专利名称：一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体Pul324及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体Pul324及其应用。
背景技术：
淀粉原料一般含有60 90%的支链淀粉，而支链淀粉所含的4 6%葡萄糖残基以α-1,6-糖苷键连接。普鲁兰酶(Pullulanase，EC 3. 2. I. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点的α -I, 6-糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的解支酶，在改善淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量及开发新产品方面具有相当巨大的价值，在食品、医药、纺织、生物能源等行业中有着非常重 要的用途及良好的市场前景，例如可利用其生产高纯度葡萄糖和果糖、高麦芽糖浆、燃料乙醇，以及改性淀粉。近年来随着淀粉原料深加工工业的发展，要求酶制剂工业不断更新和完善酶的种类和性能，以满足工业生产的要求。我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但由于酶活较低而仅限于实验室研究，目前普鲁兰酶是淀粉制糖酶系中唯一一种我国尚不能自主生产的产品。目前应用最广、产量最大的普鲁兰酶源自丹麦Novo公司，该公司所生产的普鲁兰酶是由嗜酸性普鲁兰芽抱杆菌acidopullulyticus)经深层发酵产生。此夕卜，国外来源于产气克雷伯氏菌aerogefles)、枯草芽孢杆菌
subtil is、取Bacillus derami fi cans的普鲁兰酶也得到了商业化生产。因此，我国在普鲁兰酶的研究上距离发达国家有很大差距，工业普鲁兰酶完全依赖进口，定价权掌握在少数外国公司手中，垄断的市场供应导致了国内普鲁兰酶高昂的销售价格，极大的限制了国内相关产业的发展。为了改变我国对进口产品的依赖，寻找一条国产化的道路，本研究使用酶工程技术开发有自主知识产权的高性能普鲁兰酶，并利用基因工程技术构建基因工程菌株进行分泌表达，为工业化大规模生产普鲁兰酶打下坚实基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体PU1324及其应用。本发明所述的新的普鲁兰酶突变体Pul324(SEQ ID NO. 2)，其是通过分子改造长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因(GenBank序列号JN872757. I)而得到的，具体是利用现代酶工程技术缺失野生型基因上的前324个碱基，改造得到一个新的普鲁兰酶突变体Pul324。与原酶相比，这个突变体在大肠杆菌宿主中能够有效分泌表达，发酵液上清是原酶的24倍，胞内酶活则提高了 40%，其性质有利于降低普鲁兰酶的生产成本，更加适合用于工业化生产。一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体基因/7W324，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所
/Jn ο所述的普鲁兰酶突变体基因/7^/7324编码的蛋白质，由818个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
所述的普鲁兰酶突变体基因/7 7324，该突变体是通过提取长野芽孢杆菌{PullulanibadIlus naganoensis )ATCC 53909 基因组 DNA,根据 Genbank 中已报道的基因序列为依据，设计以下引物来获得缺失前324 bp碱基的突变体基因/7 7324
上游引物 Fl 为GTAfi^TTTACCTGCTGTAAGTAACGC下游引物 Rl 为GTAC7Tfi^TTTACCATCAGATGGGCT
所述的普鲁兰酶突变体基因/^/7324编码的蛋白质在淀粉水解过程中的应用。本发明还涉及含有本发明普鲁兰酶突变体Pul324的宿主。本发明所述的新的普鲁兰酶突变体Pul324，该突变体酶在淀粉水解中的具有广泛的用途。其特殊在于与原酶相比，突变体Pul324在大肠杆菌宿主中能够有效的分泌表达，发酵液上清的酶活提高为原来的24倍，胞内酶活则提高了 40%。突变体基因/7^/7324比野生 型基因小，有利于质粒的稳定。本发明所述的新的普鲁兰酶突变体Pul324的制备方法包括普鲁兰酶突变体基因PumA的获得、普鲁兰酶突变体基因的表达、普鲁兰酶突变体酶活的测定等步骤，具体如下
(I)普鲁兰酶突变体基因/^/7324的获得
根据普鲁兰酶基因序列信息，从原基因(GenBank序列号JN872757. I)的325位碱基开始设计引物来进行改造。以长野芽孢杆菌基因组DNA为模版，使用上游引物Fl :5’ -GTAGAATTCACCTGCTGTAAGTAACGC - 3’(SEQ ID NO. 1，包含一个I 酶切位点)和下游引物 Rl 5’ - GTACTCGAGTTTACCATCAGATGGGCT _ 3 (SEQ ID NO. 2，包含一个ZAo I 酶切位点)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增普鲁兰酶突变体基因。(2)重组质粒的构建与验证
用限制性内切酶及^7 I和通o I对普鲁兰酶突变体基因进行双酶切，与同样经过双酶切的pET-22b (+)连接得到pET22b-/^7324，转化宿主疋coli DH5 a，提取重组质粒进行酶切验证，并进一步进行DNA测序分析确定正确的转化子。(3)基因工程菌株的构建
将验证正确的重组质粒转化万.coli BL21 (DE3)感受态细胞(CaCl2化学法转化)内，利用菌落PCR的方法验证阳性转化子疋coli BL21 (DE3)/ pET22b-/7y7324。经测定，发酵液上清的粗酶液酶活力为野生型的24倍，胞内酶活则提高了 40%。本发明的突出的实质性特点和技术效果在于本发明利用现代酶工程技术缺失长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因上的前324个碱基，改造得到一个新的普鲁兰酶突变体Pul324。该突变体基因比野生型基因小，有利于质粒的稳定。与原酶相比，普鲁兰酶突变体Pul324在大肠杆菌宿主中能够有效分泌表达，发酵液上清的酶活提高为原来的24倍，胞内酶活则提高了 40%，其性质有利于降低普鲁兰酶的生产成本，更加适合用于工业化生产。
具体实施例方式本发明使用的长野芽孢杆菌菌种可以从菌种保藏中心购买，也可以通过野外采集或者其他途径获得。本发明采用的微生物培养、基因克隆、表达技术和相关的技术方案是本领域中常用的成熟技术，涉及的专业术语也是本领域中常见的专业术语，因此本发明的文本对于本领域的专业人员来说是显而易见的。下面结合实施例对本发明的技术内容作进一步说明，该实施例是说明性的，而不是限定性的，不能被解释为限定本发明的保护范围。下面将通过实施例对本发明作详细描述
(I)普鲁兰酶突变体基因pul2 A和PUlH的获得
长野芽抱杆菌iPulIulanibaciIIus naganoensis)ATCC 53909从德国微生物菌种保藏中心购买，根据该菌的普鲁兰酶基因序列信息，分别从原基因的235、325位碱基开始设计引物
上游引物 F2 :5，- GTAGAATTCCATCGATTTAAGCAAAGG _ 3，·上游引物 FI : 5 ’ - GTAGAATTCACCTGCTGTAAGTAACGC - 3 ’·
下游引物 Rl :5’ - GTACTCGAGTTTACCATCAGATGGGCT - 3’
其中上游引物包含一个及^7 I酶切位点(下划线)，下游引物包含一个通ο I酶切位点(下划线)。认 Pullulanibacillus naganoensis ATCC 53909 基因组为模版进行 PCR 扩增。反应体系为ddH20 41. 5 μ L, IOXbuffer 5 μ L, dNTP (2.5 mmol/L) I yL，上下游引物(20 μπιοΙ/L)各0. 5 μ L，DNA模板I μ L，高保真DNA聚合酶0. 5 μ L0 PCR扩增条件为94° C大变性5min，94° C变性20s，61° C退火40s，72° C延伸3 min，30个循环，最后72° C延伸10 min。利用上游引物F2和下游引物Rl可扩增得到/7 7234基因，而利用上游引物Fl和下游引物Rl可扩增得到/7 7324基因。将所得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到扩增产物大小与目的基因片段大小完全吻合。PCR产物用DNA纯化试剂盒(天根公司)进行纯化。具体步骤参考DNA产物纯化试剂盒说明书。用限制性内切酶EcoR I和Xho I对纯化的普鲁兰酶突变体基因进行双酶切，与同样经过双酶切的pET-22b (+)连接得到pET22b-pul234和pET22b-pul324，转化宿主E. coli DH5 α，提取重组质粒进行酶切验证，并进一步进行DNA测序分析确定正确的转化子。将验证正确的重组质粒转化万.coli BL21(DE3)感受态细胞(CaCl2化学法转化)内，利用菌落PCR的方法验证阳性转化子万.coli BL21(DE3)/pET22b-/w7234和万.coliBL21(DE3)/ pET22b-/^7324。将构建成功的基因工程菌株接种于5 mL液体LB培养基(含100 μ g/mL氨苄青霉素)，37° C培养10 h。取O. 5 mL的液体种子接种50 mL液体LB培养基(含100 μ g/mL氨苄青霉素)，37° C培养2-3 h，当OD62tl为O. 4左右时，加入I mM IPTG，然后置于37° C进行诱导，时间12 h。本发明采用DNS试剂显色法测定普鲁兰酶活力。其原理为普鲁兰酶水解普鲁兰糖底物得到还原糖，还原糖与DNS试剂所含的3，5- 二硝基水杨酸共热后产生棕红色的络合物，在一定范围内其颜色的深浅与还原糖的量成正比。使用分光光度法测定吸光值即可计算出普鲁兰酶的活力。酶活测定的步骤为取ImL发酵液12，000r/min离心3min得到上清酶液。于离心管中加入100 μ L浓度为l%(w/v)普鲁兰的乙酸钠缓冲液(100mM，pH4. 75)，然后加入100 μ L上清酶液，60°C水浴中保温15min。冰浴终止反应，然后加入过量的DNS (300 μ L)试剂，沸水浴显色5min，冷却后测定OD54tl,即可计算出胞外酶活。菌体沉淀的菌体用200 μ L无菌水悬浮，加入适量Triton X-100和溶菌酶,37°C水浴30min, 12, 000r/min离心3min,取上清按上述方法分析胞内酶活。与原酶相比，普鲁兰酶突变体Pul324在大肠杆菌宿主中能够有效的分泌表达，发酵液上清的酶活提高为原来的24倍，胞内酶活则提高了 40%。在淀粉液化过程中，糖化酶则主要水解直链淀粉的a-1，4-糖苷键。而普鲁兰酶能够专一性切开支链淀粉分支点的a -I, 6-糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉便于其它淀粉酶对淀粉的作用效果，提高淀粉水解效率、降低能耗、提高产品质量及开发新产品方面具有较高的价值。在淀粉糖化过程中，适当稀释的糖化酶Dextrozyme DX催化反应0. 5、I. O、I. 5和2. Oh,分别产生0. 758、I. 502,2. 219和2. 628g/L还原糖。当辅助加入普鲁兰酶突变体Pul324，其它条件不变的情况下，产生的还原糖浓度提高至I. 071,2. 307、
3.145和3. 902g/L，水解效率提高幅度均大于40%。由此可见，辅助加入普鲁兰酶突变体Pul324确实可以有效提高淀粉水解效率。该发明具有重要的经济效益，突变体的特殊性质有利于降低普鲁兰酶的生产成 本，更加适合用于工业化生产。应该理解的是，对本领域技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，例如，所述的野生型普鲁兰酶除了来源于长野芽孢杆菌之外，还可以来源于产气克雷伯氏菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、BaciIlus deramificans、BaciIlus acidopullulyticus 等菌株。所述的载体适于在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、毕赤酵母等宿主中表达。也可通过电转化法、原生质体转化法等将本发明的普鲁兰酶突变体转入原核或者真核宿主中，以实现普鲁兰酶突变体的表达。或者通过酶工程技术对突变体的氨基酸序列进行改造。而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110>广西科学院
〈120〉一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体Pul324及其应用 〈160〉 2
<170> PatentIn version 3.5〈210〉 I〈211〉 2457〈212〉 DNA
〈213〉长野芽抱杆菌naganoensis )
〈400〉 I
cctgctgtaa gtaacgctta tttagatgct tccaaccaag tgttggtcaa gcttagccag60
ccgtttactc ttggtgaagg ttcaagcggt tttacggttc atgatgacac agcaaataag120
gatattccag ttacatctgt tagtgatgcc aatcaggtaa cggctgtttt agcaggtact180
ttccagcata tttttggggg gagtgattgg gcaccggata atcacaatac tttactaaaa240
aaggtgaata gcaatctcta tcaattttca ggaaatcttc ctgaaggaaa ctaccaatat300
aaagtggctt taaatgatag ctggaataat ccgagctacc catctgataa cattaatttg360
acagtgccag ctggtggtgc ccatgttaca ttttcttata taccatccac ccatgctgtt420
tatgacacga ttaacaatcc taatgcggat ttacaagtag atagcagcgg tgttaagacg480
权利要求
1.一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体基因/7W324，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO. I 所示。
2.根据权利要求I所述的普鲁兰酶突变体基因/7 7324编码的蛋白质，其特征在于，由818个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.根据权利要求I所述的普鲁兰酶突变体基因/^7324，其特征在于，该突变体是通过提取长野芽抱杆菌iPullulanibadIlus naganoensis) ATCC 53909基因组DNA,根据Genbank中已报道的基因序列为依据，设计以下引物来获得缺失前324 bp碱基的突变体基因/^"324 上游引物 Fl 为GTAG^77TACCTGCTGTAAGTAACGC 下游引物 Rl 为GTAC7TG^TTTACCATCAGATGGGCT。
4.根据权利要求I所述的普鲁兰酶突变体基因/7 7324编码的蛋白质在淀粉水解过程中的应用。
全文摘要
一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体Pul324，其获得方法是利用现代酶工程技术对来源于长野芽孢杆菌(Pullulanibacillusnaganoensis)普鲁兰酶氨基酸序列进行分子改造，通过PCR方法缺失原酶上的前108个氨基酸残基，获得在大肠杆菌宿主中能够有效分泌表达的突变体Pul324。将其插入pET-22b(+)中构建重组载体，导入大肠杆菌宿主进行分泌表达。该突变体基因比野生型基因小，有利于质粒的稳定。与原酶相比，突变体Pul324在大肠杆菌宿主中能够有效分泌表达，发酵液上清的酶活提高为原来的24倍，胞内酶活则提高了40%。采用本发明能够提高宿主的普鲁兰酶分泌表达量，表达产物能够提高淀粉的水解效率。
文档编号C12N15/56GK102796751SQ20121029849
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者谢能中, 黄日波, 王青艳, 秦艳, 米慧芝, 朱绮霞, 申乃坤, 朱婧, 陆艳, 曹薇, 黎贞崇, 陈东 申请人:广西科学院