专利名称：运动机能相关基因ckmm荧光检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种运动机能相关基因CKMM荧光检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术：
随着人类基因组计划的完成，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生物技术在体育运动问题领域的应用得到广泛的关注。基因遗传工程应用于运动员选材是历史必然、大势所趋，它必将从根本上引起运动选材理论和方法的革命。运用遗传学的理论和方法进行运动选材已经有了初步进展。 肌酸激酶(CK)是Cr+MgATP+H — PCr+MgADP反应的关键酶。CK与磷酸肌酸组成肌酸一磷酸肌酸穿梭系统，在细胞内的作用ー是，在高能量需求时作为“暂时的能量缓冲系统”保持ATP / ADP的比率；ニ是，作为能量转运单位，将能量从产生部位转运到利用部位。肌型肌酸激酶是ー种组织特异性酶，主要在骨骼肌中表达，心肌中也有少量表达。肌肉中CKMM主要集中在M线附近，其主要功能是在肌球蛋白头部生成高浓度的ATP，为肌肉收缩及运动提供能量，CKMM也存在肌质网Ca ATP酶附近，可能影响Ca的再聚集，从而影响肌肉的工作能力。研究表明，人的CKMM基因的多态性与耐カ以及耐カ训练效果有夫。CKMM基因多态性的三种基因型分别为AA型、GG型和杂合子AG型。研究结果显示与耐カ训练前相比，训练后相通亚极限强度运动时，AA、AG型的人运动能力提高显著，但GG型训练后各种指标改变不明显。因此GG型基因为耐カ训练中最不敏感，携帯A等位基因的AA型、AG型人对耐カ训练的敏感性显著高于和GG型。最新研究表明在高強度运动后出现的肌痛、肌酸激酶增高等横纹肌溶解症状，与ACE与CKMM基因有密切的关系。运动后与D等位基因(ACE基因)和G等位基因(CKMM基因)的个体更易出现肌酸激酶高反应。而同时具有DD基因型(ACE基因)和GG基因型(CKMM基因)的人，会出现运动后肌酸激酶异常升高，D+G基因型有相加作用。目前常用的基因检测方法有直接测序(direct sequencing, DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段长度多态性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)> 变性高效液相色谱分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、定量PCR。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。采用荧光标记技术、毛细管电泳技术，通过带不同荧光标记物的引物对运动机能相关基因CKMM特异性的扩增，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情況，即可实现对该运动机能相关基因位点的检测，灵敏度高、判读清晰准确、采样方便。
发明内容
本发明的目的是提供一种运动机能相关基因CKMM荧光检测试剂盒及检测方法。本发明所述的检测运动机能相关基因CKMM荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，引物混合物以及超纯水；所述扩增后试剂包括内标和用于基因分型的基因分型标准物；使用所述的试剂盒进行PCR扩增反应的条件PCR扩增体系的pH值为8. 0-9. 0，镁离子浓度为I. 5-3. 5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300 u M，Taq酶的用量为0. 1-0. 4U/U L，引物终浓度为0. 2-0. 4 u M0用于CKMM基因检测的引物为SEQ NO. I :5’ -AGG GTG TCA GGT GTG AAA GAA TCA-3’ ；
SEQ NO. 2 :5’ -GTATCCT TAC TTT CTC AAG AAC CTG CCG-3’ ；SEQ NO. 3 :5’ -CCT TAC TTT CTC AAG AAC CTG CCA-3’。所述的引物中SEQ NO. I的5’端进行荧光染料标记，内标所用的荧光染料为不同
的荧光素。所述扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检測。采用所述试剂盒应用于运动机能相关基因检测的方法，是通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测运动机能相关基因CKMM ;用于CKMM检测的引物为SEQ NO. I、SEQNO. 2、SEQ NO. 3，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检測。其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ;所述的来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/ 口腔拭子样本、FTA卡血斑/ 口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液。使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序:94-980C l-5min ;26_32 个循环的 94-98°C 15_60s，55_65°C 15_60s，72°C 15_60s ；60 °C 30-60min。本发明的有益效果如下本发明以CKMM基因为检测对象，通过PCR扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供參考。在体育选材方面首次采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特异性检测，节约了人力物力和时间。
图I是本发明的试剂盒对71-2号样本CKMM基因个体DNA扩增后的分型结果图；图2是本发明的试剂盒对74-2号样本CKMM基因个体DNA扩增后的分型结果图；图3是本发明的试剂盒对87号样本CKMM基因个体DNA扩增后的分型结果图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进ー步描述。实施例I本发明的试剂盒检测40个不同个体的DNA样本。用于运动机能相关基因检测的引物采用蓝色荧光染料标记，内标采用红色荧光染料标记。I、待测样本40份，下文列举的是不同基因型个体3份的結果。相关样本都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对CKMM进行过测序检測。其中，71_2号、74_2号、87号样本的分型结果依次为G/G、A/A、A/G。2、检材的基因组DNA提取Chelex提取法剪下I 3mm血斑置于I. 5mL离心管中，加入SdH2O ImL,振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5%CheleX-100震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200y L加入离心管中，振荡数秒，。于56°C水浴保温30min后，振荡数秒。95°C沸水浴IOmin,轻微振荡数秒。2000rpm离心5min,上清中为提取的DNA。3、扩增和扩增产物的检测分析
3. IPCR 扩增体系
权利要求
1.一种运动机能相关基因CKMM荧光检测试剂盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其缓冲溶液、扩增各基因的引物、内标及基因分型标准物。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于 用于CKMM基因检测的引物为SEQ NO. I :5’ -AGG GTG TCA GGT GTG AAA GAA TCA-3’ ；SEQ NO. 2 :5’ -GTATCCT TAC TTT CTC AAG AAC CTG CCG-3’ ；SEQ NO. 3 :5’ -CCT TAC TTT CTC AAG AAC CTG CCA-3’。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述的用于CKMM基因扩增的引物，其中，引物SEQ NO. I的5’端进行荧光染料标记，内标选用不同于上述的荧光染料标记。
4.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述CKMM基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
5.一种采用权利要求I所述试剂盒应用于运动机能相关基因检测的方法，其特征在于通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测运动机能相关基因CKMM ;用于CKMM检测的引物为SEQ NO. USEQ NO. 2,SEQ NO. 3，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种运动机能相关基因CKMM荧光检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增CKMM基因热点突变的引物混合物；所述扩增后试剂包括基因分型标准物和内标。本发明以上述基因为检测对象，通过PCR扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供参考。在体育选材方面首次采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特异性检测，节约了人力物力和时间。
文档编号C12Q1/68GK102796823SQ201210317090
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者步迅, 夏子芳 申请人:山东百福基因科技有限公司, 步迅, 夏子芳