专利名称：一种利用脂肪酰acp还原酶生物合成脂肪醇的方法
技术领域：
本发明属于可再生能源和生物质能源以及化工原料生产领域，具体涉及改造异养微生物自身脂肪酸代谢途径从而生产脂肪醇的方法。
背景技术：
脂肪醇(fatty alcohols)是洗漆剂用表面活性剂的原料之一,在洗漆剂、护肤品、化妆品、药品中有大量运用。脂肪醇最早是由鲸蜡制取的，所得的混合脂肪醇经磺化中和后成为硫酸盐，是最早的一种阴离子洗涤剂。其后开发利用来源比较丰富的椰子油、棕榈油和牛油为原料，水解所得脂肪酸再还原为醇，统称为天然脂肪醇。石油化学工业发展后，以石油产品为原料，生产的脂肪醇称为合成脂肪醇。全世界总的脂肪醇消费量大约在250万吨左右。至20世纪末，天然醇与合成醇的比例大致为4. 9 5.1。近年来由于石油原料价格持续高涨，加上美洲和亚洲地区对脂肪醇的需求增加，以及人们对天然原料脂肪醇的偏好， 增加了对天然脂肪醇的需求。脂肪醇的价格已高达2000美元每吨，目前全球有许多国家依然需要依靠进口满足脂肪醇的需求。但是依靠石油产品为原料的脂肪醇也大量消耗石油的储备量，在资源日益稀缺的今天，这种发展方式将会逐渐淘汰，因此，需要一种更环保、可再生的生产方式。如果能够通过在改造后的脂肪酸代谢通路中异源表达脂肪醇合成酶，即脂肪酰载体蛋白还原酶，即可以通过微生物发酵产生大量的脂肪醇。Michael 等人在 2000 年纯化了 jojoba 的 fatty acyl CoA reductase,并证明
该基因-jojoba far能将脂肪酸还原成为脂肪醇,该工作发表在“Plant Physiology”
(James G. Metz, Michael R. Pollard 1，LanaAndersonj Thomas R. Hayes, and MichaelW.Lassner. 2000. Purification of ajojoba embryo fatty acyl-Coenzyme A reductaseand expression ofits cDNA in high erucic acid rapeseed. Vol.122:635 - 644)。Tan等在缺乏合成脂肪醇能力的蓝细菌Syn-LY2菌株中分别表达了来自于jojoba，鼠，拟南芥等的脂肪酰辅酶A还原酶FAR，发现异源表达jojoba及其中一种拟南芥FAR的蓝细菌能够合成脂肪醇，而异源表达其他的几种FAR的蓝细菌不能产生脂肪醇。该工作发表在 “Metabolic Engineering，，上(Tan X，Yao L，Lu X. et al. 2010. Photosynthesisdriven conversion of carbon dioxide to fatty alcohols and hydrocarbons incyanobacteria. Metabolic Engineering 13 (2011) 169 - 176)。刘天里教授等人开发了一个“cell free”体系，将脂肪酸代谢途径中的限速步骤进行了研究，指导如何提高微生物体内的脂肪酸含量，该工作发表于“Metabolic Engineering” (Tiangang Liu，HarmitVorajChaitan Khosla. 2010. Quantitative analysis and engineering of fatty acidbiosynthesis in E. coli. Metabolic Engineering 12:378 - 386)。2011 年，石开究人员克隆并鉴定了一个参与单子叶植物水稻花药及花粉外壁发育的脂肪酰基载体蛋白还原酶DPW，研究揭不，DPW蛋白定位于质体中，重组蛋白可以脂肪酉先基载体蛋白为底物，将碳十六脂肪酸还原为其相应的脂肪醇，从而参与花药及花粉外壁的合成，并且通过遗传互补等实验证明DPW在双子叶植物拟南芥中具有保守的生物学功能(Shi J, Tan H，YuXH，Liu Y，Liang Wj Ranathunge K，et al. Defective pollen wall is required foranther and microspore development in rice and encodes a fatty acyl carrierprotein reductase.The Plant cell 2011;23:2225-46)。 2010 年，Andreas Schirmer等在Science上发表一项工作，其中证明了来自于蓝细菌PCC7942的一段基因序列PCC7942-orfl594 (AAR 基因)和 PCC7942_orfl593 共表达可以产生脂肪烷烃(SchirmerA, Rude MAj Li X，Popova Ej del Cardayre SB. Microbial biosynthesis of alkanes.Science 2010;329:559-62)。脂酰载体蛋白还原酶基因便于进行优化，目前可以进行遗传操纵的微生物种类繁多，脂肪酸合成代谢途径又是每种微生物生存的必需条件，并且目前的研究已经对该条途径认识较为深刻，其限速步骤基本清楚，利于进行改造。众所周知，由于异养微生物或异养细胞生长迅速并且需要外源补充营养物质，这就便于通过补充培养基或者增加某些营养成分来提高其生产能力，使其在工业上实现大规模产业化生产。并且由于其必须依赖人工补给养料，所以可以严格控制其生产的各个阶段，防止其肆意生长而造成无法控制的局面。目前工业上已经有许多利用异养微生物生产发酵获得产品的成功实例，利用脂酰载体蛋白还原酶基因在异养微生物体内通过改造其自身代谢途径生产脂肪醇有很大的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用脂肪酰ACP还原酶生物合成脂肪醇的方法，在异养微生物或异养细胞体内改造其脂肪酸代谢途径以及表达外源蛋白以生产重要的化工原料一脂肪醇。为实现上述目的，本发明提供的利用脂肪酰ACP还原酶生物合成脂肪醇的方法，其是将脂肪酰载体蛋白还原酶基因导入异养微生物或异养细胞内，并诱导表达。所述脂肪酰载体蛋白还原酶基因编码SEQ ID No. 2或SEQ IDNo. 4所示的蛋白质。或者编码SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有DPW蛋白和AAR蛋白同等活性的由DPW蛋白和AAR蛋白衍生得到的蛋白质。优选为DPW基因和AAR基因。本发明所述异养微生物或异养细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、细菌细胞和蓝细菌细胞。此外，本发明方法还包括通过改造异养微生物或异养细胞的代谢途径或者根据其密码子的偏爱性对脂酰载体蛋白还原酶基因进行优化，以提高脂肪醇的产量。此外，本发明方法还包括对转化脂酰载体蛋白还原酶基因异养微生物进行耐受性筛选，获得优势菌株，从而提高脂肪醇的产量。其中，所述改造的异养微生物代谢途径是该微生物体内的脂肪酸代谢途径，包括提高脂肪酸产量或者降低脂肪酸产量用以生产脂肪醇的途径，例如在大肠杆菌中导入PMSD8质粒,过量表达fatty acetyl-CoA carboxylase,提高用以生产脂肪醇的脂肪酸含量；改变该微生物体内脂肪酸代谢途径中间物用以生产脂肪醇的途径，例如敲除大肠杆菌中的fadE基因以积累更多脂肪酸代谢途径中间物的脂肪酰载体蛋白，从而获得更多的脂肪醇；改变该微生物体内脂肪酸代谢途径衍生物用以生产脂肪醇的途径。其中，所述的菌种改造包括利用脂肪醇耐受性筛选改造获得的耐受型菌株。
本发明还提供一种异养微生物或异养细胞，其是转化脂肪酰载体蛋白还原酶基因的异养微生物或异养细胞。以及通过上述改造途径得到的优选异养微生物或异养细胞。所述脂肪酰载体蛋白还原酶基因编码SEQ ID No. 2或SEQ IDNo. 4所示的蛋白质。或者编码SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有DPW蛋白和AAR蛋白同等活性的由DPW蛋白和AAR蛋白衍生得到的蛋白质。优选为DPW基因和AAR基因。本发明的优点是在异养微生物中引入外源基因改造其自身的脂肪酸代谢途径以实现生产工业原料脂肪醇的目的，不需要通过过多的化学合成反应，减少了环境的污染，也减少了对石油储量的消耗。同时，由于大部分异养微生物生长速度快，便于进行遗传操作，其抗污染性能优异，且人工可以调节其生长速度和防止其肆意生长破坏环境，种种因素表明改造异养微生物进行工业生产是切实可行的。
图I为设计构建的pRL108表达载体示意图。图2为设计构建的pFASR表达载体示意图。图3为大肠杆菌RL6经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ；C14:0 表不 tetradecanol ；C16:0 表不 hexadecanol。图4为大肠杆菌RL7经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ;C18:1 表不Δ9—octadecanolο图5为大肠杆菌RL8经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ;C18:1 表不Δ9—octadecanolο图6为大肠杆菌RL9经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ;C18:1 表不Δ9—octadecanolο图7为大肠杆菌RLlO经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C18:1表不 Δ 9-octadecanol ο图8为大肠杆菌RLll经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C18:1表不 Δ 9-octadecanol ο图9为大肠杆菌RL12经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。图10为大肠杆菌RL13经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。图11为大肠杆菌RL14经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。图12为大肠杆菌RL15经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。图13为大肠杆菌RL16经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。图14为大肠杆菌RL17经IPTG诱导后，其培养物进行脂肪醇提取后的GC-MS结果图。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。图15为大肠杆菌RL15和RL17经分批补料发酵试验后的结果。 图16基因敲除质粒pRL103上下游PCR扩增示意图。图17基因敲除菌RL100构建示意图。图18为挑取的疑似正确的重组菌RL100进行的PCR验证结果图，其中泳道f 10是挑取的不同菌，3、4、6、7、9为经PCR验证的RL100重组菌，marker为DNA分子量标准。
具体实施例方式本发明的目的通过以下措施来达到在异养微生物体内弓丨入外源基因——脂肪酰载体蛋白还原酶，从而催化自身的脂肪酰载体蛋白还原形成脂肪醇。引入的脂肪酰载体蛋白还原酶还原酶就是来源于水稻的DPW基因和来源于蓝细菌PCC7942的AAR基因。大肠杆菌作为异源微生物的一种，遗传操作背景清楚，生长速度快，培养条件温和，是进行发酵生产的首选菌株之一，实施例中选用一种大肠杆菌BL21 (DE3)或MG1655 (DE3) Δ recA Δ endA作为生产菌株，选取其表达质粒pET28，并将其改造为可以表达DPff基因的pRL108载体和可以表达AAR基因的pFASR载体。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。实施例I将已公布的DPW基因序列(SEQ ID No. 1，由金斯瑞生物科技有限公司合成)，并通过EcoR I和Xho I两个酶切位点将其克隆于pET28载体上，构建好的质粒被命名为pRL108o将BL21 (DE3)中的脂酰载体蛋白脱氢酶fadE基因敲除，可以减少脂肪酰辅酶A的消耗，从而积累更多的脂肪酰载体蛋白和脂肪酰载体蛋白用于生产脂肪醇。该实例中将敲除fadE基因的大肠杆菌BL21(DE3)命名为TL101。将TL101中的脂肪酰辅酶A合成酶fadD基因敲除，可以中断脂肪酰辅酶A的形成，使细胞体内只合成脂肪酰载体蛋白。该实例中按照同源重组的原理，构建一敲除质粒用于敲除TL101中的fadD基因。通过两条引物 pRLl-S(TTAAGCATGC GAAGATTTTA CTGCGGATAT T (Sph I ))和 pRLl-AS(ATATGGATCCGCGTTAAGTC AGTCGTC(BamH I ))PCR扩增一段Ikb左右的左臂——即fadD基因的上游序列，通讨另两备引物 DRL2-S(ATATGGATCC TTCTTCACCT CTAAAATGCG T(BamH I ))和
PRL2-AS (ATATGAGCTC GATGAAAACG GTATCTGGC (Sac I ))扩增一段 Ikb 左右的右臂-即
fadD基因的下游序列，将两条基因序列拼接并克隆于温敏质粒PMAK705上，成功构建敲除质粒pRL103。将构建好的敲除质粒PRL103导入大肠杆菌TLlOl感受态细胞，由于敲除质粒PRL103上含有跟大肠杆菌基因组同源的序列，利用同源重组的原理，这段序列能跟大肠杆菌基因组上的fadD基因前后的相同序列发生两次同源重组，从而可以敲除fadD基因。并且利用敲除质粒PRL103的温度敏感性质进行反复温度改变培养，让其既进行重组又可以自行丢失，从而利用抗生素敏感试验筛选出疑似正确的重组菌。用两条引物对(KS AAGCGAAACCCCATGACATC ；KAS :GTCGATGTGAACGGITTTC)进行菌落 PCR 验证，由于在 RL100 中，fadD基因被敲除，因此其PCR片段比TL101PCR片段小约I. 7kb，恰好为fadD基因大小(图18)。将在大肠杆菌TLlOl基础上成功敲除fadD的大肠杆菌命名为RL100并进行保种。John Cronan教授曾构建的质粒pMSD8可以在大肠杆菌中过量表达fatty acetyl-CoA carboxylase(Mark S.Davis, Jose' Solbiati, and John E.Cronan, Jr. 2000.Overproduction of Acetyl-CoA Carboxylase Activity Increases the Rate ofFatty Acid Biosynthesis in Escherichia coli. THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY. 275(37) :28593-28598.)。在本实例中，本发明使用该质粒提高脂肪醇的产量。用包含有十二醇(dodecanol)、十四醇(tetradecanol)和十六醇(hexadecanol)的LB培养基对TL101进行脂肪醇耐受性筛选，从80mg/L的脂肪醇(fatty alcohols)浓度逐步增加到终浓度为I. 2g/L的脂肪醇(fatty alcohols)对TL101进行筛选，最终在最高浓度为I. 2g/L的脂肪醇(fatty alcohols)浓度的条件下连续进行一周的筛选,将最终存活的细胞保种，并命名为RL101。将pRL108转化进入BL21 (DE3)，利用卡那霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为 RL6。将pRL108转化进入MG1655 (DE3) Δ recA Δ endA,利用卡那霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为RL7。将PRL108转化进入TL101，利用卡那霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为RL8。将pRL108转化进入RL101，利用卡那霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为RL9。将pRL108转化进入RL100，利用卡拉霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为RLlO。将pMSD8和pRL108共转化进入RL101，利用卡那霉素和羧苄青霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为RLlI。将RL6、RL8、RL10三种菌分别接种于含有相应抗生素的5mLLB培养基中37°C培养约12h后，将其转入含有相应抗生素的300mLLB培养基中在37°C继续培养约90min后，待其OD达到0. 6时，加入0. 25mM的IPTG进行诱导表达，继续37°C培养12h后，再转入30°C培养6小时。将RL7、RL9、RL11三种菌分别接种于含有相应抗生素的5mLLB培养基中30°C培养约12h后，将其转入含有相应抗生素的300mLLB培养基中在30°C继续培养约120min后，待其OD达到O. 6时，加入O. 25mM的IPTG进行诱导表达，继续30°C培养18小时。诱导表达18h后,取IOOmL培养物进行fatty alcohols提取。RL6、RL8、RLlO的提取方法为向IOOmL培养物中加入100 μ L 10mg/mL的碳十五醇作为内参，使其终浓度为10mg/L，并加入2mL正癸烷。随后加入200mL的有机液A(hexane: isopranol=3:2),剧烈萃取10分钟后，静置10分钟，去除下层水溶液后，再加入ISOmL硫酸钠溶液B，继续剧烈萃取10分钟，再静置10分钟，去除下层水溶液，将上层有机层转入500mL的圆底烧瓶进行旋转蒸发。条件为50°C水浴，压力为50psi。待有机液体正己烷和异丙醇被蒸发完后(在此条件下，正癸烷不能被旋转蒸发)，将溶有产物的正癸烷溶液其转移入一个带有内置管的样品瓶中。RL7、RL9和RLll提取方法为在IOOmL培养物中加入100 μ L 10mg/mL的pentadecanol 作为内参，再加入 200mT,的溶液 A(hexane: isopranol=3:2),剧烈萃取 IOmin后，静置IOmin,去除下层水溶液后,再加入180mL的溶液B (12g硫酸钠溶于180mL水中)，继续剧烈萃取lOmin，再静置IOmin中，去除下层水溶液，将上层有机层转入500mL的圆底 烧瓶进行旋转蒸发。条件为40°C水浴，压力为250psi。待有机液体被蒸发完后，分别3次用3mL的正己烷溶解圆底烧瓶内壁的产物，再将这9mL液体转移到一个25mL的圆底烧瓶中，同样条件下进行旋转蒸发。待有机层蒸发完毕后，用300 μ L的正己烷将圆底烧瓶中的产物溶出，将其转移入一个带有内置管的样品瓶中。将处理好的样品进行GC-MS (气相色谱-质谱联用仪)检测。GC-MS为安捷伦的5975C/7890A系统，使用柱子为HP-INNOWax，氦气流速lmL/min，进样量I μ L，分流比为10:1，RL6、RL8和RLlO的程序温度为150°C 2分钟，每分钟升高5°C至240°C，保持5分钟。RL7、RL9和RLll程序温度为50°C 2min，每分钟升高10°C至240°C，保持lOmin。实验结果六株菌中均产生了脂肪醇，产物包括碳十四饱和醇、碳十六饱和醇和碳十八烯醇，在大肠杆菌RLll中产量达到最高，约为10. 5mg/L。该实例充分证明了利用DPW蛋白生产脂肪醇的可行性。实施例2将已公布的AAR基因序列经优化后进行全合成(SEQ ID No. 3，由金维智生物科技有限公司合成)，并通过Nco I和BamH I两个酶切位点将其克隆于pET28载体上，构建好的质粒被命名为PFASR。将pFASR转化进入BL21 (DE3)，利用卡那霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为RL12。将pFASR转化进入MG1655 (DE3) Λ RECA Λ ENDA，利用卡那霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为RLl3。将将pFASR转化进入TL101，利用卡那霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为RL14。将pFASR转化进入RL101，利用卡那霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为RL15。将pFASR和pMSD8共转化进入TLlOI，利用卡拉霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为RL16。将pFASR和pMSD8共转化进入RLlO I，利用卡那霉素和羧苄青霉素筛选获得成功的转化子，将其命名为RLl7。将以上六种菌分别接种于含有相应抗生素的5mLLB培养基中30°C培养约12h后，将其转入含有相应抗生素的300mLLB培养基中在30°C继续培养约120min后，待其OD达到
O.6时，加入O. 25mM的IPTG进行诱导表达，继续30°C培养18小时。诱导表达18h后,取IOOmL培养物进行fatty alcohols提取。提取方法为在IOOmL培养物中加入100 μ L 10mg/mL的pentadecanol作为内参，再加入200mL的溶液A (hexane:isopranol=3:2),剧烈萃取IOmin后，静置IOmin,去除下层水溶液后，再加入180mL的溶液B (12g硫酸钠溶于180mL水中)，继续剧烈萃取lOmin，再静置IOmin中，去除下层水溶液，将上层有机层转入500mL的圆底烧瓶进行旋转蒸发。条件为40°C水浴，压力为250psi。待有机液体被蒸发完后，分别3次用3mL的正己烷溶解圆底烧瓶内壁的产物，再将这9mL液体转移到一个25mL的圆底烧瓶中，同样条件下进行旋转 蒸发。待有机层蒸发完毕后，用300μ L的正己烷将圆底烧瓶中的产物溶出，将其转移入一个带有内置管的样品瓶中。将处理好的样品进行GC-MS (气相色谱-质谱联用仪)检测。GC-MS为安捷伦的5975C/7890A系统，使用柱子为HP-INNOWax，氦气流速lmL/min，进样量I μ L，分流比为10:1，程序温度为50°C 2min，每分钟升高10。。至240°C，保持IOmin0挑取约为10个成功转化子RLlOl/pFASR或RL101/pMSD8/pFASR培养于5mL的含有相应抗生素的M9培养基中，30°C过夜培养后，将其转入IOOOmL含有相应抗生素M9培养基中继续在30°C培养24小时后，将IOOOmL的菌液分批转入无菌的80mL离心管中，5000rpm离心5分钟收集菌体，最后将所有菌体用50mL含有相应抗生素M9培养基悬浮均匀作为种子液上罐发酵，发酵的规模为4L。当罐中OD长到6左右时，以0. 24mL/min的速率补充补料培养基，当OD长到13左右时，加入终浓度0. 25mM IPTG进行诱导，诱导后每隔4小时提取90mL的培养物用液氮迅速冷冻后，保存于_80°C冰箱。在补料前保持融氧为80%以上，补料后由于菌体大量生长融氧自然下降，尽量保持融氧较高。发酵产物提取脂肪醇方法将培养物从_80°C冰箱中取出，自然融化，向40mL培养物中加入40 μ L 100mg/mL的碳十五醇作为内参，使其终浓度为100mg/L，并加入2mL正癸烷。随后加入200mL的溶液A (heXane:iS0pran0l=3:2)，剧烈萃取10分钟后，静置10分钟,去除下层水溶液后,再加入180mL硫酸钠溶液B (12g硫酸钠溶于180mL水中)，继续剧烈萃取10分钟，再静置10分钟，去除下层水溶液，将上层有机层转入500mL的圆底烧瓶进行旋转蒸发。条件为50°C水浴，压力为50psi。待有机液体正己烷和异丙醇被蒸发完后(在此条件下，正癸烷不能被旋转蒸发)，将溶有产物的正癸烷溶液其转移入一个带有内置管的样品瓶中。发酵产物脂肪醇检测方法将提取好的样品进行GCMS (气相色谱质谱联用仪)检测，GCMS为安捷伦5975C/7890A系统。气相色谱柱为HP-INNOwax柱，氦气流速为lmL/min，分流比为10: I。进样量为I μ L0程序温度为50°C 2分钟，每分钟升高10°C至240°C，保持10分钟。实验结果六株菌中均产生了脂肪醇，产物包括碳十四饱和醇、碳十六饱和醇、碳十六烯醇和碳十八烯醇。将大肠杆菌RL15和RL17进行分批补料发酵实验，结果表明RL15的产量最高达到0. 8g/L，产率达到I. 6g/L/day，RL17的产量最高达到0. 65g/L，产率达到2gL/day。该实例充分证明了利用AAR蛋白生产脂肪醇的可行性，并且该蛋白有很大的工业化生产脂肪醇的潜力。 序列表说明SEQ ID No. I和2分别为DPff基因序列和蛋白序 列；SEQ IDNo. 3和4分别为经优化后的AAR基因序列和蛋白序列；SEQ ID No. 5&6是扩增fadD左臂的引物；SEQID No. 7&8是扩增fadD右臂的引物；SEQ ID No. 9&10是检验为RLlOO阳性克隆的引物。
权利要求
1.一种利用脂肪酰ACP还原酶生物合成脂肪醇的方法，其是将脂肪酰载体蛋白还原酶基因导入宿主细胞体内，并使该基因在该宿主细胞体内表达。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述脂肪酰载体蛋白还原酶基因编码如下蛋白1)SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列组成的蛋白；或，2) SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸插入、取代和/或增加一个或几个氨基酸组成的与I)所述蛋白具有同等功能的蛋白。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，将脂肪酰载体蛋白还原酶基因克隆于表达载体上，导入相应的宿主体内或插入宿主细胞的基因组内，并诱导表达。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，还包括通过改造宿主细胞脂肪酸合成和降解的代谢途径或者根据宿主细胞密码子的偏爱性对脂肪酰载体蛋白还原酶基因进行优化，以提高脂肪醇的产量。
5.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，还包括对转化脂肪酰载体蛋白还原酶 基因异养微生物进行耐受性筛选，获得优势菌株，从而提高脂肪醇的产量。
6.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、细菌细胞和蓝细菌细胞。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，改造的宿主细胞代谢途径是该宿主细胞体内的有关脂肪酸合成和代谢的相关途径。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，改造的宿主细胞代谢途径是该宿主细胞体内提高脂肪酸的产量或者降低脂肪酸的产量用以生产脂肪醇的途径。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，改造的宿主细胞代谢途径是改变宿主细胞体内脂肪酸代谢途径中间物用以生产脂肪醇的途径。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，改造的异养微生物代谢途径是改变该异养微生物体内脂肪酸代谢途径衍生物用以生产脂肪醇的途径。
11.一种异养微生物或异养细胞，其是接受转脂肪酰载体蛋白还原酶基因的异养微生物或异养细胞。
12.根据权利要求11所述的异养微生物，其特征在于，所述脂肪酰载体蛋白还原酶基因为j/f基因或基因，其编码如下蛋白1)SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列组成的蛋白；或，2) SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸插入、取代和/或增加一个或几个氨基酸组成的与I)所述蛋白具有同等功能的蛋白。
全文摘要
本发明公开了利用脂肪酰ACP还原酶生物合成脂肪醇的方法，该方法是将脂肪酰载体蛋白还原酶基因导入宿主细胞体内，并使该基因在该宿主细胞体内表达，从而改造异养微生物或异养细胞体内的脂肪酸代谢途径以生产脂肪醇。本发明还进一步通过代谢改造，提高脂肪醇的产量。本发明实现了在微生物体内通过生物合成的方法合成脂肪醇，该技术是一种可再生的、低消耗的技术，且这种环保的生产方式能够减少对稀缺资源石油的消耗，也不需要再进行化学改造就可以直接生产脂肪醇，在工业上有很大的应用前景。
文档编号C12N9/02GK102827880SQ201210330969
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年7月9日
发明者刘天罡, 刘然, 付爱思 申请人:武汉大学