专利名称：快速检测皮革真实属性的试剂盒及其方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测皮革真实属性的试剂盒及其方法。
背景技术：
PCR是聚合酶链式反应的简称，是分子生物学中广泛运用的一项技术，主要原理是通过热循环，达到目的基因片段的大量扩增。目前这项技术越来越广泛地运用于产品检测之中。例如，运用PCR技术检测牛奶或腊肠中的植物成分 等，运用PCR技术检测肉骨粉等产品中的动物源性成分等，运用PCR技术检测食品中的转基因成分等。皮革主要是由哺乳类动物毛皮加工而成，是我国重要的出口创汇产品。天然皮革按其动物来源种类分，主要有牛皮革、羊皮革、猪皮革、马皮革、兔皮革等。由于天然皮革种类繁多，价格昂贵，一些不法商贩为了寻求利益的最大化，以人造革冒充天然皮革，或以低档皮革冒充高档皮革，损害了广大消费者的健康和利益，对社会经济以及皮革产业发展产生了不利的影响。目前，国内外皮革材质的鉴别主要仍以手摸眼看的感官鉴定方法为主，随着皮革加工技术的提高，在某些方面，感官鉴别方法已很难鉴别出皮革种类，急需开发更为科学有效的方法。
发明内容
基于此，本发明提供了一种快速检测皮革真实属性的试剂盒及其检测方法。该试剂盒主要是依据不同种类皮革所承载的遗传信息存在差异，通过基因检测技术特异性地分析皮革样品中的DNA信息来区分皮革种类。一种快速检测皮革真实属性的试剂盒，包括(I) DNA提取缓冲液所述DNA提取缓冲液的组成为15 25mg/L十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、90 110nmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、15 25mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA2Na)、I. 3 I. 5mol/L 氯化钠(NaCl)、0· 09 O. 12g/L 蛋白酶 Κ，0· 9 I. lmol/L 二硫苏糖醇(DTT)；(2) Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的浓度为125IU ；(3) PCR 反应液所述PCR反应液的组成为2. 7 3. 3mmol/L氯化镁，O. 3 O. 5 μ mol/L引物，
O.3 O. 5mmol/L的三磷酸脱氧核苷酸；所述引物为针对动物源性基因序列的通用引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 ；(4)上样缓冲液所述上样缓冲液的组成为'2. O 3. Og/L溴酚蓝、350 450g/L蔗糖。在其中一些实施例中，所述引物还包括针对牛、羊、猪、马或兔的线粒体基因序列的引物。
在其中一个实施例中，所述针对牛线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :3和SEQID NO :4。在其中一个实施例中，所述针对羊线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :5和SEQID NO :6。在其中一个实施例中，所述针对猪线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :7和SEQID NO :8。在其中一个实施例中，所述针对马线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :9和SEQID NO 10o在其中一个实施例中，所述针对兔线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO 11和SEQID NO 12ο 一种快速检测皮革真实属性的方法，采用上述试剂盒，包括以下步骤(I)制备样品DNA剪取50cm2左右的经酒精浸泡消毒后的皮革样品，放入碎皮机中破碎，使用磷酸盐缓冲溶液在不断振荡的条件下浸泡皮革样品12 16小时，期间每隔2 3小时换一次溶液，以降低皮革试样中的盐离子如铬离子等的含量；浸泡后将皮革样品再次破碎，取3mL破碎的样品，加入2mL DNA提取缓冲液，混匀。将离心管置于65°C放置45 60min，不时摇动，使样品充分裂解；取出，加入ImL饱和氯化钠溶液，剧烈振荡3 5min，置于(TC下放置5 lOmin，离心；取上清，用体积比为25 : 24 : I的苯酚氯仿异戊醇混合液进行提取，离心；取上清，用体积比为24 I的氯仿异戊醇混合液进行提取，离心；取上清，加入异丙醇沉淀核酸，_20°C放置2 4小时，使得异丙醇与核酸充分反应，高速离心，获得DNA沉淀；再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA ；(2) PCR扩增反应取PCR反应液、Taq DNA聚合酶置于反应管中，混匀,加入样品DNA,离心后置于扩增仪上进行扩增，反应参数95°C预变性5min后，按94°C 30sec,55°C 45sec，72°C 60sec程序进行40个循环，最后72°C延伸lOmin，于4°C结束反应。(3)产物检测反应产物，加上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准，用含溴化己锭染色的I. 5%琼脂糖凝胶电泳，结束后，置紫外灯下观察，出现目标特异性条带的为含有某物种基因成分，否则为不含该物种基因成分。皮革制品一般经过浸灰、软化、浸酸、鞣制等过程，这些过程直接影响到DNA的完整性，特别是在皮革鞣制过程中，皮革样品中的DNA损失严重。此外，皮革样品基质复杂，含有多种PCR抑制因素，如盐离子、色素等。考虑到皮革样品的特殊性，本发明中的皮革DNA提取方法采用磷酸盐缓冲液与皮革材料充分混合的方式降低盐离子及色素对DNA提取的干扰，利用DNA提取缓冲液裂解皮革组织，释放核酸。用苯酚、氯仿、异戊醇混合溶液除去溶液中的蛋白，最后用异丙醇在低温条件下使DNA沉淀，获得纯化的皮革样品DNA。在获得较高质量的皮革样品DNA后，筛选特异性引物对所提取皮革中的基因组分进行分析检测。首先采用本发明开发的试剂盒检测皮革中的动物内源基因成分，检测到动物内源基因后，再根据设计好的特异性的物种专一性基因扩增引物，具体鉴别是牛、羊、猪、马还是兔等物种的基因序列，并进行测序验证实验结果。
本发明针对皮革样品基质复杂，干扰因素多，且皮革样品中基因降解较为严重等问题，开发建立了高效的皮革DNA的提取方法，成功地从上百份不同类型的皮革样品中提取获得了较高质量的DNA。在改进并优化了从皮革样品DNA的提取到PCR检测一整个过程中的提取试剂与反应条件等关键控制性因素，开发建立了稳定性高、快速简便的一整套皮革真实属性的基因检测试剂盒。本发明从遗传学角度对皮革样品基因成分进行分析鉴别，克服了传统的感官鉴别方法所面临的难题，具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点，弥补了当前皮革基因检测方法的空白，为皮革种类的鉴定提供了一种精确且易于标准化的分析方法，为质量监督等提供了技术支持，可广泛应用于皮革包括毛皮等样品基因的提取、皮革品种鉴定等方面，具有良好的经济社会效益与重大的推广应用价值，对于有效监管皮革产品质量，保护广大消费者利益具有重大意义。
图I为实施例2的检测方法中所提取的部分皮革样品的DNA电泳图谱；其中，M DNA Marker ;泳道I 3 :提取的牛皮革样品DNA ;4 6 :提取的羊皮革样品DNA ;7 9 :提取的猪皮革样品DNA ；10 12 :提取的马皮革样品DNA ；13 16 :提取的兔皮革样品DNA ；图2为实施例2的皮革样品中动物内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M DNA Marker ；P :阳性对照(牛肉DNA，稀释至50ng/μ L) ；CK :阴性对照；泳道I 2 :提取的牛皮革样品DNA ；3 :提取的羊皮革样品DNA ；4 :提取的猪皮革样品DNA ；5 :提取的马皮革样品DNA ；6 :提取的兔皮革样品DNA ；图3为实施例2的牛皮革DNA样本中牛内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M DNA Marker ；P :阳性对照(牛肉DNA，稀释至50ng/μ L) ；CK :阴性对照；1 6 :1 6号牛皮革DNA样本；图4为实施例2的羊皮革DNA样本羊内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M DNA Marker ；P :阳性对照(羊肉DNA，稀释至50ng/μ L) ；CK :阴性对照；1 5 :1 5号羊皮革DNA样本；图5为实施例2的猪皮革DNA样本中猪内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M DNA Marker ；P :阳性对照(猪肉DNA，稀释至50ng/μ L) ；CK :阴性对照；1 5 :1 5号猪皮革DNA样本；图6为实施例2的不同种类皮革DNA样本中牛内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M DNA Marker ；P 阳性对照(牛肉DNA,稀释至50ng/ μ L) ；CK 阴性对照;I 15 :I 15号皮革DNA样本；图7为实施例2的不同种类皮革DNA样本羊内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M DNA Marker ；P :阳性对照(羊肉DNA，稀释至50ng/μ L) ；CK :阴性对照；1 9 :1 9号皮革DNA样本。
具体实施例方式以下结合具体实施例来详细说明本发明。为防止提取过程中外源DNA的污染，我们采用无菌滤纸代替皮革样品作阴性对照，提取方法与皮革样品完全一致。实施例I快速检测皮革真实属性的试剂盒包括以下成分(可供进行50份PCR反应)(I) DNA 提取缓冲液(IOOmL)分别称取2.00mg CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、I. 2 Img Tris. HCl (三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、0. 58g EDTA2Na(乙二胺四乙酸二钠)和8. 18g NaCl于容量瓶中，用水定容至IOOmL,混勻。经过120°C、30min,高温消毒灭菌后,再加入10. OOmg购置的蛋白酶K(购自大连宝生物公司)，15. 43g 二硫苏糖醇(DTT)。(2) Taq DNA 聚合酶(25 μ I) 购置Taq DNA聚合酶25 μ I共125IU (购自大连宝生物公司)。(3) PCR 反应液(1000 μ I)首先制备引物，制备的引物浓度为100nmol/L。按照本领域常规方法制备引物。在DNA自动合成仪(采用美国ABI公司的ABI3949型全自动DNA合成仪)上按照制造商的说明书进行合成。分别合成如下引物动物基因成分通用引物，正向:5，-cctgagaaacggctaccat-3’(SEQ ID NO. I)；动物基因成分通用引物，反向:5，-cgtgtcaggattgggtaat-3’(SEQ ID NO. 2)；牛线粒体基因的正向引物5’-gccatatactctccttggtgaca-3’ (SEQ ID NO. 3)；牛线粒体基因的反向引物5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’ (SEQ ID NO. 4)；羊线粒体基因的正向引物5’-tattaggcctcccccttgtt-3’ (SEQ ID NO. 5)；羊线粒体基因的反向引物5’-ccctgctcataagggaatagcc-3’ (SEQ ID NO. 6)；猪线粒体基因的正向引物5’-atgaaacattggagtagtcctactatttacc-3’ (SEQ IDNO. 7)；猪线粒体基因的反向引物5’-ctacgaggtctgttccgatataagg-3’ (SEQ ID NO. 8)；马线粒体基因的正向引物5’-ccctcaaacatttcatcatgatgaaa-3’(SEQID NO. 9)；马线粒体基因的反向引物5’-gctcctcaaaaggatatttggcctca-3’ (SEQ IDNO. 10)；兔内源基因的正向引物5’-taatcgtcaccgcacatgcc-3，(SEQ ID NO. 11)；兔内源基因的反向引物:5，-ctatgtcaggagccccaattatca-3’(SEQ ID NO. 12)；称取O. 285mg MgCl2,用500 μ L水溶解,经过120°C、30min,高温消毒灭菌后,分别加入O. 5 μ mo I的一对引物和O. 5mmol的三磷酸脱氧核苷酸，用水定容至1000 μ L。(4)上样缓冲液(100 μ I)分别称取2. 5g溴酚蓝、400g蔗糖于容量瓶中，用水定容、混匀。实施例2利用实施例I的试剂盒检测皮革样品中的基因成分检测方法包括以下步骤(I)样品DNA的制备a皮革样品剪取50cm2左右的经酒精浸泡消毒后的皮革样品，放入碎皮机中破碎。使用磷酸盐缓冲溶液在不断振荡的条件下浸泡碎皮革样品12小时，期间每隔2小时换一次缓冲溶液，以降低皮革试样中的色素及盐离子如铬离子等的含量。浸泡后将皮革样品再次破碎，取3mL破碎的样品，加入2mL DNA提取缓冲液，混匀。将离心管置于65°C放置45 60min，不时摇动，使样品充分裂解。取出，加入ImL饱和氯化钠溶液，剧烈振荡3 5min，置于0°C下放置5 lOmin，离心。取上清，用体积比为25 : 24 : I的苯酚氯仿异戊醇混合液进行提取，离心。取上清，用体积比为24 I的氯仿异戊醇混合液进行提取，离心。取上清，力口入异丙醇沉淀核酸，-20°C放置2小时，使得异丙醇与核酸充分反应，高速离心，获得DNA沉淀。再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA。为防止提取过程中外源DNA的污染，采用无菌滤纸代替皮革样品作阴性对照，提取方法与皮革样品完全一致。b动物肉类(牛肉、羊肉、猪肉、马肉、兔肉)样品分别将牛肉、羊肉、猪肉、马肉、兔肉等试验材料，使用经过120°C、30min高压消毒过的固体粉碎机或研钵粉碎制成粉样。分别称取IOOmg研磨粉碎后的样品于离心管中，加入ImL试剂盒中的DNA提取缓 冲液，混匀。将离心管置于65°C放置60min,不时摇动,使样品充分裂解。用体积比为24 I的氯仿异戍醇混合液进行提取，小心的混合两相，12000r/min离心5min。将上清液移至
I.5mL离心管中，加入2倍体积预冷的异丙醇,充分混勻，12000r/min离心5min,获得DNA沉淀。再用70%的乙醇溶液洗沉淀物2次，室温离心12000r/min，5min收集DNA，尽可能除去乙醇。用100 μ I双蒸水溶解DNA沉淀，使DNA完全溶解后，即得样品DNA，置于_20°C保存。(2)检查DNA的纯度和含量在石英比色皿中加入50 μ I按10倍稀释的DNA样品(5 μ I DNA样品加水45 μ I混匀)，分别测定DNA样品在260nm和280nm处的紫外光吸收值，并计算A26(l/A28(l值。A26tl/A280应介于I. 7 I. 9之间，低于I. 7则表明制备物中存留显著蛋白质，应重新提取DNA ’大于I. 9则表明DNA样品中含有RNA，此时应加入RNA酶进行消化。计算DNA浓度10 X A26tl ( μ g/ μ I)。皮革样品DNA提取结果见表I。表I.皮革样品DNA提取结果
权利要求
1.一种快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，包括 (1)DNA提取缓冲液 所述DNA提取缓冲液的组成为15 25mg/L CTAB、90 11OnmoI/L Tris-HCl、15 25mmol/L EDTA2Na'I. 3 I. 5mol/L NaCl、0. 09 O. 12g/L 蛋白酶Κ、0· 9 I. lmol/L DTT ； (2)Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的浓度为125IU ; (3)PCR反应液 所述PCR反应液的组成为2. 7 3. 3mmol/L MgCl2,0. 3 O. 5ymol/L引物，O. 3 O. Smmol /T, dNTPs ； 所述引物为针对动物源性基因序列的通用引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2 ； (4)上样缓冲液 所述上样缓冲液的组成为2. O 3. Og/L溴酚蓝、350 450g/L蔗糖。
2.根据权利要求I所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述引物还包括针对牛、羊、猪、马或兔的线粒体基因序列的引物。
3.根据权利要求2所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述针对牛线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。
4.根据权利要求2所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述针对羊线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6。
5.根据权利要求2所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述针对猪线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :8。
6.根据权利要求2所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述针对马线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO 9和SEQ ID NO :10。
7.根据权利要求2所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述针对兔线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12。
8.一种快速检测皮革真实属性的方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的试剂盒，包括以下步骤 (1)制备样品DNA 剪取经酒精浸泡消毒的皮革样品，破碎，用磷酸盐缓冲溶液浸泡12 16小时，期间每隔2 3小时换一次溶液，浸泡后再次破碎；取样品，加入DNA提取缓冲液，混匀，65°C放置45 60min,不时摇动,加入饱和氯化钠溶液,剧烈振荡3 5min,0°C下放置5 IOmin ;离心取上清，用体积比为25 24 I的苯酚氯仿异戊醇混合液进行提取；离心取上清，用体积比为24 I的氯仿异戊醇混合液进行提取；离心取上清，加入异丙醇，_20°C放置2 4小时，高速离心，获得DNA沉淀，再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA ； (2)PCR扩增反应 取PCR反应液、Taq DNA聚合酶置于反应管中，混匀,加入样品DNA,离心后置于扩增仪上进行扩增，反应参数95°C预变性5min后，按94°C 30sec,55°C 45sec，72°C 60sec程序进行40个循环，最后72°C延伸lOmin，于4°C结束反应； (3)产物检测 反应产物，加上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准，用含溴化己锭染色的I. 5%琼脂糖凝胶电泳，结束后，置于紫外灯下观察，出现目标特异性条带的为含有某物种基 因成分，否则为不含该物种基因成分。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测皮革真实属性的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括DNA提取缓冲液、Taq DNA聚合酶、PCR反应液、上样缓冲液。本发明从遗传学角度对皮革样品基因成分进行分析鉴别，克服了传统的感官鉴别方法所面临的难题，具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点，弥补了当前皮革基因检测方法的空白，为皮革种类的鉴定提供了一种精确且易于标准化的分析方法，为质量监督等提供了技术支持，可广泛应用于皮革包括毛皮等样品基因的提取、皮革品种鉴定等方面，具有良好的经济社会效益与重大的推广应用价值，对于有效监管皮革产品质量，保护广大消费者利益具有重大意义。
文档编号C12Q1/68GK102796826SQ20121033109
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者罗海英, 柯振华, 吴玉銮, 郭新东, 刘春生, 冼燕萍, 陈筱婷, 陈意光, 罗东辉, 吴文海 申请人:广州市质量监督检测研究院