专利名称：一种纯天然、低成本的植物乳杆菌st-ⅲ培养方法及其产品和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于发酵食品领域，特别涉及一种纯天然、低成本的植物乳杆菌ST-III培养方法及其产品和应用。
背景技术：
番爺(Solanum Iycopersicum),又名西红柿、洋柿子,原产于美洲地区，因其鲜艳的色泽、丰富的营养而被作为食用蔬果全球性地广泛种植。然而，番茄种植的季节性很强，收获期又短，导致上市相对集中，皮薄汁多、营养丰富的特点使其难以长期贮藏。为了随时随地满足消费者对番茄产品的需求，番茄酱、番茄粉等番茄初加工制品被开发并推向市场，虽然保留了大部分番茄风味，但此类番茄制品只在产品形式上加以改换，并未对番茄的保 健功能等方面进行深层次的挖掘。随着生活水平的日益提高，人们越来越注重健康与养生，在这种理念的推动下，番茄的深加工技术得到了长足的进步，拥有特殊化学结构、具有抗衰老、调控肿瘤、预防癌症等功效的番茄红素(Lycopene)，来自番茄皮、可改善肠道生态环境的番茄膳食纤维，临床上用于消炎、抗病毒、增加免疫力的番茄S0D，以及成本低廉、口感舒适、高附加值的番茄汁发酵饮料都是番茄深加工技术的代表产物。其中，番茄汁发酵饮料具有低成本、高附加值、成分天然、无毒副作用等优点，因此被越来越多的消费者接受。研究表明，乳酸菌可以使肠道菌群的构成发生有益变化，抑制腐败菌的繁殖，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，并消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾，维护人体健康。其次，乳酸菌的发酵代谢产物能减轻胃酸分泌，并且对肠壁神经有良好的刺激作用，能促进人体消化酶的分泌和肠道的蠕动，从而促进对蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收利用，并预防便泌。另外，乳酸菌在改善乳糖不耐、降血脂、降血压、增强人体免疫力和抵抗力、抗衰老、抗肿瘤等方面都起着积极作用。因此，通过乳酸菌发酵番茄汁的方式将乳酸菌发酵技术与番茄深加工技术有机地结合起来，在保留番茄汁营养成分的同时，更增加了具有保健功能的乳酸菌及其代谢产物，令番茄汁发酵产物的营养成分与保健功效相得益彰。K. Y. Yoon (J. Microbiol. 42 :315-318,2004)研究了嗜酸乳杆菌 LA39、植物乳杆菌C3、干酪乳杆菌A4以及德氏乳杆菌D7在纯番茄汁中的发酵特性，结果表明，30°C培养72小时(h)后获得的发酵液活菌数可以达到108cfu/mL(每毫升菌落形成单位)。由于纯番茄汁pH在4. 20 4. 30，低pH的发酵条件明显延长了菌种的发酵周期，生产周期过于冗长成为乳酸菌番茄汁发酵饮料工业化的最大瓶颈。为了提高乳酸菌的发酵效率，研究人员用Na2C03、NaHCO3等碱液调节番茄汁pH来减少发酵初始液低PH对发酵周期的影响。孟祥敏(食品工业.2 =29-31,2005)在已预调pH的番茄汁中等比例接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，40°C恒温培养32h后获得的发酵液中乳酸含量最高可达O. 84%刘进杰(食品工业科技.7 :176-181，2008)运用包埋的乳酸菌发酵预调PH的番茄汁，经测定乳酸菌在pH5. 00的番茄汁中33°C恒温培养36h的产酸水平最高。上述实验证明，调节番茄汁pH对缩短发酵工艺周期效果显著，但在酸碱中和过程中番茄汁营养成分被完全保留与否、是否有潜在的有害化合物生成，都存在不确定性，另外，调碱溶液的引入也增加了工业化生产的物料成本。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前用于发酵番茄汁的乳酸菌在低pH条件下发酵周期长，而且调节初始pH又可能引起生产成本增加和营养成分不确定的缺陷，提供一种具有在低PH条件下快速发酵番茄汁能力的乳酸菌的应用方法。本发明人发现将植物乳杆菌ST-III (Lb. plantarum CGMCC No. 0847)在纯番茄汁中可快速增殖，并在短时间内达到活菌数峰值，其发酵效果与实验室常用的MRS相当，但成本可降低75 %以上，从而完成了本发明。本发明的技术方案一是一种纯天然、低成本的植物乳杆菌ST-III的培养方法，包括以下步骤将植物乳杆菌ST-III接种于灭菌番茄汁培养基中进行培养，培养温度为 25 40°C，时间为2 48小时。本发明中，所述的番茄汁培养基是番茄果的汁液，番茄汁经灭菌后即可作为培养基，接种植物乳杆菌ST-III进行发酵培养。所述的番茄汁优选纯番茄汁。优选的，所述的番茄汁培养基由包括以下步骤的方法制备而得成熟番茄清洗，去皮，榨汁，过滤取汁，煮沸1-10分钟，4000-12000g离心1_30分钟，取上清，灭菌，冷却，即得。较佳的，所述的榨汁采用榨汁机压榨，所述的过滤采用100目纱布过滤，所述的灭菌是常规的灭菌方法，可以采用超高温瞬时灭菌，优选112_135°C 10-30分钟。所述的番茄汁培养基的制备方法的一较佳实例包括以下步骤将成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸5分钟，8000g离心10分钟取上清，121°C 20分钟灭菌，冷却至室温，即得增菌用途的纯番茄汁培养基。其中，所述的培养的培养条件可以是常规的植物乳杆菌ST-III的培养条件，一般的，发酵温度为25 40°C，优选37 40°C，最佳是37°C ;发酵时间是2 48h，优选8 IOh,最佳 8h ;接种量 O. 5%-5% (v/v),优选 2 %-4 % (v/v),最优选 2% (v/v)。本发明中，植物乳杆菌ST-III是现有技术，为CGMCC No. 0847。本发明的技术方案二是一种植物乳杆菌ST-III乳酸菌饮料，由以下包括以下步骤的方法制备而得将植物乳杆菌ST-III接种于灭菌番茄汁培养基中，25 40°C发酵2 48h，即得。其中，发酵温度为25 40°C，优选37 40°C，最佳是37°C。发酵时间是2 24h，优选 8 IOh,最佳 8h。接种量 O. 5%-4% (v/v),优选 2 %-4 % (v/v),最优选 2% (v/v)。所述番茄汁培养基如上所述。本发明的技术方案三是所述的植物乳杆菌ST-III乳酸菌饮料作为植物乳杆菌ST-III活菌制剂的用途。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下I、采用本发明培养植物乳杆菌ST-III的增殖效果与实验室常用培养基MRS相当，但获得相同数量ST-III活菌花费的成本可降低80%。
2、与目前乳酸菌番茄汁发酵研究进展相比，采用本发明可以在不调整番茄汁pH，避免引入不确定因素的同时，又明显缩短发酵时间，此外，低pH的生长环境也有利于控制发酵过程中染菌现象。3、市售活菌型乳酸菌饮料活菌总数在108cfu/mL左右，采用本发明制备的发酵液中每毫升菌落形成单位可达到109cfu/mL以上，以IOOmL产品为例，本发明制备的活菌型饮料中植物乳杆菌ST-III活菌总数可达1000亿以上，此外，植物乳杆菌ST-III耐酸性强，因此，本发明制备的乳酸菌发酵液被直接食用后，经过胃部低酸环境影响而最终在肠道发挥益生菌作用的活菌数比一般不耐酸的乳酸菌多，达到的保健效果更佳。4、本发明所涉及纯番茄汁培养基可以作为实验室替代MRS培养基、降低科研成本、获取植物乳杆菌ST-III菌体的培养手段来使用。5、采用本发明制备的发酵液可直接作为植物乳杆菌ST-III活菌制剂来使用。6、由于本发明采用的发酵基料为纯天然、无添加的番茄汁，因此，采用本发明制备 的发酵液可直接作为具有乳酸菌特定保健功能的饮料来食用。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图I显示37°C条件下，不同接种量的植物乳杆菌ST-III在番茄汁中的生长特性。图2显示在不同温度条件下，植物乳杆菌ST-III在番茄汁中的生长特性。图3显示不同菌株在番茄汁中的生长特性。图4显示37°C条件下，植物乳杆菌ST-HI在番茄汁增菌培养基和MRS培养基中的生长性能。图5显示植物乳杆菌ST-III纯番茄汁发酵液在不同温度下的保藏特性。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。 实施例I植物乳杆菌ST-111发酵番茄汁条件优化I)材料与方法种子(发酵菌种)的制备将L. PI an tar um ST-III (CGMCC No. 0847)、L. pi ant arumATCC 14917(从 ATCC 购买)、L. casei ATCC 393 (从 ATCC 购买)、L. bulgaricus LB-340 (由丹尼斯克公司提供)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于MRS固体培养基(Merck Co.德国)上，37°C厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入ImL MRS液体(Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37°C厌氧培养24h取出，以2% (v/v)接种量接种于50mL MRS液体，37°C培养24h后，培养物9，OOOrpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子(即工作发酵剂)。S. thermophilus ST-B0DY-3的发酵剂制备使用M17培养基(0X0ID，英国)取代MRS培养基，其他制备步骤与上述方法相同。纯番茄汁培养基的制备成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸5min，8000g离心IOmin取上清，121°C灭菌20min，冷却至室温，即得增菌用途的纯番茄
汁培养基。燕麦培养基的制备将燕麦粉(由超市购得)以5. 5% (w/v)添加量与蒸馏水混合，边加热边搅拌，煮开后以2. 0% (w/v)添加量投入蔗糖，搅拌均匀，95°C保温lOmin，冷却至室温，即得增菌用途的燕麦培养基。植物乳杆菌ST-III活菌计数方法采用MRS平板计数法。2)植物乳杆菌ST-III不同接种量对活菌总数的影响分别将植物乳杆菌ST-III种子(上述方法制备的工作发酵剂)按O. 5 %、I %、2%>4% (v/v)的接种量接入上述方法制备的纯番茄汁培养基中，37°C培养24h，培养不同时间的发酵液按上述计数方法测定其活菌数。 所获得的发酵液中植物乳杆菌ST-III活菌总数对数值为6. 88 9. 12，(即活菌总数为0.75X 107 1.32X 109cfu/mL)，结果见图I。接种量为0.5% (v/v)的发酵液中活菌总数对数值为6. 88-9.01(即活菌总数为O. 75 X IO7 I. 02 X 109cfu/mL)，接种量为1.0% (v/v)的发酵液中活菌总数对数值为7. 18 9.00(即活菌总数为1.50X 107 1.00X 109cfu/mL)，接种量为2.0% (v/v)的发酵液中活菌总数对数值为7. 48 9.12(即活菌总数为3. OOXlO7 I. 32X 109cfu/mL)，接种量为4. 0% (v/v)的发酵液中活菌总数对数值为7. 78 9. 11 (即活菌总数为6. OOXlO7 I. 30 X 109cfu/mL)。可见比较合适方式是接种量为2.0 4.0% (v/v)，最佳的是2.0% (v/v)，发酵时间为8 10h。3)植物乳杆菌ST-III不同发酵温度对活菌总数的影响将植物乳杆菌ST-III种子(上述方法制备的工作发酵剂)以2% (v/v)接种量无菌操作接入上述方法制备的纯番茄汁培养基中，接种后植物乳杆菌的活菌数为3. 00 4. 00 X 107cfu/ml (每毫升菌落形成单位)，25-40°C培养24h，培养不同时间的发酵液按上述的计数方法测定其活菌数。所获得的发酵液中植物乳杆菌ST-III活菌总数对数值为7. 48 9. 12，(即活菌总数为3. OOX IO7 I. 32X 109cfu/mL)，结果见图2。25°C条件下获得的发酵液中活菌总数对数值为7. 56 8. 75 (即活菌总数为3. 80 X IO7 5. 57 X 108cfu/mL)，30°C条件下获得的发酵液中活菌总数对数值为7. 54 8. 99 (即活菌总数为3. 50 X IO7 9. 78 X 108cfu/mL)，37°C条件下获得的发酵液中活菌总数对数值为7. 48 9. 12 (即活菌总数为3. OOXlO7
I.32X 109cfu/mL)，40°C条件下获得的发酵液中活菌总数对数值为7. 60 9. 06 (即活菌总数为4. OOX IO7 I. 15X109cfu/mL)。可见比较合适方式是发酵温度为37_40°C，最佳的是37°C，发酵时间为8 IOh0实施例2不同乳酸菌在番茄汁中的发酵特性将L. plantarum ST-111、L. plantarum ATCC 14917、L. casei ATCC 393、L. bulgaricus LB_340、S. thermophilus ST-B0DY-3的种子(上述方法制备的工作发酵剂)以2% (v/v)接种量无菌操作接入上述方法制备的纯番茄汁培养基中，接种后植物乳杆菌的活菌数为2. 00 4. 00X 107cfu/ml (每毫升菌落形成单位)，37°C培养24h，培养不同时间的发酵液按上述的计数方法测定其活菌数。L. plantarum ST-III的发酵液中活菌总数对数值为7. 48 9. 12，(即活菌总数为 3. OOXlO7 I. 32X 109cfu/mL)，L. plantarum ATCC 14917 的发酵液中活菌总数对数值为 7.34 8.92，(即活菌总数为2.20\107 8.41父1080扣/11^)，1^03861 ATCC 393 的发酵液中活菌总数对数值为7. 34 8. 78，(即活菌总数为2. 21 X IO7 6. OOXlO8Cfu/mL)，L. bulgaricus LB-340的发酵液中活菌总数对数值为7. 41 7. 30，(即活菌总数为
2.59X IO7 2. 00X 107cfu/mL)，S. thermophilus ST-B0DY-3 的发酵液中活菌总数对数值为7. 32 7. 18，(即活菌总数为2. IOXlO7 I. 50X 107cfu/mL)，结果见图3。可见，植物乳杆菌ST-III在纯番茄汁中的生长能力优于其他菌株，是发酵番茄汁的优选菌株。实施例3番茄汁增菌基、MRS培养基、燕麦培养基的发酵效果比对将植物乳杆菌ST-III种子(上述方法制备的工作发酵剂)以2% (v/v)接种量无菌操作分别接入上述方法制备的纯番茄汁培养基、MRS培养基、燕麦培养基中，接种后植物乳杆菌的活菌数为3. 00 4. 00X 107cfu/ml (每毫升菌落形成单位)，均置于37°C静止培养24h，培养不同时间的发酵液按上述的计数方法测定其活菌数，比较植物乳杆菌ST-III在不同增菌基料中的发酵性能。 植物乳杆菌ST-III发酵纯番茄汁培养基所获得的发酵液中活菌总数对数值为
7.48 9. 12 ( S卩活菌总数为3. 00 X IO7 I. 32 X 109cfu/mL)，发酵MRS培养基所获得的发酵液中活菌总数对数值为7. 57 9. 27 (即活菌总数为3. 80 X IO7 2. 85 X 109cfu/mL)，发酵燕麦培养基所获得的发酵液中活菌总数对数值为7. 58 8. 09 (即活菌总数为3. 80 X IO7 I. 20X 108cfu/mL)，结果见图4。燕麦培养基对植物乳杆菌ST-III的增殖效果显著低于其他两种培养基，而MRS培养基的增殖效果略高于纯番茄汁培养基，但差异不显著，三种培养基发酵植物乳杆菌ST-III最适时间均为8 10h。实施例4番茄汁增菌培养基与MRS培养基的成本核算与比对经测定(η彡3)，每500g成熟番茄可榨取番茄汁300mL左右，当前市售番茄为3元/500g,则番茄汁的物料成本为10元/L。而实验室MRS培养基目前的市场售价为849元/500g，500g培养基可配制发酵液9. 6L，则MRS培养基的物料成本为元88元/L。因此，在两种培养基对植物乳杆菌ST-III增殖效果无显著差异的前提下，纯番茄汁培养基的成本低于MRS培养基80%以上。实施例5保藏实验将植物乳杆菌ST-III种子(上述方法制备的工作发酵剂)以2% (v/v)接种量无菌操作接入上述方法制备的纯番茄汁培养基中，接种后植物乳杆菌的活菌数为3. 00 4. OOX IO7CfVml (每毫升菌落形成单位)，均置于37 °C静止培养8h，分别置于5°C和250C (室温)条件下进行14d保藏实验，保藏不同时间的发酵液按上述的计数方法测定其活菌数，比较植物乳杆菌ST-III在不同温度下的保藏性能。5°C条件下，纯番茄汁发酵液中植物乳杆菌ST-III的活菌总数对数值为9. 24 9.46(即活菌总数为2. 26X 109 2. 90X 109cfu/mL)，25°C (室温)条件下，纯番茄汁发酵液中植物乳杆菌ST-III的活菌总数对数值为7. 86 9. 46 (即活菌总数为7. 31 X IO7 2.90X 109cfu/mL)，结果见图5。14天保藏实验结果表明，发酵液在5°C条件下的保藏效果好于25°C (室温)的效果，前者的活菌总数稳定保持在lX109cfu/mL以上，而后者的活菌数则在保藏后期开始有所下滑，可见，植物乳杆菌ST-III纯番茄汁发酵液在冷藏条件下具有至少14天的活菌总数保证能力。
实施例6感评测试表I.感官评分标准
权利要求
1.ー种纯天然、低成本的植物乳杆菌ST-III的培养方法，其特征在于，包括以下步骤将植物乳杆菌ST-III接种于灭菌番茄汁培养基中进行培养，培养温度为25 40°C，时间为2 48小时。
2.如权利要求I所述的植物乳杆菌ST-III的培养方法，其特征在于，所述的番茄汁培养基是纯番茄汁。
3.如权利要求I所述的植物乳杆菌ST-III的培养方法，其特征在于，所述的灭菌番茄汁培养基由包括以下步骤的方法制备而得成熟番茄清洗，去皮，榨汁，过滤取汁，煮沸1-10分钟，4000-12000g离心1-30分钟，取上清，灭菌，冷却，即得。
4.如权利要求2所述的植物乳杆菌ST-III的培养方法，其特征在于，所述的榨汁、采用榨汁机压榨，所述的过滤采用100目纱布过滤，所述的灭菌采用超高温瞬时灭菌，112-135。。10-30 分钟。
5.如权利要求I所述的植物乳杆菌ST-III的培养方法，其特征在于，所述的培养温度为37 40°C，时间为8 10小时。
6.如权利要求I所述的植物乳杆菌ST-III的培养方法，其特征在于，接种量0.5% -5% (v/v)。
7.ー种植物乳杆菌ST-III乳酸菌饮料，其特征在于，其由以下包括以下步骤的方法制备而得将植物乳杆菌ST-III接种于灭菌番茄汁培养基中，25 40°C发酵2 48小吋，即得。
8.如权利要求7所述的植物乳杆菌ST-III乳酸菌饮料，其特征在于，发酵温度为37 40°C，发酵时间为8 10小时。
9.如权利要求7所述的植物乳杆菌ST-III乳酸菌饮料，其特征在于，接种量0.5% -4% (v/v)。
10.如权利要求7-9任一项所述的植物乳杆菌ST-III乳酸菌饮料作为植物乳杆菌ST-III活菌制剂的用途。
全文摘要
本发明公开了番茄汁在植物乳杆菌ST-III发酵过程中的用途。还公开了一种由植物乳杆菌ST-III发酵获得的益生菌饮料，将植物乳杆菌ST-III接种于灭菌番茄汁中，25～40℃发酵即得。植物乳杆菌ST-III在该培养基中的发酵增殖效果与实验室常用的MRS培养基相当；但发酵获得相同剂量ST-III活菌花费的成本比MRS培养基降低80％，因此，可广泛应用于植物乳杆菌ST-III的研究及其活菌制剂开发和工业化生产。同时，以无添加的纯番茄汁为发酵基料培养获得的植物乳杆菌ST-III高活菌数发酵液可作为具有保健功能的乳酸菌饮料直接食用。
文档编号A23L2/02GK102732470SQ20121025330
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月20日 优先权日2012年7月20日
发明者吴正钧, 季红, 艾连中, 陈卫, 韩瑨 申请人:光明乳业股份有限公司