专利名称：拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酶工程领域，具体涉及ー种具有拆分消旋体Y-内酰胺活性的(+ )Y-酰胺酶及其编码基因在手性化合物上的应用。
背景技术：
(-)2- 氮杂双环[2，2，I]庚-5-烯-3-酮(简称(_) Y _内酰胺)是合成抗病毒药物如阿巴卡韦的重要中间体，获得高光学纯度的(+/_) Y-内酰胺是限制上述多种抗病毒药物、及代谢调节药物生产成本降低、及产量提高的主要因素之一。目前，Y-内酰胺酶是ー种新型的酰胺酶，能够催化酰胺类化合物的酰胺键水解。(+) Y-内酰胺酶能够高效拆分外消旋体Y-内酰胺，获得光学纯的㈠Y-内酰胺。光学纯的㈠Y-内酰胺是制备抗病毒药物阿巴卡韦((-)abaCavir)的重要中间原料，具有巨大的经济价值。与化学合成法相比，生物催化具有的反应条件温和，特异性高，低能耗，底物专ー性，重复使用，催化效率高等优点，已代替某些化学合成法投入应用；微生物酶法拆分外消旋体Y-内酰胺具有良好的应用前景。
权利要求
1.一种具有拆分消旋体Y-内酰胺活性的(+) Y-内酰胺酶，其特征在于 所述的(+ ) Y-内酰胺酶是如下(a)或(b)的蛋白质 Ca)其氨基酸序列组成为序列表中的SEQ ID No:l ； (b)将序列表中的SEQ ID No: I的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、和/或缺失、和/或添加，且具有拆分消旋体Y-内酰胺活性的由SEQ ID No: I衍生的蛋白质。
2.一种具有拆分消旋体Y-内酰胺活性的(+ ) Y-内酰胺酶编码基因，其特征在于 所述的(+ ) Y-内酰胺酶的编码基因是如下(a)或(b)的基因 (a)、其核苷酸序列组成为:序列表中的SEQID No:2 ； (b)、编码序列表中的SEQID No:2的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.—种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2中所述的(+ ) Y-内酰胺酶编码基因。
4.一种转基因细胞系，其特征在于含有权利要求2中所述的(+ ) Y-内酰胺酶编码基因。
5.一种宿主菌，其特征在于含有权利要求2中所述的(+ ) Y-内酰胺酶的编码基因。
6.一种具有拆分消旋体Y-内酰胺活性的(+ ) Y-内酰胺酶的编码基因的应用，其特征在于 提取大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum, CGMCC :1. 2550)基因组DNA,构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的(+ ) Y内酰胺酶； 将所述的用于提取重组蛋白的重组菌体悬浮在的磷酸缓冲液中，加入Y内酰胺底物，37°C反应24小时，得到反应混合物；将所述的反应混合物进行离心处理，保留上清液；将所述的上清液中加入乙酸乙酯萃取，进行HPLC检测，获得(-)Y-内酰胺。
7.一种具有拆分消旋体Y-内酰胺活性的(+ ) Y-内酰胺酶的编码基因的应用，其特征在于 提取大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum, CGMCC :1. 2550)基因组DNA,构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的(+ ) Y内酰胺酶； 将所述的( + )Y内酰胺酶悬浮在的磷酸缓冲液中，加入Y内酰胺底物，37°C反应24小时，得到反应混合物；将所述的反应混合物进行离心处理，保留上清液；将所述的上清液中加入乙酸乙酯萃取，进行HPLC检测，获得(-)Y -内酰胺。
8.一种以大豆慢生根瘤菌为菌种生产(_) Y-内酰胺的方法，其特征在于该方法包括如下步骤 A、菌种选择选用大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)作为菌种，菌种保藏号为 CGMCC No. I. 2550 ； B、振荡培养将所述的大豆慢生根瘤菌菌种接种到根瘤菌培养基中，进行振荡培养，得到发酵液； C、收集菌体将所述的发酵液与PH值为7.0的磷酸盐缓冲液的混合，得到稀释发酵液；将所述的稀释发酵液进行离心处理，收集沉淀；将该沉淀用所述的PH值为7. 0的磷酸盐缓冲液进行洗涤处理，回收得到湿菌体； D、生物拆分实验将所述的湿菌体与(+/_)Y-内酰胺溶液混合，得到菌体混合液；将所述的菌体混合液进行振荡培养，得到振荡后的菌液；E、分离样品将所述的振荡后的菌液以进行离心处理，得到上清液，即为所述的(_)Y _内酰胺。
9.根据权利要求8所述的生产(-)Y-内酰胺的方法，其特征在于所述的根瘤菌培养基的碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖中的一种或几种的混合物；所述的根瘤菌培养基的氮源包括胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米浆中的一种或几种的混合物。
10.根据权利要求8所述的生产(-)Y-内酰胺的方法，其特征在于所述的pH值为·7.0的磷酸盐缓冲液由0. 05mol/l的Na2HPO4溶液和0. 05mol/l的NaH2PO4溶液混合而成，所述的Na2HPO4溶液和NaH2PO4溶液的体积比为7:3。
全文摘要
本发明提供一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-酰胺酶及编码基因在手性化合物上的应用；及利用一种以大豆慢生根瘤菌生产(-)γ-内酰胺的方法。提取大豆慢生根瘤菌基因组DNA，构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的(+)γ内酰胺酶；将所述的用于提取重组蛋白的重组菌体或(+)γ内酰胺酶悬浮在的磷酸缓冲液中加入γ内酰胺底物反应、萃取获得(-)γ-内酰胺。或提取大豆慢生根瘤菌基因组DNA，构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的(+)γ内酰胺酶，加入底物反应、萃取获得(-)γ-内酰胺。本发明中的(+)γ-内酰胺酶源于大豆慢生根瘤菌，催化效率高，得到的(-)γ-内酰胺纯度高。
文档编号C12R1/01GK102796720SQ20121029325
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者郑国钧, 朱绍洲, 宋大伟, 宫萃宇 申请人:北京化工大学