专利名称：山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇abcden的组合基因的制作方法
技术领域：
本发明属于エ业微生物领域，涉及山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的组合基因。
背景技术：
维生素C (Vc)又名抗坏血酸，是机体营养、生长所必需的ー种微量水溶性维生素，在抗氧化和維持新陈代谢平衡等方面起着重要的作用，广泛应用于制药エ业、食品エ业、化妆品エ业和饲料エ业等，其应用范围不断扩展，市场需求稳定。在エ业生产中，维生素C主要通过“ニ步发酵法”生产，即第一步发酵使用黑醋杆菌将D-山梨醇转化为L-山梨糖,第二步发酵使用氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans) 和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合发酵将L-山梨糖转化为维生素C的前体
2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。其中氧化葡糖杆菌为产酸菌，但单独培养生长和产酸能力很弱，需在伴生菌巨大芽孢杆菌促进下完成生长和产酸过程。两菌混合发酵生产2-酮基-L-古龙酸的效率尚有提升空间，而提高产酸菌氧化葡糖杆菌的糖酸转化能力是提高混菌发酵生产效率的关键。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种山梨糖脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的组合基因。本发明的第二个目的是提供ー种山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的组合基因。本发明的第三个目的是提供一种山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的组合基因。本发明的第四个目的是提供ー种含有山梨糖脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN组合基因的转化宿主细胞。本发明的第五个目的是提供ー种含有山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN组合基因的转化宿主细胞。本发明的第六个目的是提供ー种含有山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的组合基因的转化宿主细胞。本发明的技术方案概述如下一种山梨糖脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的组合基因，它是列序表中SEQ ID No. 4所述核苷酸序列。ー种山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的组合基因，它是序列表中SEQ ID No. 5所述核苷酸序列。一种山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的组合基因，它是序列表中SEQ ID No. 6所述核苷酸序列。ー种含有山梨糖脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN组合基因的转化宿主细胞，是将含有序列表中SEQ ID No. 4核苷酸序列的重组载体导入到宿主氧化葡糖杆菌得到的转化宿主细胞。ー种含有山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN组合基因的转化宿主细胞，是将含有序列表中SEQ ID No. 5核苷酸序列的重组载体导入到宿主氧化葡糖杆菌得到的转化宿主细胞。ー种含有山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的组合基因的转化宿主细胞，是将含有序列表中SEQ ID No. 6核苷酸序列的重组载体导入到宿主氧化葡糖杆菌得到的转化宿主细胞。本发明的方法通过构建山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成 基因簇ABCDEN不同组合方式的氧化葡糖杆菌重组菌，能明显提高与巨大芽孢杆菌混合培养中的2-酮基-L-古龙酸的产量，最高能提高20%。
图I为原始氧化葡糖杆菌及3种含有重组载体的氧化葡糖杆菌分别与巨大芽孢杆菌混菌发酵結果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进ー步的说明。下面的内容及实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不用于限制本发明。本发明所使用的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)是以保藏编号为CGMCCNo. I. 110为例，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)以保藏编号为CGMCC No I. 459 %例，上述两个菌均从中国普通微生物菌种保藏管理中心购得。所用质粒PBBR1MCS从中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心(Biovector Science Lab, Inc)购得。通过合成生物技术手段来改造氧化葡糖杆菌，搭配产酸关键酶——山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶的表达量及其辅酶——吡咯喹啉醌的合成量的最适关系，提高氧化葡糖杆菌与巨大芽孢杆菌混菌发酵转化L-山梨糖为2-酮基-L-古龙酸的性能，提供一种山梨糖/山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因组合提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法。实施例I(I)山梨糖脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN组合的氧化葡糖杆菌构
建以氧化葡糖杆菌基因组为模板，以序列表SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8为引物，PCR扩增带有KpnI和HindIII酶切位点的山梨糖脱氢酶基因(序列表SEQ ID No. I);以SEQ IDNo. 11和SEQ ID No. 12为引物，以氧化葡糖杆菌基因组为模板，PCR扩增带有SpeI和SacI酶切位点的吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN及其上游启动子(序列表SEQ ID No. 3);分别双酶切后，与经KpnI和SacI酶切的载体pBBRlMCS连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5 α后验证连接正确的质粒，再通过电转化方法导入氧化葡糖杆菌，获得山梨糖脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN组合的氧化葡糖杆菌。
(2)山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN组合的氧化葡糖杆菌构建以氧化葡糖杆菌基因组为模板，以序列表SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10为引物，PCR扩增带有HindIII和BamHI酶切位点的山梨酮脱氢酶基因(序列表SEQ IDNo. 2)，以SEQID No. 11和SEQ ID No. 12为引物，以氧化葡糖杆菌基因组为模板，PCR扩增带有SpeI和SacI酶切位点的吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN及其上游启动子(序列表SEQ ID No. 3)，分别双酶切后，与经KpnI和SacI酶切的载体pBBRlMCS连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5 α后验证连接正确的质粒，再通过电转化方法导入氧化葡糖杆菌，获得山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN组合的氧化葡糖杆菌。(3)山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN组合的氧化葡糖杆菌构建以氧化葡糖杆菌基因组为模板，以SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8为引物，PCR扩增带有KpnI和HindIII酶切位点的山梨糖脱氢酶基因(序列表SEQ ID No. I),以氧化葡糖杆菌 基因组为模板，以SEQ ID Νο.9和SEQ ID No. 10为引物，PCR扩增带有HindIII和BamHI酶切位点的山梨酮脱氢酶基因(序列表SEQ ID No. 2)，以氧化葡糖杆菌基因组为模板，以SEQID No. 11和SEQID No. 12为引物，PCR扩增带有SpeI和SacI酶切位点的吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN及其上游启动子(序列表SEQ ID No. 3)，分别双酶切后，与经KpnI和SacI酶切的载体pBBRlMCS连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5 α后验证连接正确的质粒，再通过电转化方法导入氧化葡糖杆菌，获得山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN组合的氧化葡糖杆菌。实施例2含重组载体的氧化葡糖杆菌与巨大芽孢杆菌的混菌发酵(I)固体培养固体培养基的制备为按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素 lg，蛋白胨 10g，琼脂 20g，KH2P04 lg，MgSO4 O. 2g, CaCO3 Ig 加水至 1L，调 pH 为 6· 8，121°C灭菌20min，制成固体培养基；将实施例I获得的保藏于体积浓度为20%的甘油水溶液中的3种重组菌及原始菌株氧化葡糖杆菌分别取150 μ L接种于固体培养基上，30°C培养48小时；取150 μ L保藏于体积浓度为20%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)接种于固体培养基上，30°C培养24小时；(2)种子培养种子培养基制备为按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素 lg，蛋白胨 10g，KH2P04 lg, MgSO4 O. 2g, CaCO3 Ig 加水至 1L，调 pH 为 6· 8，121°C灭菌20min,制成种子培养基；将经步骤(I)培养的3种重组菌及原始菌株氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在30°C，250r/min摇床振荡培养，48h，得到各氧化葡糖杆菌的种子液；将经步骤(I)培养的巨大芽孢杆菌转入种子培养基，在30°C，250r/min摇床振荡培养，24h，得到巨大芽孢杆菌的种子液；(3)发酵
发酵培养基制备为按比例称取L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO4 Ig,MgSO4 O. 5g，CaCO3 lg，加水至1L，调pH为7. 0,121°C灭菌20min，制成发酵培养基；将巨大芽孢杆菌种子液和3种重组菌及原始菌株氧化葡糖杆菌种子液接种到发酵培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为4X108cfu/ml，使各种氧化葡糖杆菌的密度为4父1(^血/1111，在301，25017/1^11摇床振荡培养120h，获得2-酮基-L-古龙酸。实施例32-酮基-L-古龙酸和L-山梨糖含量测定采用高效液相色谱法(HPLC)。·样品制备取发酵培养不同时间的发酵液ImL于I. 5mL离心管中，10000r/min转速离心3min,取上清100 μ L于I. 5mL离心管中，并加入900 μ L流动相(5mM H2SO4)得到稀释十倍的样品。振荡混匀后，用O. 22μπι的纤维素微孔滤膜过滤样品，得到待测样品。高效液相色谱条件色谱柱bio-rad HPX-87H,流动相5mM H2SO4J^1速0. 6mL/min,柱温65°C,示差检测器。检测结果见附图I。原始氧化葡糖杆菌与巨大芽孢杆菌利用实施例2的发酵条件进行搭配混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸浓度达65. 9g/L ;用实施例I的方法获得3种重组菌和巨大芽孢杆菌混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸浓度较原始菌株有提高，其中山梨糖脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN组合(74. 2g/L )、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN组合(73. Og/L),山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN搭配(79. lg/L)，与原始混菌相比分别提高了 12. 6%, 10. 8%和20. 0%。实验证明通过对产酸关键酶(山梨糖脱氢酶、山梨酮脱氢酶)和其辅酶吡咯喹啉醌合成途径的不同组合搭配进行理性设计和组合优化，可以提高氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌混菌体系发酵生产2-酮基-L-古龙酸的浓度。
权利要求
1.一种山梨糖脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的组合基因，其特征是它是序列表中SEQ ID No. 4所述核苷酸序列。
2.一种山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的组合基因，其特征是它是序列表中SEQ ID No. 5所述核苷酸序列。
3.一种山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的组合基因，其特征是它是序列表中SEQ ID No. 6所述核苷酸序列。
4.一种含有山梨糖脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN组合基因的转化宿主细胞，其特征是将含有序列表中SEQ ID No. 4核苷酸序列的重组载体导入到宿主氧化葡糖杆菌得到的转化宿主细胞。
5.一种含有山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN组合基因的转化宿主细胞，其特征是将含有序列表中SEQ ID No. 5核苷酸序列的重组载体导入到宿主氧化葡糖杆菌得到的转化宿主细胞。
6.一种含有山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的组合基因的转化宿主细胞，其特征是将含有序列表中SEQ ID No. 6核苷酸序列的重组载体导入到宿主氧化葡糖杆菌得到的转化宿主细胞。
全文摘要
本发明公开了一种山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的组合基因，是序列表中SEQ ID No.6所述核苷酸序列。本发明的方法通过构建山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN不同组合方式的氧化葡糖杆菌重组菌，能明显提高与巨大芽孢杆菌混合培养中的2-酮基-L-古龙酸的产量，最高能提高20%。
文档编号C12N15/62GK102816780SQ20121033033
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者元英进, 杜瑾 申请人:天津大学