259和260,262和263,265和266,268和269,271和272,274和275、277和278,280和281,283和284,286和287,289和290,292和293,295和296,298和299,301和302,304和305,307和308,310和311,313和314,316和317,139和320,322和323,325和326,328和329,331和332,334和335,337和338,340和341,343和344、346和347,349和350,352和353,355和356,358和359,361和362,364和365,367和368,370和371,373和374,376和377,379和380,382和383,385和386,388和389,391和392,394和395,397和398,400和401,403和404,406和407,409和410,412和413,416和417,419和420,422和423,425和426,428和429,431和432,434和435,437和438、440和441、443和444、458和459、461和462，和/或464和465。“降低(reduces)”或“降低(reducing)”多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平意图表示，靶序列的多核苷酸或多肽的水平，在统计上低于未暴露于(即未摄食)沉默元件的适当的对照害虫中相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在本发明的具体实施方案中，根据本发明，降低害虫内靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平，导致少于95%、少于90%、少于80%、少于70%、少于60%、少于50%、少于40%、少于30%、少于20%、少于10%或者少于5%的适当对照害虫内相同靶序列的多核苷酸水平或其编码的多肽水平。测定RNA转录物的水平、所编码的多肽的水平或者多核苷酸和多肽活性的方法，在本文其它地方做了讨论。1.有义抑制元件如本所用“有义抑制元件”包含经设计表达在“有意”方向上对应于至少部分靶信使RNA的RNA分子的多核苷酸。包含有义抑制元件的RNA分子的表达可以降低或者消除靶多核苷酸或其编码的多肽的水平。包含有义抑制元件的多核苷酸可以对应于靶多核苷酸的全部或部分序列、靶多核苷酸的全部或部分5’和/或3’非翻译区，靶多核苷酸的全部或部分编码序列或者靶多核苷酸的全部或部分编码序列和未编码区两者。通常，有义抑制元件与靶聚核苷酸具有基本的序列同一性，通常大于约65%的同一性、大于约85%的同一性，约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。参阅美国专利第5，283，184和5，034，323号，在此通过引用并入。有义抑制元件可以是任何长度，只要其允许抑制靶向序列即可。有义抑制元件可以为例如15、20、22、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、900或更长。i1.反义抑制元件本文所用“反义抑制元件”包含经设计表达与全部或部分靶信使RNA互补的RNA分子的多核苷酸。反义RNA抑制元件的表达降低或者消除靶多核苷酸的水平。反义抑制所用的多核苷酸对应于编码靶多肽的序列的全部或部分互补物，靶多核苷酸5’和/或3’非翻译区的全部或部分互补物，靶多核苷酸编码序列的全部或部分互补物，或者靶多核苷酸编码序列和非翻译区两者的全部或部分互补物。此外，反义抑制元件可以与靶多核苷酸完全互补(与靶多核苷酸的互补物100%相同)或者部分互补(与靶多核苷酸互补物的同一性性小于100%)。在具体实施方案中，反向抑制元件包含与靶多核苷酸的至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列互补性。反义抑制可以用于抑制同一植物中多种蛋白的表达。参阅例如美国专利第5，942，657号。此外，反义抑制元件可以与靶多核苷酸的一部分互补。一般来说，可以使用至少15、20、22、25、50、100、200、300、400、450个核苷酸甚至更多的序列。使用反义抑制来抑制植物内源基因表达的方法，描述于例如Liuetal(2002)PlantPhysiol.129:1732-1743和美国专利第5，759，829号和第5，942，657号中，在此将其中的每一专利都通过弓丨用并入。ii1.双链RNA抑制元件“双链RNA沉默元件”或“dsRNA”包含至少一个在被害虫摄食前或摄食后能形成dsRNA的转录物。因此，“dsRNA沉默元件”包括dsRNA、能形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸，或者多于一个能形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸。“双链RNA”或“dsRNA”指由单个自身互补的RNA分子形成的多核糖核苷酸结构或由两种不同RNA链的表达形成的多核糖核苷酸结构。本发明的组合物与方法所用的dsRNA分子可以通过例如以序列特异性的方式介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默，介导靶序列表达的降低。在本发明中，dsRNA能降低或消除害虫内靶多核苷酸或由其编码的多肽的水平或表达。dsRNA通过以下方式降低或消除靶序列的表达水平通过影响靶RNA转录物的水平，通过影响翻译进而影响所编码的多肽的水平，或者通过在转录前水平影响表达(即通过调节染色质结构、甲基化模式等改变基因表达)。参阅，例如，Verdeletal.(2004)Science303:672-676；Pal-Bhadraetal.(2004)Science303:669-672;Allshire(2002)Science297:1818-1819；Volpeetal.(2002)Science297:1833-1837;Jenuwein(2002)Science297:2215-2218;和Halletal.(2002)Science297:2232-2237。测定能降低或者消除目的序列水平的功能性RNA的方法，在本文其其他地方作了描述。因此，本文所用的“dsRNA”意图包括用于描述能介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子的其他术语，包括，例如短的干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、小RNA(miRNA)、发夹RNA(hairpinRNA)、短发夹RNA(shRNA)、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。在具体实施方案中，dsRNA的双链体或双链区的至少一条链与靶多核苷酸享有足够的序列同一性或者序列互补性，以便允许dsRNA降低靶序列的表达水平。如本文所用，与靶多核苷酸互补的链为“反义链”，与靶多核苷酸同源的链为“有义链”。在一个实施方案中，dsRNA包含发夹RNA。发夹RNA包含的RNA分子能折叠回自身形成双链结构。可使用多重结构作为发夹元件。在具体实施方案中，dsRNA抑制元件包含发夹元件，该发夹元件按下述顺序包含第一节段(segment)、第二节段和第三节段,其中第一和第三节段共享充足的互补性，以便允许转录的RNA形成双链茎环结构。发夹的“第二节段”包含“环”或“环状区(loopregion)”。这些术语在本文中以同义词使用，泛指赋予足够柔性从而允许自身配对发生于多核苷酸的互补区域(即形成了发夹的茎的第一节段和第三节段)之间的任何核酸序列。例如，在某些实施方案中，环状区可以基本上是单链的，并作为发夹茎环中自身互补区域间的间隔区；在某些实施方案中，环状区可以包含随机序列或反义序列，因此不与靶多核苷酸共享序列同一性；在其他实施方案中，环状区包含与靶多核苷酸共享同一性的有义或反义RNA序列及其片段。参阅，例如，国际专利公开WO02/00904，在此通过引用并入。在具体实施方案中，可以优化环状区，以便仍然提供足够的分子内柔性从而允许形成碱基配对的茎状区(stemregion)同时，尽可能的短。因此，环状序列通常小于1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、25、20、15、10个核苷酸或更短。发夹RNA分子的“第一节段”和“第三节段”包含发夹结构的碱基配对的茎状区。第一节段和第三节段彼此是反向重复并共享充足的互补性，从而允许形成碱基配对的茎状区。在具体实施方案中，第一节段和第三节段彼此完全互补。可选地，第一节段和第三节段可以彼此部分互补，只要它们能彼此杂交形成碱基配对的茎状区。第一节段和第三节段间互补性的量可以计算为全部节段的百分比。因此，发夹RNA的第一节段和第三节段一般共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、高达并包括100%的互补性。第一节段和/或第三节段的长度为至少约1000、500、400、300、200、100、50、40、30、25、22、20、15或10个核苷酸。在具体实施方案中，第一节段和/或第三节段为约10-100个核苷酸、约10-约75个核苷酸、约10-约50个核苷酸、约10-约40个核苷酸、约10_约35个核苷酸、约10-约30个核苷酸、约10-约25个核苷酸、约10-约20个核苷酸。在其他实施方案中，第一节段和/或第三节段的长度包含至少10-20个核苷酸、20-35个核苷酸、30-45个核苷酸、40-50个核苷酸、50-100个核苷酸或者100-300个核苷酸。参阅例如国际公开WO0200904。在具体实施方案中，第一节段和第三节段包含与第一节段具有至少85%互补性的至少20个核苷酸。仍然在其他实施方案中，形成发夹的茎环结构的第一节段和第三节段包含具有未配对的核苷酸残基的3’或者5’的突出端区域。在具体实施方案中，第一、第二和/或第三节段所用的序列包含，经设计与目的靶多核苷酸序列具有充足的序列同一性从而能降低靶多核苷酸表达水平的的结构域。因此抑制性RNA转录物的特异性，通常由沉默元件的这些结构域赋予。因此，在本发明的一些实施方案中，沉默元件的第一、第二和/或第三节段包含具有至少10、至少15、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少500、至少1000或多于1000个核苷酸的结构域，所述核苷酸与靶多核苷酸共享充足的序列同一性，以便当合适的细胞中表达时，允许降低靶多核苷酸的表达水平。在其他实施方案中，结构域为约15-50个核苷酸、约20-35个核苷酸、约25-50个核苷酸、约20-75个核苷酸、约40-90个核苷酸、约15-100个核苷酸。在具体实施方案中，第一、第二和/或第三节段中的结构域与靶多核苷酸具有100%的序列同一性。在其他实施方案中，与靶多核苷酸具有同源性的第一、第二和/或第三节段的结构域，与靶多核苷酸的区域具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。第一、第二和/或第三节段的结构域与靶多核苷酸的序列同一性，仅需要足以降低目的靶多核苷酸的表达。参阅，例如，ChuangandMeyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:4985-4990;Stoutjesdijketal.(2002)PlantPhysiol.129:1723-1731;WaterhouseandHelliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38;Pandolfmietal.BMCBiotechnology3:7;和美国专利公开20030175965;在此将上述每一篇文献通过引用并入。hpRNA构建体体内沉默基因表达的效率的瞬时测定，描述于Panstrugaetal.(2003)Mol.Biol.R印·30:135-140中，在此通过引用并入。第一、第二和/或第三节段与靶多核苷酸序列间共享的互补性的量，或第一节段与第三节段(即发夹结构的茎)间共享的互补性的量，可以变化，这取决于待控制基因表达的生物。有些生物或细胞类型需要精确配对或100%的同一性，而其它生物或细胞类型则容忍一些错配。在某些细胞中，例如，导向序列中单个核苷酸错配废除了抑制基因表达的能力。在这些细胞中，本发明的抑制盒(suppressioncassette)可以用来祀向突变基因的抑制，例如，转录物包含点突变的癌基因，因此利用本发明的方法和组合物可以特异性地靶向突变基因，而无需改变剩余野生型等位基因的表达。靶多核苷酸序列的任何区域都可以用于设计沉默元件的结构域，其共享充分的序列同一性，以便允许发夹转录物表达，降低靶多核苷酸的水平。例如，结构域经设计，可以与靶多核苷酸的5’非翻译区、靶多核苷酸的3’非翻译区、靶多核苷酸的外显子区、靶多核苷酸的内含子区和其任何组合共享序列同一性。在具体实施方案中，沉默元件的结构域与来自革巴序列的核苷酸约1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、550-600、600-650、650-700、750-800、850-900、950-1000、1000-1050、1050-1100、I100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000中的至少约15、20、22、25或30个连续核苷酸具有充足的同源性。在优化发夹所用的siRNA序列某些情况中，合成的寡聚脱氧核苷酸/核糖核酸酶H法可用来确定祀mRNA上处于易受RNA沉默的构象的位点。参阅例如，Vickersetal.(2003)J.Biol.Chem278:7108-7118和Yangetal.(2002)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA99:9442-9447，在此通过引用并入。这些研究表明，核糖核酸酶-H敏感位点与促进高效的siRNA指导的mRNA降解的位点间存在显著的相关性。发夹沉默元件也可以如此设计，即，使有义序列或反义序列不对应于靶多核苷酸。在这个实施方案中，有义和反义序列位于环状序列的侧翼，该环状序列包含对应于全部或部分靶多核苷酸的核苷酸序列。因此，是环状区决定了RNA干扰的特异性。参阅例如，WO02/00904，在此通过弓I用并入。在具体实施方案中，包含发夹结构的沉默元件包含选自以下的序列SEQIDNO:52和53,55和56,58和59,61和62,64和65,67和68,70和71,73和74,76和77,79和80,82和83,85和86、88和89、91和92,94和95,97和98、100和101、103和104、106和107、109和110、112和113、115和116、118和119、121和122、124和125、127和128、130和131、133和134、136和137、139和140、142和143、145和146、148和149、151和152、154和155、157和158、160和161、163和164、166和167、169和170、172和173、175和176、178和179、181和182、184和185、187和188、190和191、193和194、196和197、199和200,202和203,205和206,208和209,211和212,214和215,217和218,220和221,223和224,226和227,229和230,232和233,235和236,238和239,241和242,244和245、247和248,250和251,253和254,256和257,259和260,262和263,265和266,268和269,271和272,274和275,277和278,280和281,283和284,286和287,289和290,292和293,295和296,298和299,301和302,304和305,307和308,310和311,313和314、316和317、139和320,322和323,325和326,328和329,331和332,334和335,337和338,340和341,343和344,346和347,349和350,352和353,355和356,358和359,361和362,364和365,367和368,370和371,373和374,376和377,379和380,382和383、385和386,388和389,391和392,394和395,397和398,400和401,403和404,406和407,409和410,412和413,416和417,419和420,422和423,425和426,428和429,431和432,434和435,437和438,440和441,443和444,458和459,461和462、和/或464和465。此外，转录基因沉默(TGS)可以通过使用发夹抑制元件完成，其中发夹结构的反向重复序列与待沉默的靶多核苷酸的启动子区共享序列同一性。参阅例如，Aufsatzetal.(2002)PNAS99(Suppl.4):16499-16506和Metteetal.(2000)EMBOJ19(19):5194-5201。在其他实施方案中，dsRNA可以包含小RNA(sRNA)。sRNAs可以包含微RNA(miRNA)和短干扰RNA(siRNA)(MeisterandTuschl(2004)Nature431:343-349和Bonettaetal.(2004)NatureMethods1:79-86)。miRNA是包含约19个核糖核苷酸的调节剂，其高效抑制靶多核苷酸的表达。参阅例如，Javieretal.(2003)Nature425:257-263，在此通过引用并入。对miRNA干扰来说，沉默元件经设计，可以表达形成发夹结构的dsRNA分子，所述发夹结构含有与目的靶多核苷酸互补的19个核苷酸的序列。所述的miRNA可以合成产生，或转录为更长的RNA，其随后经切割产生活性miRNA。特别是，miRNA可以包含在其有义方向上与靶多核苷酸具有同源性的序列的19个核苷酸，和与有义序列互补的相应反义序列的19个核苷酸。当表达miRNA时,应当认识到可以转录各种形式的miRNA,包括例如,初级转录物(术语称为pr1-miRNA(初级miRNA)),pr1-miRNA经过各种核酸水解步骤,加工成更短的前体miRNA(术语称为pre_miRNA(前miRNA))；pre-miRNA;或最终(成熟)的miRNA以双链体的形式存在，两条链称为miRNA(最终与靶标碱基配对的链)和miRNA*。pre-miRNA是一类从前体中去除miRNA/miRNA*双链体的切割体(dicer)的底物，切割后，与siRNAs类似，双链体可以进入RISC复合体。有研究表明，miRNAs可以以转基因的方式表达，并通过前体形式而不是完全的初级形式的表达而有效(Parizottoetal.(2004)Genes&Developmentl8:2237-2242和Guoetal.(2005)PlantCell17:1376-1386)。本发明的方法和复合物使用转录时形成dsRNA分子的沉默元件。因此，表达的异源多核苷酸不需要自身形成dsRNA，而可以与植物细胞或摄食后害虫肠中的其它序列相互作用，以便允许形成dsRNA。例如，可以选择性沉默靶多核苷酸的嵌合多核苷酸，可以通过将包含miRNA或者siRNA的靶序列的嵌合构建体表达为对应于全部或部分待沉默的一个基因或多个基因的序列而生成。在这个实施方案中，当miRNA或者siRNA的靶标与存在于细胞中的miRNA相互作用时，形成dsRNA。因此发生的dsRNA可随后降低需待沉默的一个基因或多个基因的表达水平。参阅例如，美国临时申请第60/691613号，其是2005年6月17日提交的，题目为“MethodsandCompositionsforGeneSilencing(基因沉默的方法和组合物)”，在此通过引用并入。构建体经设计，可以具有内源miRNA的靶标，或者可选地，具有异源和/或合成的miRNA的靶标，可用于构建体中。如果使用异源和/或合成的miRNA，它可以作为嵌合多核苷酸在同一核苷酸构建体中，或在单独构建体中，被弓I入细胞。如本文其它部分所讨论的，可用任何方法引入包含异源miRNA的构建体。IV变体和片段“片段”是指多核苷酸的一部分或其编码的氨基酸序列及蛋白的一部分。多核苷酸片段可以编码保留天然蛋白的生物活性的蛋白片段。可选地，可用作沉默元件的多核苷酸片段不必编码保留生物活性的蛋白片段。因此，核苷酸序列片段的变化范围可以为从至少约10、约15、约20个核苷酸，约22个核苷酸、约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、200个核苷酸、300个核苷酸、400个核苷酸、500个核苷酸、600个核苷酸、700个核苷酸，高达本发明所用的全长多核苷酸。测定所需的沉默元件或抑制增强元件(suppressorenhancerelement)活性的方法在本文其它位置进行了描述。“变体”意是指基本上相似的序列。对于多核苷酸来说，变体包含在天然多核苷酸序列内的一个或多个内部位点上的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或天然多核苷酸内一个或多个位点上的一个或多个核苷酸的取代。如本文所用的，“天然”多核苷酸或者多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸来说，保守性变体包括这样的序列，其由于遗传密码的简并性而编码本发明所用的多肽之一的氨基酸序列。多核苷酸变体也包括以合成的方式衍生的多核苷酸，例如通过位点诱变产生的多核苷酸，但继续维持所需的活性。一般来说，本发明的具体多核苷酸(即沉默元件)的变体与该具体多核苷酸序列具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，如通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数所测定的。本发明的具体多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体可以通过比较多核苷酸变体所编码的多肽和和参考多核苷酸所编码的多肽间的序列同一性百分比来进行评估。任何两条多肽间的序列同一性百分比可以利用本文其他地方所述的序列比对程序和参数进行计算。如果任何给定的本发明所用的多核苷酸对都通过比较由它们所编码的多肽共享的序列同一性百分比进行评估，则两条编码的多肽间的序列同一性百分比为至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一'I"生。蛋白“变体”意指通过天然蛋白一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失和/或添加由该天然蛋白衍生的蛋白，和/或该天然蛋白内一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代。本发明所包括的蛋白变体具有生物活性，换言之，如本文其他地方所讨论的，它们继续拥有所需的天然蛋白的生物活性。此类变体可以由例如遗传多态性或人类操控来产生。天然蛋白的生物活性变体与该天然蛋白的氨基酸序列具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，如本文其他地方所述的序列比对程序和参数所测定的。本发明蛋白的生物活性变体与该蛋白的差异可以为少至1-15个氨基酸残基，少至1-10，如6-10，少至5、少至4、3、2，甚至I个氨基酸残基。以下术语用来描述两个或更多多核苷酸或多肽之间的序列关系(a)“参考序列，，(referencesequence)(b)“比较窗，，(comparisonwindow),(c)“序列同一性，，(sequenceidentity)和(d)“序列同一性百分比”(percentageofsequenceidentity)。(a)本文所用“参考序列”是作为序列比较基准而用的限定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部，例如是全长cDNA或基因序列的节段，或者完整的cDNA或基因序列。(b)本文所用“比较窗”涉及多核苷酸序列的连续且指定的节段，其中，为了两个多核苷酸的最佳比对，比较窗内的多核苷酸序列与参考序列(不包含添加或缺失)相比，可以包含添加或缺失(即空位)。一般来说，比较窗的长度为至少20个连续的核苷酸，且任选地可以是30、40、50、100个连续的核苷酸或更长。本领域技术人员可以理解，为了避免由于多核苷酸序列中包括空位而导致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分，将其从匹配数值中减去。除非另作说明，本文所提供的序列同一性/相似性的值指用GAPVersion10软件得出的，使用参数如下核苷酸序列的％同一性和％相似性所用的空位权重(GAPWeight)为50,长度权重(LengthWeight)为3,并利用nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性使用的GAP权重为8、长度权重为2，利用BL0SUM62评分矩阵；或其任何等同程序。“等同程序”是指任何序列比对程序，对所讨论的任何两个序列而言，当与GAPVersion10所产生的相应比对结果相比时，该任何序列比对程序产生具有相同的核苷酸或者氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分的比对结果。(c)在两个多核苷酸序列或多肽序列的情况下，本文所用“序列同一性”或者“同一性”涉及两个序列中的残基，所述残基在指定的比较窗内为最大对比而进行比对时，是相同的。当序列同一性百分比的使用涉及蛋白质时，应当意识到，不同的残基位置经常由于保守性氨基酸的取代而不同，其中氨基酸残基被被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，且因此，并不改变该分子的功能性质。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调整序列同一性百分比，以便矫正取代的保守特性。认为由于此类保守性取代而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。进行此类调整的方式，是本领域的技术人员所熟知的。通常这涉及将保守取代作为部分而并非全部错配来评分，由此增加序列同一性百分比。因此，例如，如果给出的相同氨基酸的得分为1，给出的非保守取代的得分为0，则给出的保守取代的得分介于O和I之间。保守取代的评分，例如按PC/GENE程序(Intelligenetics,MountainView,California)所执行的，进行计算。(d)本文所用“序列同一性百分比”是指通过在比较窗对两个最佳比对的序列进行比较所测定的值，其中，为了两个序列的最佳比对，比较窗内的一部分多核苷酸序列与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即空位)。百分比的计算按如下进行，测定两个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量，以便获得匹配位置的数量，然后用匹配位置的数量除以比较窗中的位置总数，再将结果乘以100，得到序列同一性百分比。V.DNA构建体术语“多核苷酸”的使用并非意图将本发明局限于包含DNA的多核苷酸。本领域所属技术人员应当认识到，多核苷酸可以包括核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸与核糖核苷包括天然存在的分子和合成的类似物。本发明的多核苷酸还包括序列的所有形式，包括但不局限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。编码沉默元件的多核苷酸或在本发明的方法和组合物所用的具体实施方案中的多核苷酸可以以表达盒的形式提供，用于在目的植物或生物中表达。现已认识到，可以使用多重沉默元件，包括多重相同的沉默元件、靶向靶序列的不同区域的多重沉默元件或者来自不同靶序列的多重沉默元件。在本实施方案中，应当认识到，可将每个沉默元件包含在单个或单独的盒、DNA构建体或者载体中。正如所讨论的,提供沉默元件的任何方式都是经过仔细考虑的。植物或植物细胞可以用包含编码一个或多个沉默元件的DNA盒转化，或包含每个沉默元件的单独的盒可以用来转化植物、植物细胞或宿主细胞。同样，经过一种组分转化的植物可以随后用第二种组分转化。一个或多个沉默元件可以通过有性杂交集合在一起。也就是说，使包含一组分的第一植物与包含第二组分的第二植物杂交。杂交后的后代植株将包含两种组分。所述的表达盒可以包括可操作地连接于本发明的多核苷酸的5’和3’调节序列。“可操作地连接”意图表示两个或多个元件之间的功能性连接。例如，本发明的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的可操作的连接是允许本发明的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是相邻的或不相邻的。当涉及两个蛋白编码区的结合时，可操作地连接表示编码区域位于同一读框内。盒可以另外含有至少一个待共转化于生物的其他核苷酸。或者，将其他多肽提供于多重表达盒中。表达盒可以提供有多个限制位点和/或重组位点，用于插入处于调节区的转录调节控制下的核苷酸。表达盒可以另外含有选择标记基因(selectablemarkergene)。表达盒在转录的5’-3’方向上包括，转录和翻译起始区(即启动子)、包含本发明的方法和组合物所用的沉默元件的多核苷酸和在植物中有功能的转录和翻译终止区(即终止区)。本发明所用的调节区(即启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或本发明所用的多核苷酸对宿主细胞或彼此之间来说可以是天然的/相似的。可选地，本发明所用的调节区和/或多核苷酸对宿主细胞或彼此之间可以是异源的。涉及到序列时，本文所用的“异源”是指外来物种来源的序列，或者是如果来自相同物种，通过有意的人为干预在组成和/基因组基因座中由其天然形式进行了实质性修饰的序列。例如，可操作地连接于异源多核苷酸的启动子来自与衍生所述多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来源于相同/相似物种，其中之一或两者由其最初形式和/或基因组基因座进行了实质性修饰，或者该启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。如本文所用的，嵌合基因包含编码序列，该编码序列可操作地连接于该编码序列的异源转录起始区。终止区可以与转录起始区是天然的，可以与可操作地连接的编码沉默元件的多核苷酸是天然的，可以与植物宿主是天然的，或者可以来源于启动子、包含沉默元件的多核苷酸、植物宿主的另一来源(即外来的或异源的)，或者其任意组合。合适的终止区可以从根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒中获得,例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也可以参阅Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144;Proudfoot(1991)Cell64:671-674;Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5:141-149;Mogenetal.(1990)PlantCell2:1261-1272;Munroeetal.(1990)Gene91:151-158;Baliasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903和Joshietal.(1987)NucleicAcidsRes.15:9627-9639。已知其他序列修饰增强细胞宿主内的基因表达。这些修饰包括去除编码假的聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号，转座子样重复和不利于基因表达的其他此类充分表征的序列。可以将序列的G-C含量调整至给定的细胞宿主的平均水平，这可通过参考宿主细胞内表达的已知基因计算。可能的话，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。在制备表达盒时，可操作各种DNA片段，以便将DNA序列提供于正确的定位，如有必要，在合适的读框内。最后阶段，连接物(adapters)和接头(linkers)可以用于连接DNA片段，或者可以涉及提供方便的限制位点、移除过剩的DNA、移除限制位点等的其他操作。为此，可以涉及体外诱·变、引物修复、限制、退火、再取代，例如转换和颠换。很多的启动子可以在本发明的实践中使用。编码沉默元件的多核苷酸可以与组成型启动子、组织优选启动子或其他启动子组合，供在植物中表达。此类组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子以及W099/43838和美国专利第6，072，050号所公开的其他组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odelletal.(1985)Nature313:810-812);水稻肌动蛋白(McElroyetal.(1990)PlantCell2:163-171)；泛素(Christensenetal.(1989)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensenetal.(1992)PlantMol.Biol.18:675-689)；pEMU(Lastetal.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Veltenetal.(1984)EMBOJ.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利第5，659，026号)等。其他组成型启动子包括，例如，美国专利第5,608,149号、第5,608,144号、第5,604,121号、第5,569,597号、第5,466,785号、第5，399，680号、第5，268，463号、第5，608，142号和第6，177，611号。也可以使用诱导型启动子，例如病原体诱导的启动子。此类启动子包括那些来自发病机理相关蛋白(PR蛋白)的启动子，其在感染病原体后受到诱导；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。参阅，例如，Redolfietal.(1983)Neth.J.PlantPathol.89:245-254;Uknesetal.(1992)PlantCell4:645-656；VanLoon(1985)PlantMol.Virol.4:111-116。还参阅WO99/43819，在此通过引用并入。感兴趣的是在病原体感染位点或在该位点附近局部表达的启动子。参阅，例如，Marineauetal.(1987)PlantMol.Biol.9:335-342；Mattonetal.(1989)MolecularPlant-MicrobeInteractions2:325-331;Somsischetal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:2427-2430；Somsischetal.(1988)Mol.Gen.Genet.2:93-98;和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:14972-14977。还参阅Chenetal.(1996)PlantJ.10:955-966；Zhangetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:2507-2511；ffarneretal.(1993)PlantJ.3:191-201；Siebevtzetal.(1989)PlantCell1:961-968;美国专利第5，750，386号(线虫诱导型)以及其中引用的文献。特别感兴趣的是玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达受病原体串珠镰刀菌(FusariummoniIiforme)的诱导。(参阅，例如，Corderoetal.(1992)Physiol.Mol.PlantPath.41:189-200)。此外，因为病原体进入植物是通过创伤或昆虫损伤，所以创伤诱导型启动子可以在本发明的构成中使用。此类创伤诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(PinII)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28:425-449;Duanetal.(1996)NatureBiotechnology14:494-498)、wunl和wun2(美国专利第5，428,148号)、winl和win2(Stanfordetal.(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208)、系统素(McGurletal.(1992)Science225:1570-1573),WIPl(Rohmeieretal.(1993)PlantMol.Biol.22:783-792;Eckelkampetal.(1993)FEBSLetters323:73-76)、MPI基因(Corderoketal.(1994)PlantJ.6(2):141-150)等，在此通过引用并入。化学品调节的启动子可以用来通过外源化学调节剂的应用来调节植物内基因的表达。视具体情况而定，启动子可以是化学品诱导型启动子，其中化学品的应用诱导基因表达；或者是化学品抑制型启动子，其中化学品的应用抑制基因表达。化学品诱导型启动子在本领域内是已知的，包括但不限于玉米Ιπ2-2启动子，其被苯磺酰胺除草剂安全剂激活；玉米GST启动子,其被用作在萌发前施用的除草剂(pre-emergentherbicide)的疏水亲电的化合物激活，以及烟草PR-1a启动子，其被水杨酸激活。其他目的化学品调节的启动子包括类固醇应答启动子(参阅，例如，Schenaetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:10421-10425和McNellisetal.(1998)PlantJ.14(2):247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)和四环素诱导型启动及四环素抑制型启动子(参阅，例如，Gatzetal.(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237和美国专利第5，814，618号和第5，789，156号)，在此通过引用并入。组织优选启动子可以用于在特定植物组织中靶向增强表达。组织优选启动子包括Yamamotoetal.(1997)PlantJ.12(2):255-265;Kawamataetal.(1997)PlantCellPhysiol.38(7):792-803;Hansenetal.(1997)Mol.GenGenet.254(3):337-343;Russelletal.(1997)TransgenicRes.6(2):157-168;Rinehartetal.(1996)PlantPhysiol.112(3):1331-1341;VanCampetal.(1996)PlantPhysiol.112(2):525-535;Canevascinietal.(1996)PlantPhysiol.112(2):513-524;Yamamotoetal.(1994)PlantCellPhysiol.35(5):773-778;Lam(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20:181-196;Orozcoetal.(1993)PlantMolBiol.23(6):1129-1138;Matsuokaetal.(1993)ProcNatl.Acad.Sc1.USA90(20):9586-9590和Guevara-Garciaetal.(1993)PlantJ.4(3):495-505。如果需要的话，可以修饰此类启动子，用于弱表达。叶片优选启动子在本领域内是已知的。参阅，例如，Yamamotoetal.(1997)PlantJ.12(2):255-265;Kwonetal.(1994)PlantPhysiol.105:357-67;Yamamotoetal.(1994)PlantCellPhysiol.35(5):773-778;Gotoretal.(1993)PlantJ.3:509-18;Orozcoetal.(1993)PlantMol.Biol.23(6):1129-1138和Matsuokaetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90(20):9586-9590。根部优选启动子是已知的，并可以选自从文献获得的许多根部优选启动子，或者从各种兼容物种中重新分离。参阅，例如，Hireetal.(1992)PlantMol.Biol.20⑵207-218(大豆根部特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)PlantCell3(10):1051-1061(菜豆(Frenchbean)GRPl.8基因的根部特异性控制元件)；Sangeretal.(1990)PlantMol.Biol.14(3):433-443(根瘤农杆菌的甘露碱合酶(MAS)基因的根部特异性启动子)；以及Miaoetal.(1991)PlantCell3(1):11-22(编码在大豆根部和根瘤部表达的胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的cDNA全长克隆)。也可参阅Boguszetal.(1990)PlantCell2(7):633_641，该文献描述了从固氮非豆类Parasponiaandersonii和相关的非固氮非豆类山黄麻(Trematomentosa)的血红蛋白基因中分离的两个根部特异性启动子。将这些基因的启动子连接于匍糖醛酸糖苷酶报告基因，并引入非豆类烟草(Nicotianatabacum)和豆类百脉根(Lotuscorniculatus)中，在两个例子中都保留根部特异性启动子的活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对于发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)高表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参阅PlantScience(Limerick)79(I):69-76)。他们得出的结论是,在那些启动子中增强子和组织优选DNA决定子是分离的。Teerietal.(1989)使用基因与IacZ融合物表明，编码章鱼碱合酶的农杆菌T-DNA在根尖的表皮中活性特别高，并且TR2’基因在完整的植物中是根部特异性的，被叶片组织中的创伤激活，对于与杀虫基因或杀幼虫基因一起使用而言，其是特别理想的特征组合(参阅EMBOJ.8(2):343-350)。与nptll(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1’基因展现出相似的特征。其他的根部优选启动子包括VfEN0D-GRP3基因启动子(Kusteretal.(1995)PlantMol.Biol.29(4):759-772)和rolB启动子(Capanaetal.(1994)PlantMol.Biol.25(4):681-691)。也可参阅美国专利第5，837，876号、第5，750，386号、第5,633,363号、第5,459，252号、第5,401,836号、第5，110，732号和第5，023，179号。在本发明的一个实施方案中，植物表达的启动子是维管特异性启动子，例如韧皮部特异性启动子。本文所用“维管特异性”启动子是至少在维管细胞中表达的启动子或优先在维管细胞中表达的启动子。维管特异性启动子的表达不必是维管细胞中专有的，在其他细胞类型或组织中也可能表达。本文所用“韧皮部特异性启动子”是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达的启动子，或优先在韧皮部细胞中表达的启动子。韧皮部特异性启动子的表达不必是韧皮部细胞中专有的，在其他细胞类型或组织例如木质部组织中，也可能表达。在本发明的一个实施方案中，韧皮部特异性启动子是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达的启动子，其中在非韧皮部细胞中的表达与在韧皮部细胞中的表达相比，更受到限制(或者缺失)。依照本发明的适合的维管特异性启动子或韧皮部特异性启动子的实例包括但不限于选自以下的启动子SCSV3、SCSV4、SCSV5和SCSV7启动子(Schunmannetal.(2003)PlantFunctionalBiology30:453-60);发根农杆菌的rolC基因启动子(Kiyokawaetal.(1994)PlantPhysiology104:801-02;Pandolfinietal.(2003)BioMedCentral(BMC)Biotechnology3:7，(www.biomedcentral.com/1472-6750/3/7)；Grahametal.(1997)PlantMol.Biol.33:729-35；Guivarc1hetal.(1996)；Almonetal.(1997)PlantPysiol.115:1599-607;发根农杆菌的rolA基因启动子(Dehioetal.(1993)PlantMol.Biol.23:1199-210);根瘤农杆菌T-DNA基因5的启动子(Korberetal.(1991)EMBOJ.10:3983-91);水稻蔗糖合酶(RSsl)基因启动子(Shietal.(1994)J.Exp.Bot.45:623-31);CoYMV或鸭跖草黄化斑驳杆状DNA病毒启动子(Medberryetal.(1992)PlantCell4:185-92;Zhouetal.(1998)Chin.J.Biotechnol.14:9-16);CFDV或椰子叶衰败病毒启动子(Rohdeetal.(1994)PlantMol.Biol.27:623-28；Hehn和Rhode(1998)J.Gen.Virol.79:1495-99)；RTBV或水稻东格鲁杆状病毒启动子(YinandBeachy(1995)PlantJ.7:969-80；Yinetal.(1997)PlantJ.12:1179-80);豌豆谷氨酰胺合酶GS3A基因(Edwardsetal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:3459-63；Brearsetal.(1991)PlantJ.1:235-44);马铃薯蔗糖酶基因的invCDlll和invCD141启动子(Hedleyetal.(2000)J.Exp.Botany51:817-21);从拟南芥中分离的启动子，Kertbunditetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:5212-16)证明，其在烟草中具有韧皮部特异性表达；VAHOH启动子区(Torneroetal.(1996)PlantJ.9:639-48);豌豆细胞壁鹿糖酶基因启动子(Zhangetal.(1996)PlantPhysiol.112:1111-17);美国公布的专利申请第20030106097号中，与壳多糖酶相关的内源棉花蛋白的启动子，其是胡萝卜来源的酸性转化酶基因启动子(Ramloch-Lorenzetal.(1993)ThePlantJ.4:545-54);硫酸盐转运蛋白基因Sultrl;3的启动子(Yoshimotoetal.(2003)PlantPhysiol.131:1511-17);鹿糖合酶基因的启动子(Nolte和Koch(1993)PlantPhysiol.101:899-905);烟草鹿糖转运蛋白基因的启动子(Kuhnetal.(1997)Science275-1298-1300)。可能的启动子也包括李苷水解酶(PHDL1.4PRO)的黑莓启动子(BlackCherrypromoter,美国专利6，797，859号)；黄瓜和水稻来源的硫氧还蛋白H启动子(FukudaAetal.(2005).PlantCellPhysiol.46(11):1779-86)；水稻(RSsl)(Shi,T.Wangetal.(1994)·J.Exp.Bot.45(274):623-631)和玉米蔗糖合酶-1启动子(Yang.，N-S.etal.(1990)PNAS87:4144-4148);南瓜来源的PP2启动子(Guo,H.etal.(2004)TransgenicResearch13:559-566)；AtSUC2启动子(Truernit,Ε·etal.(1995)Plantal96(3):564-70.)；AtSAM-1(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)(MijnsbruggeKV.etal.(1996)Planr.Cell.Physiol37(8):1108-1115)和水稻东格鲁杆状病毒启动子(RTBV)启动子(Bhattacharyya-Pakrasietal.(1993)PlantJ.4(I):71-79)。表达盒也可以包含选择标记基因，用于选择转化细胞。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草化合物抗性的基因，例如草铵膦(glufosinateammonium)、溴苯腈、咪唑啉酮、2，4_二氯苯氧乙酸(盐2，4-dichlorophenoxyacetate,2，4_D)。其他的可选标记包括表型标记,例如β_半乳糖苷酶和突光蛋白，例如绿色突光蛋白(GFP)(Suetal.(2004)BiotechnolBioeng85:610-9和Fetteretal.(2004)PlantCell16:215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolteetal.(2004)J.CellScience117:943-54和Katoetal.(2002)PlantPhysiol129:913-42)和黄色荧光蛋白(Evrogen的PhiYFPTM，参阅，Bolteetal.(2004)J.CellScience117:943-54)。对于其他的选择标记，通常参阅，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christophersonetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:6314-6318;Yaoetal.(1992)CelI71:63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422；Barkleyetal.(1980)inTheOperon,pp.177-220；Huetal.(1987)Cell48:555-566；Brownetal.(1987)Cell49:603-612；Figgeetal.(1988)Cell52:713-722；Deuschleetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:5400-5404;Fuerstetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2549-2553；Deuschleetal.(1990)Science248:480-483;Gossen(1993)Ph.D.Thesis(博士论文)，UniversityofHeidelberg；Reinesetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:1917-1921；Labowetal.(1990)MolCell.Biol.10:3343-3356；Zambrettietal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:3952-3956;Bairnetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:5072-5076；ffyborskietal.(1991)NucleicAcidsRes.19:4647-4653；Hillenand-ffissman(1989)TopicsMolStruc.Biol.10:143-162；Degenkolbetal.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35:1591-1595；Kleinschnidtetal.(1988)Biochemistry27:1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis(博士论文)，UniversityofHeidelberg;Gossenetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:5547-5551；01ivaetal.(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36:913-919；Hlavkaetal.(1985)HandbookofExperimentalPharmacology,Vol.78(Springer-Verlag,Berlin)；Gilletal.(1988)Nature334:721-724。这些公开在此通过引用并入。以上选择标记基因的名录不是意图限制。任何选择标记基因可以用于本发明中。·V1.包含沉默元件的组合物包含沉默元件的一种或多种多核苷酸可以作为外部组合物，例如喷雾或粉末，提供给植物、植物部分、种子、害虫或耕种区域。在另一个实例中，植物转化有表达至少一种沉默元件的DNA构建体或表达盒。在任一组合物中，当被昆虫摄食后，沉默元件可以降低靶害虫序列的水平，由此控制害虫(即鳞翅目的任何害虫，例如草地贪夜蛾)。应当认识到，组合物可以包含细胞(例如植物细胞或细菌细胞)，在该细胞中，编码沉默元件的多核苷酸稳定地并入基因组中并可操作地连接于在细胞中有活性的启动子。也包括包含细胞混合物的组合物，一些细胞表达至少一种沉默元件。在其他实施方案中，包含沉默元件的组合物不包含在细胞内。在这些实施方案中，组合物可以应用到害虫栖息的区域。在一个实施方案中，组合物被应用到植物外部(即喷洒田地或耕作区)，保护植物免受害虫的危害。在一个实施方案中，包含控制鳞翅目害虫的沉默元件的组合物不包含利于RNAi摄入昆虫细胞的异源阳离子寡肽。因此，在这些实施方案中，在缺少了对于植物、植物部分或微生物来说是异源的阳离子寡肽的情况下的，杀虫活性存在于本发明的组合物(例如植物、植物部分、植物细胞或者微生物)中。阳离子寡肽是靶标非特异性的，通过静电相互作用和电荷中和与RNA非特异性相互作用来穿过细胞膜，且缺乏促进与细胞膜特异性相互作用的特异性活性。本发明的组合物还可配制为饵食。在这个实施方案中，所述组合物包含食物或者可以增强该组合物对害虫吸引力的引诱剂。包含沉默元件的组合物可以配制在适合于农业和/或环境可接受的载体(carrier)中。此类载体可以是需要处理的动物、植物和环境能忍受的任何材料。此外，所述载体必须能使组合物维持有效控制害虫。此类载体的实例包括水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖或其他糖溶液、Hank液(Hank'ssolution)和其他水性生理平衡盐溶液、磷酸缓冲液、重碳酸盐缓冲液和Tris缓冲液。另外，组合物可以包括能够增加组合物半寿期的化合物。应当认识到，包含编码沉默元件的序列的多核苷酸可以用于转化生物，为宿主生物提供这些组分的产生，并随后将这些宿主生物应用到靶害虫的环境中。此类宿主生物包括杆状病毒、细菌等。以此方式，可将编码沉默元件的多核苷酸的组合通过合适的载体(vector)引入微生物宿主，并将所述宿主应用于环境、植物或动物中。在将核酸插入细胞的情况下，术语“引入(introduced)”表示“转染(transfection)”或“转化(transformation)”或“转导(transduction)”，而且包括提及将核酸引入真核细胞或原核细胞中，其中，核酸可以稳定地并入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转变成自主复制子，或者瞬时表达(例如转染的mRNA)。可以选择已知占据一种或多种目的农作物的“植物圈”(叶面、叶围、根围和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物是为了能够在特定的环境中与野生型微生物成功竞争，提供编码沉默元件的多核苷酸的稳定保持和表达，并且理想的是，改善组分的保护作用，免遭环境退化和失活的危害。此类微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，例如细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、Methylius、农杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮细菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产喊杆菌属(Alcaligenes),真菌,特别是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷抱酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是植物圈的细菌物种,例如丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、突光假单胞菌(PseudomonasfIuorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、木醋杆菌(Acetobacterxylinum)、农杆菌(Agrobacteria)、球红假单胞菌(Rhodopseudomonasspheroides)、野油菜黄假单胞菌(Xanthomonascampestris)、苜猜根瘤菌(Rhizobiummelioti)、真养产碱杆菌(Alcaligenesentrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacterxyli)、掠色固氮菌(Azotobactervinlandir)和植物圈酵母种类，例如深红酵母(Rhodotorularubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙红酵母(R.aurantiaca)、白色隐球酵母(Cryptococcusalbidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.1aurentii)、罗斯酵母(Saccharomycesrosei)、S.pretoriensis、啤酒酵母(S.cerevisiae)、Sporobolomycesrosues、香气掷胞酵母(S.odorus)、Kluyveromycesveronae和出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpollulans)。特别感兴趣的是有色微生物。在允许稳定维持和表达编码序列的多核苷酸的条件下，可用很多方法将包含沉默元件的此类多核苷酸引入微生物宿主。例如，可以构建表达盒，其包括目的核苷酸构建体，其可操作地与表达该核苷酸构建体的转录调节信号和翻译调节信号连接，和与宿主生物内序列同源的核苷酸序列，借以实现整合，和/或在宿主内有功能的复制系统，借以实现整合或稳定维持。转录调节信号和翻译调节信号包括但不局限于启动子、转录起始开始位点、操纵基因、激活剂、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。参阅，例如，美国专利第5，039，523号和第4，853，331号；EP00480762A2；Sambrooketal.(2000);MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)(3rded.;ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NY)；Davisetal.(1980)AdvancedBacterialGenetics(高级细菌遗传学)(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY);以及其中引用的文献。合适的宿主细胞包括原核细胞和低等的真核细胞，例如真菌。作为例证的原核生物，即革兰氏阴性和革兰氏阳性，包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae),例如埃希氏菌(Escherichia)、欧文氏菌、志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)和变形杆菌属(Proteus);芽孢杆菌科(Bacillaceae);根瘤菌科(Rhizobiceae),例如根瘤菌属；螺菌科(Spirillaceae)，例如发光细菌(photobacterium)、发酵单孢菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺旋状菌属(Spirillum);乳酸细菌科(LactobaciIIaceae);假单胞菌科(Pseudomonadaceae),例如假单胞菌属和醋杆菌属；固氮菌科和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。真核细胞中是真菌,例如藻状菌纲(Phycomycetes)和子囊菌纲(Ascomycetes),其包括酵母,例如酵母属和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces);和担子菌纲(Basidiomycetes)酵母，例如红酵母属、短梗霉属、掷孢酵母属等。为本发明目的选择宿主细胞时，特别感兴趣的特征包括将编码序列引入宿主的便利性、表达系统的可利用性、表达的效率、在宿主中的稳定性和辅助遗传性能的存在。作为杀虫剂微胶囊使用时，目的特征包括防护性，例如厚细胞壁，色素作用和包涵体的细胞内包装或形成；叶片亲和力；缺乏哺乳动物毒性；对害虫摄食的吸引力等。其他的考虑包括方便配置和处理、经济情况、储存稳定性等。目的宿主生物包括酵母，例如红酵母(Rhodotorulaspp.)、短梗霉(Aureobasidiumspp.)、酵母(Saccharomycesspp.)和掷抱酵母(Sporobolomycesspp.),叶面生物，例如，假单胞菌(Pseudomonasspp·)、欧文氏菌(Erwiniaspp.)和黄质菌(Flavobacteriumspp.),及其它此类生物，包括绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、突光假单胞菌、啤酒酵母、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)等。可以将本发明所包括的编码沉默元件的序列引入在植物上繁殖的微生物(体表寄生菌)，将这些组分送递到潜在的靶害虫。体表寄生菌，例如，可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。沉默元件可以在细菌宿主中产生，所得的细菌以与苏云金杆菌属被用作杀虫喷雾剂的方式用作微生物喷雾剂。任何合适的微生物可以用于此目的。假单胞菌属被用来表达作为装入胶囊的蛋白的苏云金杆菌属内毒素，处理所得细胞并作为杀虫剂喷雾(Gaertneretal.(1993),inAdvancedEngineeredPesticides,ed.L.Kim(MarcelDecker,Inc.))。可选地，本发明的组分通过将异源基因引入细胞宿主来产生。异源序列的表达直接或间接地导致细胞内沉默元件的产生。然后，根据常规技术配制应用于靶害虫所寄生的环境的这些组合物,例如,土壤、水和植物的叶子。参阅，例如,EPAO192319和其中引用的文献。在本发明中，转化的微生物可以用可接受的载体配制成单独的或混合的组合物，该组合物是，例如，悬液、溶液、乳剂、隔离剂(dustingpowder)、可分散颗粒、可湿性粉剂和可乳化浓缩物、气雾剂、浸溃颗粒、佐剂、涂膏(coatablepaste)和在例如多聚物中的胶囊密封物(encapsulations)。以上所公开的此类组合物可以添加以下物质获得表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、取食刺激剂、引诱剂、包裹剂(encapsulatingagent)、粘合剂、乳化剂、染料、紫外线防护剂、缓冲剂、流动剂或肥料、微量营养供体或其他能影响植物生长的制剂。一种或多种农用化学品，其包括但不限于除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、软体动物杀灭剂、杀螨剂、植物生长调节剂、落叶剂和肥料，可以与配制领域通常使用的载体、表明活性剂或佐剂，或便于产品对特定靶害虫的处理和应用的其他组分进行组合。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并且与配置技术中通常使用的物质一致，例如，天然或再生矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。本发明的活性成分(即至少一种沉默元件)通常以组合物的形式应用，并且可以应用于需要处理的农作物区域、植物或种子。例如，该组合物可以应用于准备储存或正储存在粮仓或地窖中的谷类等。该组合物可以与其他化合物同时或相继应用。应用活性有效成分或包含至少一种沉默元件的组合物的方法包括叶面应用、种子包被和土壤应用，但不限于此。应用的数量和应用的速率取决于相应害虫的侵袭强度。合适的表面活性剂包括但不限于，阴离子化合物，例如金属羧酸盐；长链脂肪酸羧酸酯；N-酰基肌氨酸酯；磷酸与脂肪醇聚氧乙烯醚形成的单酯或二酯及这些酯的盐；脂肪醇硫酸酯，例如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；脂肪醇醚硫酸盐；乙氧基烷基苯酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐例如烷基苯磺酸盐或低烷基萘磺酸盐，例如萘磺酸丁酯；萘磺酸甲醛缩合物的盐；磺化苯酚甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐，例如酰胺·磺酸盐，例如油酸与N-甲基牛磺酸的磺酸化缩合产物；或者二烷基磺化琥珀酸盐，例如，磺酸钠或琥珀酸二辛合成酯。非离子剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪族烷基或链烯基取代的酚类与环氧乙烷、多元醇酯的脂肪酯例如山梨糖醇酐脂肪酸酯的缩合产物，此类酯与环氧乙烷的缩合物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，环氧乙烷与环氧丙烷的嵌段共聚物，炔属乙二醇，例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇或乙氧化乙炔乙二醇。阳离子表面活性剂的实例包括，例如脂肪族单胺、二胺或多胺，例如醋酸酯、环烷酸酯或油酸酯；或含氧胺，例如氧乙烯烷基胺的氧化胺；连有酰胺的胺，由羧酸与二胺或多胺缩合制备；或者季铵盐。惰性材料的实例包括但不限于，无机矿物，例如高岭土、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或植物材料，例如软木、粉碎的玉米穗轴、花生壳、水稻壳和胡桃壳。包含沉默元件的组合物可以是适合直接应用的形式，或作为应用前需要用适量的水或其他稀释剂稀释的原始组合物的浓缩物。组合物(包括转化的微生物)可以通过以下应用到虫害(例如鳞翅目害虫)的环境中，例如喷雾、雾化、喷粉、散射、包被或灌注、引入土壤内部或表面、弓I入灌溉水内、种子处理或者作为防护措施在害虫开始出现时或害虫出现以前进行常规应用或喷粉。例如，组合物和/或转化的微生物可以与谷类混合，在储存过程中保护谷类。通常重要的是，在植物生长的早期获得良好的害虫控制，因为此时植物受到的损伤是最严重的。如果认为必要的话，本组合物可以方便地含有另一杀虫剂。在本发明的一个实施方案中，以本发明载体、芽孢杆菌菌株或转化的微生物的死细胞的组合物的颗粒形式，在种植期将组合物直接应用于土壤。另一个实施方案是颗粒形式的组合物，其包含芽孢杆菌或本发明转化的微生物的死细胞和在惰性载体内的农用化学品，例如除草剂、杀虫剂、肥料。Vn.植物、植物部分和将序列引入植物的方法在一个实施方案中，本发明的方法包括将多肽或多核苷酸引入植物。“引入(introducing)”意图表示以序列进入植物细胞内部的方式将多核苷酸或多肽呈现给植物。本发明的方法不依靠将序列弓I入植物的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞内部。将多核苷酸或多肽引入植物的方法在本领域内是已知的，包括稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导方法，但并不局限于此。“稳定转化”意图表示引入植物的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且能够被其后代继承。“瞬时转化”意图表示多核苷酸被引入植物并且没有整合到植物的基因组内或多肽被引入植物内。转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入植物的方案根据靶向转化的植物或植物细胞的类型即单子叶植物或双子叶植物的不同而不同。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crosswayetal.(1986)Biotechniques4:320-334),电穿孔(Riggsetal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:5602-5606,农杆菌属介导的转化(美国专利第5，563，055号和美国专利第5，981，840号)，直接基因转移(Paszkowskietal.(1984)EMBOJ.3:2717-2722)，弹道粒子加速(参阅，例如，美国专利第4，945,050号、美国专利第5，879，918号、美国专利第5，886，244号和第5,932,782号；Tomesetal.(1995)inPlantCelI,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods,ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag,Berlin)；McCabeetal.(1988)Biotechnology6:923-926)；和Lecl转化(WO00/28058)。也可参阅Weissingeretal.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanfordetal.(1987)ParticulateScienceandTechnology5:27-37(洋葱)；Christouetal.(1988)PlantPhysiol.87:671-674(大豆)；McCabeetal.(1988)Bio/Technology6:923-926(大豆)；FinerandMcMullen(1991)InVitroCellDev.Biol.27P:175-182(大豆);Singhetal.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Dattaetal.(1990)Biotechnology8:736-740(水稻)；Kleinetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4305-4309(玉米);Kleinetal.(1988)Biotechnology6:559-563(玉米);美国专利第5,240,855号、美国专利第5,322,783号、美国专利第5，324，646;Kleinetal.(1988)PlantPhysiol.91:440-444(玉米)；Frommetal.(1990)Biotechnology8:833-839(玉米)；Hooykaas_VanSlogterenetal.(1984)Nature(London)311:763-764;美国专利第5，736，369号(谷类)；Bytebieretal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:5345-5349(百合类)；DeWetetal.(1985)inTheExperimentalManipulationofOvuleTissues,ed.Chapmanetal.(Longman,NewYork),pp.197-209(花粉)；Kaeppleretal.(1990)PlantCellReports9:415-418和Kaeppleretal.(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(卩遼菌体颈须介导的转化)；D'Halluinetal.(1992)PlantCell4:1495-1505(电穿孔)；Lietal.(1993)PlantCellReports12:250-255和ChristouandFord(1995)AnnalsofBotany75:407-413(水稻)；0sjodaetal.(1996)NatureBiotechnology14:745-750(玉米通过根癌农杆菌)；以上均在此通过引用并入。在具体的实施方案中，本发明的沉默元件序列可以使用很多瞬时转化方法提供给植物。此类瞬时转化方法包括但不限于将蛋白或其变体和片段直接引入植物或者将转录物引入植物。此类方法包括,例如,显微注射和粒子轰击。参阅，例如,Crosswayetal.(1986)Mol.Gen.Genet.202:179-185;Nomuraetal.(1986)PlantSc1.44:53-58;Hepleretal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.91:2176-2180和Hushetal.(1994)TheJournalofCellScience107:775-784;以上均在此通过引用并入。可选地，可以使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化进入植物。在阻止DNA随后释放的意义上，此类技术包括病毒载体系统和多核酸沉淀。因此，来自颗粒结合的DNA的转录可以发生，但是其释放出来整合到基因组中的频率大大降低。此类技术包括使用包被有聚乙基亚胺的颗粒(PEI;Sigma#P3143)。在其他实施方案中，本发明的多核苷酸可以通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入植物。通常，此类方法包括将本发明的核酸构建体并入病毒DNA或RNA分子。此外，应当认识到，本发明的启动子也包括病毒RNA聚合酶转录所用的启动子。将多核苷酸引入植物和在其中表达编码的蛋白的方法，包括病毒DNA或RNA分子，在本领域内是已知的。参阅，例如，美国专利第5，889，191号、美国专利第5，889，190号、第5，866，785号、第5，589，367号、第5，316，931号和Portaetal.(1996)MolecularBiotechnology5:209-221;在此通过引用并入。在植物基因组的特定位置上靶向插入多核苷酸的方法，在本领域内是熟知的。在一个实施方案中，在希望的基因组位置插入多核苷酸使用位点特异性重组系统完成。参阅，例如，W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855和W099/25853，以上均在此通过引用并入。简而言之，本发明的多核苷酸可以包含在侧翼为两个非重组发生的重组位点的转移盒内。将转移盒引入植物中，该植物具有稳定并入其基因组的靶位点，该靶位点的侧翼为对应于转移盒的位点的两个非重组发生的重组位点。提供了合适的重组酶，且转移盒在靶位点上整合。据此，目的多核苷酸被整合到植物基因组中的特定染色体位置。可以根据常规方式使转化后的细胞可生长成植物。参阅，例如，McCormicketal.(1986)PlantCellReports5:81-84。这些植物可以被种植，并且用相同的转化品系或不同品系授粉，从而得到的后代具有组成型表达的确定的所需的表型特征。可以种植两代或更多代，以确保所需的表型特征的表达稳定保持和遗传，然后收获种子以确保所需的表型特征已实现。如此，本发明提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，该种子具有稳定并入其基因组的本发明的多核苷酸，例如，本发明的表达盒。本文所用的术语植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈合组织、植物丛(Plantclump)和在植物或植物部分中完好的植物细胞，所述植物部分如胚、花粉、胚珠、种子、叶片、花、枝条、果实、果仁、穗、穗轴、外皮、茎、根、根尖、花药等。谷类意图表示商业种植者除了种植和繁殖物种以外的的目的所生产的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，只要这些部分包含引入的多核苷酸。本发明可以用于任何植物物种的转化，包括单子叶植物和双子叶植物，但并不局限于此。目的植物物种的实例包括但不限于，玉米(Zeamays)、芸苔(Brassicasp，例如油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea))特别是那些用作种子油来源的芸苔、苜猜(紫花苜猜(Medicagosativa))、水稻(Oryzasativa)、黑麦(Secalecereale)、高梁(Sorghumbicolor、Sorghumvulgare)、稷(例如珍珠稷(Pennisetumglaucum)、黍(prosomillet)(Panicummiliaceum)、狐尾稷(Setariaitalica)、龙爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypiumbarbadense)、陆地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、叻口啡(咖啡属种类(Coffeaspp·))、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘树(柑橘属种类(Citrusspp.))、可可豆(Theobromacacao)、荼(Camelliasinensis)、香蕉(色蕉属种类(Musaspp·))、鳄梨(Perseaamericana)、无花果(Ficuscasica)、番石植(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、撤揽(Oleaeuropaea)、番木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳大利亚坚果(Macadamiaintegrifolia)、杏(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、甘鹿(甘鹿属种类(Saccharumspp·))、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。蔬菜包括番煎(Lycopersiconesculentum)、萬苣(例如萬苣(Lactucasativa))、青豆(Phaseolusvulgaris)、利马豆(PhaseolusIimensis)、豌豆(Lathyrusspp·)、和黄瓜属(Cucumis)成员例如黄瓜(C.sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)、和甜瓜(C.melo)ο观赏植物包括杜鹽花(杜鹽属种类(Rhododendronspp·))、八仙花(Macrophyllahydrangea)、芙蓉(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(蔷薇属种类(Rosaspp·))、郁金香(郁金香属(Tulipaspp·))、水仙花(水仙属种类(Narcissusspp·))、矮牵牛花(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、猩猩木(Euphorbiapulcherrima)以及菊花。可以用于实施本发明的针叶树包括，例如，松树例如火炬松(Pinustaeda)、沼泽松(Pinuselliotii)、美国黄松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和福射松(Pinusradiata);花方萁松(Pseudotsugamenziesii);力口拿大铁杉(Tsugacanadensis)；西加云杉(Piceaglauca);红杉(Sequoiasempervirens);冷杉例如银冷杉(Abiesamabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea);和雪松例如北美乔桕(thujaplicata)和黄扁桕(Chamaecyparisnootkatensis)。在具体实施方案中，本发明的植物为农作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、大麦、稷、烟草等)。在其他实施方案中，玉米和大豆植物是最优的，仍然在其他实施方案中，玉米植物是最优的。其他目的植物包括提供目的种子的谷类植物，含油种子植物和豆科植物。目的种子包括谷类种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。含油种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆和豌豆。豆包括瓜尔豆、槐豆(locustbean)、胡芦巴、大豆、青刀豆(gardenbeans)、紅豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。VII1.使用方法
技术领域：
：本发明的方法包括控制害虫(即鳞翅目害虫，例如，草地贪夜蛾)的方法。所述方法包括给害虫喂食包含本发明沉默元件的组合物，其中，当被害虫(即鳞翅目害虫，例如，草地贪夜蛾)摄食后，所述沉默元件降低害虫靶多核苷酸的水平，因此控制害虫。可以通过多种方法喂食害虫沉默元件。例如，在一个实施方案中，将包含沉默元件的多核苷酸引入植物。当鳞翅目进食表达这些序列的植物或其部分时，沉默元件被送递到害虫。当沉默元件以此方式送递给植物时，应当认识到，该沉默元件可以组成型表达，或可选地，它可以通过使用各种诱导型、组织优选或发育调节性启动子以阶段特异性的方式产生，上述启动子在本文其他部分讨论。在具体实施方案中，沉默元件表达在根、杆或茎、叶片包括叶梗、木质部和韧皮部、果实或生殖组织、丝、花和其中所有部分或其任意组合中表达。在另一个方法中，将包含本发明的至少一种沉默元件的组合物应用于植物。在这些实施方案中，沉默元件可以被配制在适合农艺学的和/或环境可接受的载体中，所述载体优先适合在田地中分散。此外，载体也可以包括能增加组合物半寿期的化合物。在具体实施方案中，包含沉默元件的组合物如此配制，即其在环境中持续的时间长度足以允许它被送递到害虫。在此类实施方案中，组合物可以被应用到害虫栖息的区域。在一个实施方案中，组合物被应用到植物外部(即通过农田喷雾)来保护植物免受害虫的危害。在某些实施方案中，为了产生具有所需的性状的植物，本发明的构建体可以与目的多核苷酸序列的任意组合叠加。本文使用的性状，是指来自一个特定序列或序列组的表型。例如，本发明的多核苷酸可以与编码具有杀害虫和/或杀昆虫活性多肽的多核苷酸的任何其他多核苷酸叠加，例如其他苏云金芽孢杆菌毒蛋白(描述于美国专利第5，366,892号、第5，747，450号、第5，737，514号、第5，723，756号、第5，593，881号和Geiseretal.(1986)Gene48:109中)、凝集素(VanDammeetal.(1994)PlantMol.Biol.24:825，pentin(描述于美国专利第5，981，722号中)等。所产生的组合可以包括任一目的多核苷酸的多重拷贝。本发明的多核苷酸也可以与任何其他基因或基因组合叠加，来产生具有很多所需的性状组合的植物，包括动物饲料的理想性状，例如高油基因(美国专利第6，232，529号)；平衡的氨基酸(例如hordothionins(例如美国专利第5，990，389号、第5,885,801号、第5，885，802号和第5，703，409号);大麦高赖氨酸(Williamsonetal.(1987)Eur.J.Biochem.165:99-106和WO98/20122)和高甲硫氨酸蛋白(Pedersenetal.(1986)J.Biol.Chem.261:6279；Kiriharaetal.(1988)Gene71:359和Musumuraetal.(1989)PlantMol.Biol.12:123));增强消化性(例如修饰的贮藏蛋白(美国申请序列第10/053,410号，2001年11月7日提交)和硫氧还蛋白(美国申请序列第10/005,429号，2001年12月3日提交))；以上公开在此通过引用并入。本发明的多核苷酸还可以与以下叠加抗病性或除草剂抗性所需的性状(例如伏马毒素解毒基因(美国专利第5，792，931号)；无毒性和抗病性基因(Jonesetal.(1994)Science266:789；Martinetal.(1993)Science262:1432；Mindrinosetal.(1994)Cell78:1089);导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂例如草胺磷或basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；和加工或工艺产品所需的性状，例如高油(例如美国专利第6，232，529号)；改良的油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利第5，952，544号；WO94/11516));改良的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE));和多聚体或生物塑料(例如美国专利第5，602,321号；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和乙酸乙酸辅酶A还原酶(Schubertetal.(1988)J.Bacteriol.170:5837-5847)促进聚轻基脂肪酸酯的表达(PHAs));以上公布在此通过引用并入。也可以将本发明的多核苷酸与提供农艺学性状的多核苷酸组合，所述农艺学性状例如雄性不育(例如，参阅美国专利第5.583，210号)、茎强度、开花时间或转化技术性状，例如细胞周期调节或基因打靶(例如WO99/61619、WO00/17364和W099/25821);以上公开在此通过引用并入。这些叠加的组合可以通过任何方法产生，包括但不限于通过任何常规或TopCross(顶交)方法学对植物进行杂交育种，或基因转化。如果序列是通过基因转化植物来叠加，那么目的多核苷酸序列可以在任何时间、以任何顺序进行组合。例如，包含一个或多个所需的性状的转基因植物可以用做通过随后转化引入其他性状的靶标。在共转化的方案中，性状可以用转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸同时引入。例如，如·果要引入两个序列，那么这两个序列可以包含在不同的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)中。序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可能希望引入可以抑制目的多核苷酸表达的转化盒。这可以通过与其他抑制盒或超表达盒的任意组合进行组合来在植物中产生所需的性状的组合。还应当认识到，多核苷酸序列可以使用位点特异性重组系统在希望的染色体位置叠加。参阅，例如，W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855和W099/25853，以上在此通过引用并入。还提供了允许增加沉默元件所产生的RNAi的方法和组合物。在这些实施方案中，该方法和组合物使用包含靶害虫序列的沉默元件的第一多核苷酸，所述沉默元件可操作地连接于在植物细胞中有活性的启动子；和包含抑制增强元件的第二多核苷酸，所述抑制增强元件包含靶害虫序列或者其活性变体或片段，并可操作地连接于在植物细胞中有活性的启动子。与只有沉默元件单独表达所达到的相比，沉默元件和抑制增强元件的联合表达导致了沉默元件所产生的抑制性RNA的扩增增强。除了增加具体RNAi种类自身的扩增以外，该方法和组合物还允许能增强干扰靶基因表达效率的RNAi种类的不同群体的产生。正如，当抑制增强元件在植物细胞中与沉默元件联合表达时，该方法和组合物允许在整个植物内系统地产生RNAi;与仅单独的沉默元件构建体相比，可以观察到更大量的RNAi的产生；和改善RNAi进入植物韧皮部的载入，因此，通过RNAi途径，对以韧皮部为食的昆虫，提供更好的控制。因此，提供的各种方法和组合物改善了将抑制性RNA送递到靶生物的方法。参阅，例如，2008年I月17日提交的美国临时申请第61/021，676号，名称"CompositionsandMethodsfortheSuppressionofTargetPolynucleotides(抑制祀多核苷酸的组合物和方法)〃，在此通过引用整体地并入。本文所用的“抑制增强元件”包含多核苷酸，该多核苷酸包含待抑制的靶序列或者其活性片段或变体。应当认识到，抑制增强元件不需要与靶序列相同，相反地，抑制增强元件可以包含靶序列的变体，只要抑制增强元件与靶序列具有足够的序列同一性，从而允许与只有沉默元件的表达所达到的相比，沉默元件所产生的RNAi的水平增加。相似地，抑制增强元件可以包含靶序列的片段，其中该片段具有足够长度，从而允许与只有沉默元件的表达所达到的相比，沉默元件所产生的RNAi的水平增加。因此，在具体实施方案中，抑制增强元件包含可以编码以下的多核苷酸的片段或变体保幼激素多肽、液泡多肽、钙粘着蛋白多肽、表皮多肽、翻译起始因子、SARl多肽、延伸因子、磷酸寡糖、肌球蛋白多肽、钾通道氨基酸转运蛋白、内向整流钾通道多肽、氨基酸转运蛋白、微管蛋白多肽、泛素多肽和小核核糖核蛋白；或者本文所公开的其他任何目的多核苷酸。仍然在其他实施方案中，抑制增强元件包含SEQIDNO:1-50所示的多核苷酸或者其活性变体或片段。应当认识到，可以使用来自相同靶序列或不同靶序列或相同靶序列的不同区域的多重抑制增强元件。例如，所用的抑制增强元件可以包含来自靶序列的不同区域(即，3’UTR、编码区、内含子和/或5’URT)的靶序列片段。此外，抑制增强元件可以如本文其他部分所述包含在表达盒内，在具体实施方案中，抑制增强元件是在相同或不同的DNA载体或构建体上作为沉默元件。抑制增强元件可以可操作地连接于本文公开的启动子。应当意识到，抑制增强元件可以组成型表达，或可选地，它可以通过使用各种诱导型、组织优选或发育调节性启动子，以阶段特异性的方式产生，上述启动子在本文其他部分做了讨论。在具体实施方案中，使用沉默元件和抑制增强元件两者时，RNAi的系统性产生发生在整个植物中。在其他实施方案中，与只有沉默元件构建体单独表达所观察到的相比，本发明的植物或植物部分改善RNAi进入植物韧皮部的载入，因此，通过RNAi途径，对以韧皮部为食的昆虫，提供更好的控制。在具体实施方案中，本发明的植物、植物部分和植物细胞的特征还可以是，允许能增强干扰靶基因表达效果的多样性的RNAi种类的产生。在具体实施方案中，与只有沉默元件单独表达时所达到的相比，沉默元件和抑制增强元件的联合表达增加了植物细胞、植物、植物部分、植物组织或韧皮部的抑制性RNA的浓度。本文使用的“抑制性RNA水平增加(increasedlevelofinhibitoryRNA)”包括，与与合适的对照植物相比，在具有联合表达的植物中所产生的RNAi的水平统计学上显著增加。例如，植物、植物部分或植物细胞中RNAi水平增加包括，与合适的对照相比，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部内RNAi水平增加至少约1%、约1%-5%、约5%-10%、约10%_20%、约20%-30%、约30%-40%、约40%-50%、约50%_60%、约60-70%、约70%_80%、约80%_90%、约90%-100%或更高。在其他实施方案中，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部内RNAi水平增加包括，与合适的对照相比，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部内RNAi水平增加至少约I倍、约I倍_5倍、约5倍-10倍、约10倍-20倍、约20倍-30倍、约30倍-40倍、约40倍-50倍、约50倍-60倍、约60倍-70倍、约70倍-80倍、约80倍-90倍、约90倍-100倍或更高。检测RNAi水平增加的方法在本文其他部分进行了讨论。以举例说明而非限制的方式，提供下列实施例。实施例实施例1.特异件靶基因和导致对草地含夜蛾的杀虫活件的沉默元件通过RNAi干扰昆虫基因功能可以产生针对于靶昆虫的特异性活性。通过经由转基因植物送递dsRNA，该特异性得到增强。通过RNAi进行昆虫内基因功能的确定，很大程度上受到dsRNA注射的限制。事实上，过去的实验已经表明，在dsRNAs暴露的基础上，昆虫不能够产生系统性RNAi应答。正如下文描述，我们通过注射实验证实了很多dsRNA对的急性活性，此外通过dsRNAs摄食证实了昆虫拮抗作用。该证据鉴别出几个具有明确杀虫性质的基因/引物对组合。在转基因植物中dsRNAs的使用也指明了异源性蛋白表达的潜在并发症和过敏反应、非靶向活性、环境累积和生物累积的可能风险。下文展示的数据表示在整个生物内干扰这些具体基因导致杀虫活性的第一次测试，和dsRNAs针对草地贪夜蛾的杀虫活性的第一次报道。本发明描述了具体的靶基因和dsRNA序列，该dsRNA序列通过对靶基因表达进行RNA干扰产生针对于鳞翅目草地贪夜蛾的杀虫活性。对dsRNA序列所靶向的基因进行干扰，可以在很多物种中具有广泛的杀虫活性。具体的dsRNA序列通过摄食展示杀虫活性，且可以与转基因植物送递模型一起使用。表I提供了来自草地贪夜蛾的靶序列的非限制性实例的多核苷酸、靶序列编码的蛋白功能的简要描述和SEQIDNO。表2提供了用于抑制靶多核苷酸的引物的概述。表1.草地贪夜蛾的靶多核苷酸权利要求1.产生植物的方法，其中所述植物包含植物细胞，所述植物细胞具有稳定并入其基因组的异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含沉默元件，其中所述沉默元件包含SEQIDNO:16的至少20个连续核苷酸的片段，其中，当被鳞翅目害虫摄食后，所述沉默元件降低所述害虫中靶序列的水平，由此控制所述鳞翅目害虫。2.如权利要求1所述的方法，其中所述害虫包括草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)。3.如权利要求1所述的方法，其中所述沉默元件包括a)包含SEQIDNO:183所示序列的有义或反义序列的多核苷酸；b)包含与SEQIDNO:183所示序列具有至少95%序列同一性的序列的有义或反义序列的多核苷酸。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述沉默元件包含发夹RNA。5.如权利要求4所述的方法，其中所述包含沉默元件的多核苷酸按以下顺序包含第一节段、第二节段和第三节段，其中a)所述第一节段包含与SEQIDNOS:16所示的靶序列具有至少90%的序列互补性的至少约20个核苷酸；b)所述第二节段包含允许所述沉默元件转录为发夹RNA的足够长度的环；c)所述第三节段包含与所述第一节段具有至少85%互补性的至少约20个核苷酸。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述沉默元件可操作地连接于异源启动子上。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述植物细胞具有稳定并入其基因组的包含抑制增强元件的第二多核苷酸，所述抑制增强元件包含靶害虫序列或者其活性变体或片段，其中所述沉默元件和所述抑制增强元件的联合表达，在所述植物细胞中增加对害虫靶序列具有特异性的抑制性RNAi的浓度。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。9.如权利要求8所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、大麦、稷、小麦或水稻。10.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。11.如权利要求10所述的方法，其中所述双子叶植物是大豆、卡诺拉(canola)、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥(Arabidopsis)或棉花。12.如权利要求7所述的方法，其中所述沉默元件和所述抑制增强元件的联合表达，在所述植物的韧皮部中增加对害虫靶序列具有特异性的抑制性RNAi的浓度。13.控制鳞翅目的方法，该方法包括给鳞翅目喂食含有沉默元件的组合物，其中，当被所述鳞翅目摄食后，所述沉默元件降低靶鳞翅目序列的水平，由此控制所述鳞翅目，所述沉默元件包含SEQIDNO:16中至少20个连续核苷酸的片段。14.如权利要求13所述的方法，其中所述组合物包含植物或植物部分，所述植物或植物部分具有稳定并入其基因组的包含所述沉默元件的多核苷酸。15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述害虫包括草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)。16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述沉默元件包括a)包含SEQIDNO:183所示序列的有义或反义序列的多核苷酸；b)包含与SEQIDNO:183所示序列具有至少95%序列同一性的序列的有义或反义序列的多核苷酸。17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述沉默元件含发夹RNA。18.如权利要求17所述的方法，其中所述包含沉默元件的多核苷酸按以下顺序包含第一节段、第二节段和第三节段，其中a)所述第一节段包含与靶多核苷酸具有至少90%的序列互补性的至少约20个核苷酸；b)所述第二节段包含允许所述沉默元件转录为发夹RNA的足够长度的环；c)所述第三节段包含与所述第一节段具有至少85%互补性的至少约20个核苷酸。19.如权利要求13-18中任一项所述的方法，其中所述沉默元件操作地连接于异源启动子上。20.如权利要求14-19中任一项所述的方法，其中所述植物或植部分具有稳定并入其基因组的包含抑制增强元件的第二多核苷酸，所述抑制增强子包含靶害虫序列或者其活性变体或片段，其中，所述沉默元件和所述抑制增强元件的联合表达，在所述植物细胞中增加对害虫靶序列具有特异性的抑制性RNAi的浓度。21.如权利要求13-20中任一项所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。22.如权利要求21所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、大麦、稷、小麦或水稻。23.如权利要求13-20中任一项所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。24.如权利要求23所述的方法，其中所述植物是大豆、卡诺拉(canola)、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥(Arabidopsis)或棉花。全文摘要本发明提供了使用沉默元件的方法和组合物，当该组合物被害虫例如鳞翅目害虫摄食后，它们能降低该害虫内靶序列的表达。在具体实施方案中，降低靶序列的表达可以控制害虫，因此，该方法和组合物能限制对植物的损害。本发明提供了编码具体蛋白质家族的多肽的靶多核苷酸和SEQIDNOS:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所示的各种靶多核苷酸或其活性变体和片段，其中降低靶害虫内一种或多种序列的表达可以控制害虫(具有杀虫活性)。还提供了沉默元件，当被害虫摄食后，该沉默元件降低靶多肽的水平，从而控制虫害。在具体实施方案中，害虫为草地贪夜蛾。本发明亦提供了包含沉默元件或其活性变体及其片段的植物整体、植物部分、细菌及其他宿主细胞。文档编号C12N15/113GK102994543SQ201210159330公开日2013年3月27日申请日期2009年1月15日优先权日2008年1月17日发明者拉斐尔·赫尔曼,迈克尔·拉斯纳尔,卢伟柏,马克·纳尔桑,詹姆士·K·普莱斯奈尔,珍妮特·A·赖斯申请人:先锋国际良种公司,纳幕尔杜邦公司