专利名称：水稻根尖特异表达启动子Pro-Os02g54880及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地说，涉及一种水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880及其应用。
背景技术：
通过转基因方法研究基因功能甚至改变重要作物的农艺性状已经成为一种常用手段。以往人们利用组成型启动子启动相关基因的表达，但这种方法不仅过分消耗了植株能量，而且可能得不到期望的表型。将目标基因以期望的水平在特定组织中表达对于研究基因功能、改良植物性状是切实可行的。因此，选择合适的器官特异启动子，有利于控制基 因在时间及空间上不同水平的表达，以减少过多的能量消耗以及不期望的其它性状。植物根系在土壤养分吸收中起重要作用，并且能与土壤微生物相互作用、分泌抗病虫物质以抵抗病菌对植物的侵袭。更重要的是，根系能够在各种非生物胁迫条件下保护地上部分，如干旱、酸性条件及重金属。当与养分吸收和耐胁迫相关的基因被特异的表达在根部细胞后，植物则会在营养匮乏及胁迫条件下正常生长。近些年，为了调控外源基因在转基因株系中不同时间及空间的表达，研究者已经克隆了很多具有不同器官或组织特异性的启动子。例如，从种子贮藏蛋白基因及非种子贮藏蛋白基因都克隆到了种子特异表达的启动子。几种花器官特异的启动子也已被鉴定。虽然已有少数根部特异表达的启动子被克隆并应用于基因功能的研究，但这些启动子中大部分只是在根部表达较强，并不完全特异在根中表达。另外，能够在水稻根尖特异表达的启动子更是鲜为人知。
发明内容
本发明的目的是提供水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880及其应用。为了实现本发明目的，本发明的水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880，其具有i) SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或ii) SEQ ID No. I所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。本发明还提供含有上述启动子的载体、含有上述启动子的转基因细胞系以及含有上述启动子的工程菌。本发明还提供含有上述启动子的转基因株系。本发明还提供水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为GUS基因、GFP基因、LUC基因等报告基因，或CKX基因、OsNAC IO基因等目标基因。优选下游基因为CKX基因或OsNACIO基因。当下游基因为CKX基因或OsNACIO基因时，可促进水稻根系生长并提高水稻抗旱能力。将水稻基因0s02g54880的起始密码子ATG上游2. 273kb序列扩增后，连接到⑶S表达载体PCAMBIA3301上，将构建好的载体转化水稻，获得转基因株系，并用GUS显示底物x-gluc对转基因植株染色,观察根尖部位的着色情况。本发明首次提出一个新的能够在水稻根尖部位特异表达启动子Pro-0s02g54880，该启动子适用于启动目标基因(如GUS基因或GFP基因)在水稻根尖的特异性表达。由于该启动子的特异性很强，因此为后续进一步确定根尖特异表达的顺式作用元件奠定了基础，且为植物抗逆基因工程研究提供了新的启动子元件。
图I为本发明实施例2中构建的Pro-0s02g54880_GUS载体图谱。图2为本发明实施例2中转基因水稻不同组织器官的染色结果；其中，A为根系染色结果，B为叶片染色结果。图3为本发明实施例2中多个独立转基因株系的根和叶片中GUS活性测定结果。
具体实施例方式
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以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行或按照制造生产厂商的使用说明。实施例I水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880的克隆I. I生物材料I. I. I植物材料水稻转基因受体材料为日本品种‘kitaake’。I. I. 2菌株和载体使用的农杆菌菌株为EHA105，载体为pCAMBIA3301。I. 2 方法I. 2. I水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880的克隆及Pro-0s02g54880_GUS载体的构建以水稻日本晴叶片为材料，用天根植物基因组提取试剂盒提取水稻总DNA，进行PCR 扩增。登录 http://rice, plantbiology. msu. edu/analyses_search_locus. shtml 网站，找到水稻转录因子0s02g54880基因，根据其上游2. 273kb序列设计PCR扩增引物，并分别在两条引物的5’端添加与载体pCAMBIA3301线性化位点同源的15个碱基。引物序列分别为prol-F:5’-CCATGATTACGAATTCTCCCCCGTGTCAACTGGATA-3 ' ;prol_R:5’-CTCAGATCTACCATGGGGACGACGTACGACGATGGT-3’。PCR 扩增体系为PCR 反应缓冲液 25 μ l，dNTP 4 μ 1，ddH20 17. 5 μ I，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(购自 Takara 公司)O. 5 μ I。反应程序为热启动98°C 10秒，57°C 5秒，72°C 2. 5分钟，30个循环后72°C延伸10分钟，最后25°C反应结束。PCR结束后，用凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收PCR产物。载体pCAMBIA3301线性化通过常规酶切。限制性内切酶EcoR I和Nco I购自Fermentas公司，反应体系为5 μ I IOX反应缓冲液，2μ I EcoR I ,2μ I Nco I，质粒2yg，用ddH20补足至50μ I。PCR仪上37 °C反应20分钟。反应结束后，用凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收PCR产物。用丨n-Fusion HD Cloning KitCClontech公司)连接载体与目的片段。吸取2 μ I反应体系直接转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，并对重组质粒进行测序，所构建的载体Pro-0s02g54880-GUS图谱见图1，载体序列如SEQ ID No. 2所
/Jn οI. 2. 2转基因水稻植株的获得取水稻‘kitaake’成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法将Pro-0s02g54880-GUS转入水稻愈伤组织中，用含有100 μ M的乙酰丁香酮和O. D.值为O. 7的农杆菌的AAM转化液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置于共培养基上进行共培养，25°C暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d,每IOd继代一次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每IOd继代一次。将分化出绿色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所 获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。用Basta筛选转基因水稻，长出4片幼叶后开始喷洒Basta(1:1000，V :V)，隔I天喷I次，共喷洒3次。共获得转基因水稻18株。其中，诱导培养基配方为N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5. 8^5. 9后加入植物凝胶4g/L。共培养基配方为N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2. 5mg/L 2，4D+0. 5g/L谷氨酰胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制,调pH至5. 2后加入植物凝胶4g/L。灭菌后，50°C左右加入乙酰丁香酮lOOlOOyg/mL。筛选培养基配方为N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调PH至5. 8^5. 9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素(购自上海纽津生物技术有限公司)或5mg/L Bialaphos (购自北京拜尔迪生物技术公司)。分化培养基配方为MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0. 05mg/L NAA+2. 0mg/L Kinetin (激动素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5. 8^5. 9后加入植物凝胶4g/L。实施例2水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880调控下游基因⑶S的表达I. I⑶S组织染色确定启动子的表达模式用⑶S显示底物x-gluc对实施例I中获得的转基因植株根部及叶片进行染色。GUS 染色液配方0. 05mmol/L 铁氰化钾,0. 05mmol/L 亚铁氰化钾,2mmol/L EDTA, 10mmol/L磷酸缓冲液，0.1% Triton X-100,0. 5mg/ml X-gluc，以水配制。黑暗下37°C染色8 12个小时后拍照。结果如图2所示，只有水稻主根根尖、侧根生长点和侧根根尖被特异染色(图2A)，而叶片及根的其他部位都未被染色(图2B)，表明该启动子只在根尖表达，且特异性强。I. 2⑶S酶活定量I. 2. I蛋白定量I.标准蛋白稀释用蛋白提取液将10mg/ml BSA标准蛋白母液分别稀释为0、5、10、20、50、100呢/1111，用于制作标准曲线。2.考马斯亮兰G-250染料试剂称IOOmg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1L。3.将G-250溶液按照I :4稀释，200ul稀释溶液各加5ul不同梯度BSA。测定各样品在595nm处的光吸收值A595，不加蛋白的G-250为对照。NANO绘制标准曲线，并测定各蛋白样品的蛋白浓度。I. 2. 2⑶S蛋白的提取、测定I.取一定量材料于I. 5ml离心管中，加入液氮，打成粉末，加入适量蛋白提取液；2. 13000rpm 4°C离心 IOmin,取上清后，13000rpm 4°C离心 IOmin,去除细胞碎片；3.取适量的上清，用考马斯亮蓝法测定蛋白的含量；4. 4-MU标准曲线配制4-MU梯度浓度液(由反应终止液配制)10 μ mol/L,·
2.5 μ mol/L, I μ mol/L, 500nmol/L, lOOnmol/L, lOnmol/L (0-10 μ M),在激发光 365nm,发射光455nm，狭缝3nm条件下，测定各样品的荧光值，绘制标准曲线；4.将 180ul 的 0. 2Mm Na2CO3 预热；5.将提取的蛋白与4-MUG I 1混合，使总体积达到80ul，37°C反应，并在反应30分钟后取50ul反应液加入到Na2CO3中终止反应,保持黑暗；6.采用Tristar LB941测定各样品荧光值，并依据4-MU标准曲线计算4-MU浓度，根据公式“⑶S活力(pmol · μ g *min) =4_MU量/蛋白量/反应时间”计算⑶S酶活。结果如图3所示，根中的⑶S活性显著高于叶片中的⑶S活性，进一步表明Pro-0s02g54880启动子在根部特异表达。溶液配制如下200ml lmol/L Na2HPO4 溶液称取 71. 628g Na2HPO4 · 12H20 溶于 200ml 水中；200ml ImoI/LNaH2PO4 溶液称取 31. 202g NaH2PO4 · 2H20 溶于 200ml 水中；0. IM磷酸缓冲液(pH7. 0) :28.85ml lmol/L Na2HPO4 和 21. 15mllmol/L NaH2PO4 混合后加水至500ml ；0.5M EDTA (pH8. 0):在 80ml 水中加入 18. 61gNa2EDTA ·2Η20，用 NaOH 调 pH 至 8· 0，溶解后定容至IOOml ；⑶S酶提取液50ml 0. IM 磷酸缓冲液(ρΗ7· 0)，2ml 0. 5MEDTA, IOOul TritonX-100，100 μ I β -巯基乙醇，加 ddH20 至 100ml ；MUG溶液取4-MUG 3. 5mg溶解于5ml提取缓冲液中，终浓度为2mM ；反应终止液(0.2mol/L Na2CO3) :10. 6g Na2CO3 溶于 500ml 水；4-MU溶液配制称0. 14096g 4-MU固体溶于40ml反应终止液(0. 2M Na2CO3)中，配制成20mM的4-MU溶液，然后再稀释到ImM浓度，贮存于_20°C，用于绘制MU标准曲线。通过染色体步移、生物信息学分析、构建植物表达载体及缺失片段载体的研究，可进一步确定水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880的核心元件，为水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880功能的研究奠定了基础。另外，本发明还验证了当水稻根尖特异表达启动子Pro_0s02g54880控制的下游基因为CKX基因或OsNACIO基因时，可促进水稻根系生长并提高水稻的抗旱能力。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880，其特征在于，其具有 i)SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或 ii)SEQID No. I所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
2.含有权利要求I所述启动子的载体。
3.含有权利要求I所述启动子的转基因细胞系。
4.含有权利要求I所述启动子的工程菌。
5.权利要求I所述的启动子在调控下游基因表达中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，下游基因为GUS、GFP、LUC、CKX或NAC基因。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，下游基因为CKX基因或OsNACIO基因。
全文摘要
本发明涉及水稻根尖特异表达启动子Pro-Os02g54880及其应用，该启动子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本发明从克隆水稻根尖特异表达启动子Pro-Os02g54880入手，通过对水稻根尖特异表达启动子Pro-Os02g54880的功能分析，从实验水平上验证了该启动子适用于启动目标基因在水稻根尖的特异性表达。
文档编号C12N1/21GK102839178SQ20121033089
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者刘斌, 张春雨, 李宏宇, 赵涛, 刘军, 林辰涛 申请人:中国农业科学院作物科学研究所