专利名称：一种用于同源重组的自转运载体及其构建的经粘膜免疫疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于宫颈癌预防疫苗技术领域，涉及一种用于同源重组的自转运载体及其构建的经粘膜免疫疫苗。
背景技术：
由于多数微生物感染发生在粘膜，机体在粘膜免疫组织诱导产生保护性体液免疫和细胞免疫反应，通过非粘膜免疫途径的疫苗难以诱导有效的粘膜免疫反应，理想的 粘膜系统保护性抗原运输载体的研究成为疫苗研究中的重点。已有报道利用减毒肠道或肠道相关组织生长繁殖的细菌和病毒，能够较有效地刺激局部和系统免疫反应。如应用减毒沙门氏菌体作为载体菌，表达外源保护性抗原，但尚不足以解决外源基因的稳定性和载体安全性问题。宫颈癌是世界范围内仅次于乳腺癌的妇女恶性肿瘤，临床和分子流行病学研究已经证实高危型人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌和宫颈不典型增生的主要始动因子，90%以上的宫颈癌标本中可捡出HPV，其中HPV16占50%以上，其余部分主要与HPV18、31、45有关；HPV6U1为尖锐湿疣等良性肛生殖区粘膜增生性病变的主要病因，因此，预防HPV感染是降低宫颈癌及其它HPV相关性肿瘤的最为适宜的策略，而应用HPV疫苗是预防HPV感染的最佳途径。目前HPV预防性疫苗的研究主要集中于基因工程病毒样颗粒(virus-likeparticles VLP)疫苗。但是由于种种内在缺陷，基于减毒活细菌载体的HPV疫苗作为最具代表性的第二代疫苗越来越多地受到了研究者们的青睐。首先，相对简单的制备过程和运输过程大大降低了疫苗生产和使用成本，与VLP疫苗高昂的接种费用相比，更有可能在包括中国在内的发展中国家里推广；其次，与VLP疫苗的肌肉注射免疫相比，经口或者其他粘膜免疫途径的非侵入式免疫途径更容易被以青少年为主的免疫人群所接受。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种用于同源重组的自转运载体及其构建的经粘膜免疫疫苗，将外源HPV的抗原蛋白整合入肠道菌自转运蛋白中实现抗原基因在载体基因组中的稳定存在和抗原的表面递呈，从而开发能够诱导有效粘膜免疫反应的疫苗。本发明是通过以下技术方案来实现一种用于同源重组的icsA自转运载体，包括NI-外源序列-C2的基因片段，其中NI为表达IcsA的氨基酸转膜信号肽的NI序列，C2为表达IcsA羧基端β区域的C2序列，NI序列和C2序列之间为表达外源性抗原的序列；N1序列、C2序列的上游和下游均设有同源序列。所述的NI序列的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；C2序列的核苷酸序列如SEQ.ID. NO. 2 所示。
所述的外源性序列为HPV16 LI的基因序列。所述的NI序列与HPV16 LI之间设有同源序列ctagaactat gagcct, HPV16L1与C2序列之间设有同源序列ggaagctgag tactat ；N1序列的前端还设有同源序列cggtacccggggatc, C2序列的后端还设有同源序列gatcctctag agtcg。所述的NI-外源序列-C2的基因片段克隆于PUC19载体的多克隆位点之间，构成pUC19-icsA-Ll 载体；或者克隆于PJCB12载体的多克隆位点之间，构成pJCB12-icsA-Ll载体。一种基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，以具有自转运蛋白穿膜运载体系的革兰氏阴性肠道菌作为宿主细胞，通过同源重组，将自转运蛋白基因的表达氨基酸转膜信号肽与羧基端转膜区域之间的表达功能蛋白的序列替换为表达外源性抗原的序列；所述的革兰氏阴性肠道菌包括志贺氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和霍乱弧菌。 所述的宿主细胞为野生型宋氏志贺氏杆菌，通过同源重组，将HPV16 LI基因序列替代icsA基因中第863 1518bp的序列。所述的HPV16 LI基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，而IcsA基因中第863 1518bp的序列表达IcsA蛋白的第105 506位氨基酸的α结构域。所述的同源重组为以电穿孔方式转化有口兀812-化84-1^1载体的5] 10入？化作为同源重组供体菌；所述的pJCB12-icsA-Ll载体是将N1-HPV16 L1-C2的基因片段克隆于pJCB12载体的多克隆位点之间，NI序列与HPV16 LI之间设有同源序列ctagaactat gagcct,HPV16 LI与C2序列之间设有同源序列ggaagctgag tactat ；N1序列的前端还设有同源序列cggtacccgg ggatc,C2序列的后端还设有同源序列gatcctctag agtcg ；以具有链霉素抗性的野生型志贺氏杆菌作为同源重组受体菌；将同源重组供体菌与同源重组受体菌混合后，在LB琼脂平板上于37°C培养箱中培养12 16，使同源重组供体菌与同源重组受体菌之间充分发生接合，进而发生第一次同源重组，使PJCB12载体整合进入志贺氏杆菌基因组中；筛选第一次同源重组的阳性菌落后，以5%蔗糖为选择压力诱导第二次同源重组，剔除其余载体而保留两侧同源序列之间的HPV16 LI基因序列，使HPV16 LI基因整合进入icsA基因，替代转膜信号肽与羧基端转膜区域之间的序列。所述的基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗在制备抗宫颈癌药物或疫苗中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的基于同源序列的IcsA自转运载体，以表达IcsA的氨基酸转膜信号肽的NI序列、表达IcsA羧基端的β区域的C2序列作为同源臂，可应用于针对志贺氏杆菌icsA进行同源重组的供体载体。IcsA作为志贺菌的主要毒性因子，具有独特的自转运功能。其氨基端52个氨基酸为基于Sec系统的转膜信号肽，负责将整个蛋白以多肽形式转运穿过细菌内膜至质周腔；羧基端的β domain (IcsA758_11(i2)可以在细菌外膜形成小孔结构，使得蛋白的功能区a domain (IcsA53_757)穿过外膜至细菌表面,集中分布在细菌的非分裂端,募集宿主细胞肌动蛋白为其在细胞内的运动和细胞间播散提供动力。利用IcsA的这一特性，IcsA将其a domain通过基因操作替换为外源保护性抗原蛋白，实现外源病毒蛋白在在细菌中的稳定表达和表面递呈。本发明提供的自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，首次开发了肠道菌自转运蛋白作为HPV抗原的载体。利用基因重组技术实现了外源基因在载体细菌基因组中的稳定存在。现有基于活细菌载体的疫苗研究多使用质粒载体，但是在体接种后，由于缺乏抗生素选择压力，质粒很容易迅速丢失从而严重影响外源抗原的表达和免疫效果；而自转运机制可以将嵌入其中的外源抗原在不耗能的情况下转运至细菌表面，或连接其上或自然脱落，这两种形式都最大可能地实现抗原暴露，从而更有可能激发强烈的免疫反应。本发明提供的自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，以重组后减毒的人肠道致病菌为载体，经粘膜免疫，可同时激发系统免疫反应和粘膜免疫反应。在体动物实验表明，这些重组的减毒志贺杆菌经粘膜免疫可以有效地激发血清中HPV16 LI特异性IgG的产生，脾脏内出现高频数的HPV16 LI特异性抗体分泌细胞。
图I为环状质粒结构pUC19-icsA_Ll的质粒图谱；图2为重组pJCB12-icsA_Ll质粒的质粒图谱；图3为pJCB12-icsA-Ll载体的酶切鉴定结果；1、2为Sal I酶切后的重组质粒，经Sal I酶切后,可见3. Ikb和4. Ikb两条DNA条带；3为DNA marker (具体大小见图所示)图4为两次同源重组交叉互换示意图；图5为第二次同源重组后阳性克隆的抗性表型；图6为重组志贺杆菌阳性克隆的菌落PCR鉴定结果；图7为重组志贺杆菌阳性克隆的Western印迹检测结果；图8-1 8-2为重组志贺杆菌疫苗动物后的脾脏淋巴细胞中特异性抗体分泌细胞数和抗体滴度的免疫效果。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。I、自转运蛋白IcsA的选择IcsA为分子量120kD的外膜蛋白，编码于220kb的毒性质粒，是志贺菌胞间传播的最重要推动因子，作为外膜蛋白自转运家族的成员，IcsA可以介导其自身的穿膜和表面呈现。与其他自转运蛋白类似，IcsA有三个结构和功能区域氨基端的52个氨基酸(IcsAu)为信号肽，介导整个蛋白通过Sec系统转运穿过细菌内膜；接下来的α结构域(Ics53_757)是蛋白的主要功能域，当呈现于细菌非分裂段表面后，可以募集肌动蛋白，推动细菌的胞内运动和胞间感染；IcsA的胞外区α结构域也有两个亚区域构成Ν端区域主要承担活性，而被称为“自陪伴”区域的C端区虽然不是转运必须的，但是可以通过稳定β桶性小孔和提高功能区域的折叠效率来增加转运效率；α结构域的转运通过外膜主要借助于羧基端的β结构域(IcsA758_11(l2), β结构域有两个亚区域构成，羧基端约300氨基酸残基会形成β-桶形小孔结构插入细菌外膜，之前的25个氨基酸形成的α螺旋结构形成连接域引导α结构域通过小孔转运至细菌表面。当α结构域被转运至细菌表面后，IcsA分子被其蛋白酶IcsP于SSRRASS位点的Arg758和Arg759之间切割，该位点也是α和β结构域的连接点，IcsP的切割并不是完全的，切割下来的α结构域(IcsA53_757 )会被从细菌表面释放或者与全长蛋白(IcsA53_11(i2)和β结构域(IcsA758_11Q2) —起依然连接于细菌表面。与其他自转运蛋白不同的是，IcsA在细菌外膜表面呈现不对称分布，主要集中于细菌的非分裂端，这种极性分布的产生和维持对于细菌毒性来说是必须的。在志贺杆菌上实现对自转运蛋白IcsA的改造将其胞外区替换为外源抗原蛋白，实现外源抗原基因在细菌基因组中的稳定存在，IcsA自转运机制可以携带外源性抗原递呈于常见的革兰氏阴性细菌表面，获得更优的免疫效果。改造后的IcsA突变株无法在细胞间播散，不能在空斑实验中形成空斑，也不能引发豚鼠的角膜炎。
具体给出了以志贺杆菌自转运蛋白IcsA递呈HPV16 LI蛋白的实施例，当然，外源蛋白并不限于HPV16 LI。2、外源性蛋白的选择研究表明，在HPV免疫中起到中和病毒效应的抗体都是针对的病毒主要衣壳蛋白LI的，LI的抗原表位具有高度的构象依赖性，如何将LI蛋白以天然构象有效地递呈给免疫系统就成了 HPV疫苗研发中的核心问题。具体选取HPV16这一研究最为广泛的病毒型别为例，说明志贺杆菌自转体系在递呈外源性抗原的实施效果。3、基于肠道菌自转运载体的构建通过PCR分子克隆的技术手段，分别通过PCR得到以下3段DNA片段icsA 基因上游 550bp 至基因内部 312bp (共 862bp, SEQ. ID. NO. I 所示)；HPV16 LI 完整基因(SEQ. ID. NO. 2 所示)；icsA 基因内部 1519-3306bp (SEQ. ID. NO. 3 所示)；以及酶切得到线性化PUC19载体(Sal I酶切)；然后利用Clontech 公司的 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit 试剂盒通过相邻两段之间15bp的用于同源重组的同源序列在无需内切酶的情况下无缝连接(具体操作按照该试剂盒产品说明书进行)形成环状质粒结构pUC19-icsA-Ll (其质量图谱如图I所示)，所述的顺序首尾连接的连接点及同源序列(可通过PCR扩增手段引入)分别为①pUC19 与 NI 序列间CGGTACCCGGGGATC ；②NI 序列与 HPV16 LI 间CTAGAACTATGAGCCT ；③HPV16 LI 与 C2 序列间GGAAGCTGAGTACTAT ；④C2 序列与 pUC19 间GATCCTCTAGAGTCG。在环状质粒pUC19_icsA_Ll构建成功后,利用蓝白斑筛选机制在大肠杆菌Dh5 α中进行筛选并扩增。4、同源重组供体菌的构建取pJCB12载体，环状质粒pUC19-icsA_Ll,选择合适的酶切位点(具体选择Sal I )，分别经限制性内切酶消化，回收酶切目的基因片段N1-L1-C2和pJCB12载体，经T4DNA连接酶在16°C下行连接反应，得到带有重组基因片段的质粒pJCB12-icsA-Ll，其质量图谱如图2所示；将pJCB12-icsA_Ll以电穿孔方式转化进入SMlO λ pir中行进保存复制，提取质粒并对pJCB12-icsA-Ll进行酶切鉴定，鉴定结果如图3所示；将质粒鉴定正确的菌体作为同源重组供体菌(donor strain)。5、同源重组受体菌的筛选取野生型宋氏志贺氏杆菌(惠赠于苏格兰沙门氏菌和志贺氏菌参考实验室，Scottish Salmonella and Shigella Reference Laboratory)培养在含0. 01%刚果红染料TSA (Tryptic Soy agar TSA)培养板上,37 过夜,挑取红色菌落,接种于TSB (Tryptic SoyBroth TSB)培养基中37°C振摇培养至适合浓度。为了便于后期筛选，挑取经过浓度梯度筛选出的天然的链霉素抗性的宋氏志贺菌菌落作为同源重组受体菌(recipient strain)。 6、疫苗的构建供体菌(氯霉素)和受体菌(链霉素)在含相应抗生素的培养基中培养至对数生长期中后期(0D600=0.8)，分别温和离心收集后用37°C预热的新鲜培养基温和重悬洗涤两次，受体菌和供体菌等体积混合成浓稠菌液滴至无抗生素的LB琼脂平板上，小心置于37°C培养箱过夜培养(12-16小时)使供体菌和受体菌之间充分发生接合(conjungation)进而发生第一次同源重组的交叉互换(the first crossover)；参见图4，第一次同源重组的交叉互换的位置可以是NI或者C2序列当中任意一个位点。第一次交叉互换发生后，自杀载体(PJCB12载体)被其所携带的志贺杆菌同源序列(NI或者C2序列)整合进入志贺菌基因组中，此时受体菌表现为链霉素与氯霉素双重抗性，完成接合的细菌会在含有链霉素和氯霉素的培养琼脂上形成菌落，作为第一步筛选的阳性菌落，经过PCR鉴定为阳性后，以5%蔗糖为选择压力诱导第二次同源重组的交叉互换(thesecond crossover)发生。pJCB12载体中的sacB基因的表达使得含有此基因的革兰氏阴性细菌在低温培养中(30°C)将蔗糖代谢为致死性产物从而无法在含有蔗糖的培养基中存活，由于重组PJCB12载体在第一次交叉互换后全部整合进入志贺菌基因组，sacB基因也进入志贺菌基因组中，在5%蔗糖的选择压力下，绝大部分细菌无法存活，但是同时会诱发极少数细菌在另外一侧同源序列上发生第二次交叉互换(the second crossover),剔除载体本身而保留两侧同源序列之间的HPV16 LI基因序列，使得该外源病毒蛋白(指HPV16)稳定整合进入志贺菌IcsA中替代了原来的105-506位氨基酸序列；具体如图4所示，第二次有效的交叉互换的位置为第一次交叉互换位置的对侧，如第一次交叉互换发生于NI序列内，那么第二次有效的交叉互换则发生于C2序列内；反之亦然。第二次同源重组发生后，志贺菌的抗性发生明显改变，由于自杀载体序列的剔除，使得氯霉素抗性消失，而对蔗糖的抗性重新出现，最终阳性菌落表现为在链霉素和蔗糖抗性，而无法在含氯霉素的培养琼脂上形成菌落，第二次同源重组后阳性克隆的抗性表型如图5所示，图中箭头所示为阳性克隆。挑取阳性表型的克隆菌落，接种于TSB培养基中，37°C振摇至对数生长的中期，收获细菌，经PCR和测序鉴定后，行Western印迹检测目的蛋白表达(一抗为小鼠抗HPV16 LI单克隆抗体，二抗为DAKO Envision辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠抗体),选取阳性菌落进行在体动物实验。PCR检测HPV16L1基因结果如图6所示，其中I为野生型志贺杆菌阴性对照；2_6为抗性表型为阳性的五个菌落；7为DNA marker ;可以看到表型为阳性的五个菌落均检测到了 1500bp目的基因，而阴性对照未检测到目的基因，测序检测结果表明HPV16L1插入到了预定的位点之间。Western印迹检测如图7所示，1、4，野生型志贺杆菌阴性对照；2，蛋白分子量标准；3，PCR阳性菌落；检测结果表明PCR阳性菌落中的目的基因得到表达(即可表达HPV16LI蛋白)。7、动物模型实验这样就以贺氏杆菌为载体，借助其自转运蛋白的表面递呈机制，以自杀载体介导的同源重组技术将目的抗原(如HPV16L1)的编码基因整合入载体细菌基因组稳定存在和表 达，使其表达目的蛋白，以其作为疫苗，经口服(或经鼻吸入)带有目的基因的减毒载体菌，可进入肠上皮细胞(鼻腔粘膜相关淋巴样组织)、M细胞，表达的目的蛋白可刺激粘膜免疫反应，使免疫细胞产生特异性IgG和分泌型IgA，保护粘膜上皮不受相应病毒(如HPV16)的侵袭，从而达到预防HPV相关疾病特别是宫颈癌的目的。下面将该疫苗免疫动物模型，并观察其免疫效果。选6 8周雌性白化豚鼠，体重200 250g，专用动物房饲养，随机分为空白对照组和实验组，每组4只。分别将PBS和重组志贺杆菌疫苗接种豚鼠结膜囊，接种菌量约5 X IO8 I X IO9CFU/次，共免疫2次，每次间隔2周。第二次免疫后6周，分别留取动物血清和阴道粘膜冲洗液；摘取动物脾脏。ELISA法检测血清中和粘膜冲洗液抗HPV16 VLP IgG水平，ELISP0T分析脾脏中特异性抗体分泌细胞的频数。脾脏中特异性抗体分泌细胞的频数的检测结果如图8-1所示，可以看到重组贺氏杆菌疫苗所刺激产生的HPV16 VLP特异性抗体分泌细胞的频数显著升高，远超过阴性对照，具有非常显著的差异。血清和阴道分泌物中抗HPV16 VLP IgG水平的检测结果如图8_2所示，可以看到，血清和阴道分泌物中都检测到特异性抗体。动物实验结果表明，重组的志贺杆菌疫苗可以有效地激发针对HPV16 LI的特异性免疫反应，可应用于宫颈癌的防治。
权利要求
1.一种用于同源重组的icsA自转运载体，其特征在于，包括NI-外源序列-C2的基因片段，其中NI为表达IcsA的氨基酸转膜信号肽的NI序列，C2为表达IcsA羧基端β区域的C2序列，NI序列和C2序列之间为表达外源性抗原的序列；N1序列、C2序列的上游和下游均设有同源序列。
2.如权利要求I所述的用于同源重组的icsA自转运载体，其特征在于，所述的NI序列的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；C2序列的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.如权利要求I所述的用于同源重组的icsA自转运载体，其特征在于，所述的外源性序列为HPV16 LI的基因序列。
4.如权利要求3所述的用于同源重组的icsA自转运载体，其特征在于，所述的NI序列与HPV16 LI之间设有同源序列ctagaactat gagcct, HPV16 LI与C2序列之间设有同源序列ggaagctgag tactat ；N1序列的前端还设有同源序列cggtacccgg ggatc, C2序列的后端还设有同源序列gatcctctag agtcgo
5.如权利要求I所述的用于同源重组的icsA自转运载体，其特征在于，所述的NI-外源序列-C2的基因片段克隆于pUC19载体的多克隆位点之间，构成pUC19-icsA-Ll载体； 或者克隆于PJCB12载体的多克隆位点之间，构成pJCB12-icsA-Ll载体。
6.一种基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，其特征在于，以具有自转运蛋白穿膜运载体系的革兰氏阴性肠道菌作为宿主细胞，通过同源重组，将自转运蛋白基因的表达氨基酸转膜信号肽与羧基端转膜区域之间的表达功能蛋白的序列替换为表达外源性抗原的序列； 所述的革兰氏阴性肠道菌包括志贺氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和霍乱弧菌。
7.如权利要求6所述的基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，其特征在于，所述的宿主细胞为野生型宋氏志贺氏杆菌，通过同源重组，将HPV16 LI基因序列替代icsA基因中第863 1518bp的序列。
8.如权利要求6所述的基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，其特征在于，所述的HPV16 LI基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，而IcsA基因中第863 1518bp的序列表达IcsA蛋白的第105 506位氨基酸的α结构域。
9.如权利要求6所述的基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，其特征在于，所述的同源重组为 以电穿孔方式转化有pJCB12-icsA-Ll载体的SMlO λ pir作为同源重组供体菌；所述的pJCB12-icsA-Ll载体是将N1-HPV16 L1-C2的基因片段克隆于pJCB12载体的多克隆位点之间，NI序列与HPV16 LI之间设有同源序列ctagaactat gagcct, HPV16 LI与C2序列之间设有同源序列ggaagctgag tactat ；N1序列的前端还设有同源序列cggtacccgg ggatc, C2序列的后端还设有同源序列gatcctctag agtcg ； 以具有链霉素抗性的野生型志贺氏杆菌作为同源重组受体菌； 将同源重组供体菌与同源重组受体菌混合后，在LB琼脂平板上于37°C培养箱中培养12 16，使同源重组供体菌与同源重组受体菌之间充分发生接合，进而发生第一次同源重组，使PJCB12载体整合进入志贺氏杆菌基因组中； 筛选第一次同源重组的阳性菌落后，以5%蔗糖为选择压力诱导第二次同源重组，剔除其余载体而保留两侧同源序列之间的HPV16 LI基因序列，使HPV16 LI基因整合进入icsA基因，替代转膜信号肽与羧基端转膜区域之间的序列。
10.权利要求7所述的基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗在制备抗宫颈癌的药物或疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于同源重组的自转运载体及其构建的经粘膜免疫疫苗，以表达IcsA的氨基酸转膜信号肽的N1序列、表达IcsA羧基端的β区域的C2序列作为同源臂，可应用于针对志贺氏杆菌icsA进行同源重组的供体载体。将外源HPV的抗原蛋白整合入肠道菌自转运蛋白中实现抗原基因在载体基因组中的稳定存在和抗原的表面递呈，从而开发能够诱导有效粘膜免疫反应的疫苗，可同时激发系统免疫反应和粘膜免疫反应。经重组的减毒志贺杆菌经粘膜免疫可以有效地激发血清中HPV16 L1特异性IgG的产生，脾脏内出现高频数的HPV16 L1特异性抗体分泌细胞。
文档编号C12N15/09GK102787134SQ20121025337
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月20日 优先权日2012年7月20日
发明者于军, 杨筱凤, 王一理, 许丹 申请人:西安交通大学