一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K₂的方法

专利名称：一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K₂的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产维生素K2的方法，特别涉及一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素1(2的方法。
背景技术：
维生素K (MK)是一类含有甲蔡醒结构的抗出血性化合物的总称，又名为凝血维生素或抗出血维生素。维生素K (MK)可分为两大类，一类为脂溶性化合物KpK2和K3，可在动植物体内提取；另一类为水溶性化合物K4,人工化学合成。最重要的为I、K2和K3，商品用维生素K是维生素K3的衍生物。在动物体内，具有生物活性的是K2,而维生素K1和K3需要在肝脏内转化为K2才能发挥功能。维生素K2不仅在血液凝固过程中，在骨骼代谢上也有着重要作用，已被广泛用于 骨质疏松等疾病的预防和治疗。维生素K2是肠道群细菌的代谢产物，在发酵过程后的某些食品中有少量的维生素K2，发酵纳豆食品中维生素K2含量尤其丰富。文献报道指出目前能够用于发酵生产MK的菌种主要是革兰氏阴性菌的产黄杆菌和属于革兰氏阳性菌的纳豆芽孢杆菌。Yoshinori T等和Toshiro S等发现分别对纳豆中分离的芽孢杆菌进行诱变处理后可以提高维生素K的产量。原生质体融合起源于20世纪60年代，并于70年代逐渐发展起来的重要基因重组技术。是通过酶或机械的方法除去细胞壁，使双亲株的微生物菌体细胞形成球状原生质体，经过物理、化学或生物方法使双亲株的原生质体融合，再发生染色体基因组间的交换重组，使融合子具有双亲的优势性状，在适宜的培养条件下再生细胞壁，经过合理的筛选，从再生菌体中获得重组子。近年来，该技术已成为细胞生物学研究领域迅速发展的方向之一。该技术不仅能够改良菌种遗传性状、提升有用代谢产物产量，还能综合不同菌株的代谢特性，产生新的有用代谢产物，在工业生产和遗传育种上展示出美好的应用前景。实践证明，利用原生质体融合技术可以获得具有双亲优良特性的融合子，并且细菌之间的原生质体融合可以克服细菌种属之间的差异而实现基因重组。谷吉树等试验了甘油、葡萄糖、果糖和可溶性淀粉等十几种碳源对产黄杆菌生产MK的影响，发现以甘油为碳源的培养基中MK的含量最高。纳豆芽孢杆菌发酵时，尽管以蔗糖为碳源细胞增长最快，但以甘油为碳源时MK的产量最高。以大豆提取物为氮源时，MK-7产量最高，而且由于大豆提取物是纳豆加工的副产物，因此价格也很便宜，是一种理想的氮源。酵母膏不适合单独作氮源，但在另外加有氮源后，适当添加酵母膏会增加MK产量。无机盐中，K2HPO4对MK特别是MK-4的影响很大，产黄杆菌发酵时需加入K2HP04、MgS04和NaCl，但是枯草杆菌的培养基中只需加入Κ2ΗΡ04。因此，特别需要一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，以解决上述现有存在的问题。

发明内容
本发明的目的在于提供一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，针对现有技术的不足，提高了维生素K2的产量，为实现维生素K2规模化生产提供了有效方法。本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，其特征在于，它包括如下步骤(I)用纳豆芽孢杆菌BS-5突变体BS-53原生质体和纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体融合后筛选获得的高产菌株BKU-6 ；(2)纳豆芽孢杆菌菌株BUK-6复合后，接种于20ml的种子培养液中进行恒温培养，再接种5%的活化培养基于IOOml发酵培养基中进行发酵；
(3)发酵液中加入异丙醇和正已烷混合物处理，处理后进行离心处理，取上清液过滤；(4)滤液经挥发后即可得到维生素K2的油状物，经过真空冷冻干燥后即可得到黄褐色维生素K2的成品。在本发明的一个实施例中，所述纳豆芽孢杆菌BS-5是合肥工业大学食品学院微生物实验室提供的，所述纳豆芽孢杆菌CICC10262由中国微生物菌种保藏管理中心提供。在本发明的一个实施例中，所述纳豆芽孢杆菌BS-5突变体BS-53原生质体和纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体之间采用电融合方式进行融合。在本发明的一个实施例中，所述种子培养液为完全培养基，它包括如下质量百分比的组分蛋白胨1%，葡萄糖O. 5%，酵母粉O. 5%，牛肉膏O. 5%和NaClO. 5%，余量为水。在本发明的一个实施例中，所述恒温培养的温度为37°C，时间为12h。在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基包括如下质量百分比的组分甘油5%,大豆提取物 3%,酵母粉 O. 6g/L, K2HPO4 O. 3mol/L, CaCl2 · 2Η200· lg/L 和 MgSO4 · 7H200. 3g/L，余量为水。在本发明的一个实施例中，所述发酵的温度为37°C，时间为4d。 在本发明的一个实施例中，所述异丙醇和正已烷混合物中异丙醇和正已烷的体积比为I :2，处理方式为在摇床上以220r/min的速度震荡lOmin，用于提取纳豆芽孢杆菌发酵液中的维生素K2。在本发明的一个实施例中，所述离心处理的离心时间为15min，离心速率为8000rmpo本发明的利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，与现有技术相比，通过高产维生素K2的纳豆芽孢杆菌BS-53与生长速度快但维生素K产量低的纳豆芽孢杆菌CICC10262进行原生质体融合，筛选具有双亲优势的融合子，利用获得的高产而且生长速度快的高产菌株在优化的发酵条件下生产维生素K2,并用异丙醇和正己烷来提取分离维生素K2,提高了菌种的生长速度和维生素K2的产量，为实现维生素K2规模化生产提供了有效方法，实现本发明的目的。本发明的特点可参阅以下较好实施方式的详细说明而获得清楚地了解。
具体实施例方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面进一步阐述本发明。本发明的利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，它包括如下步骤(I)用纳豆芽孢杆菌BS-5突变体BS-53原生质体和纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体融合后筛选获得的高产菌株BKU-6 ；(2)纳豆芽孢杆菌菌株BUK-6复合后，接种于20ml的种子培养液中进行恒温培养，再接种5%的活化培养基于IOOml发酵培养基中进行发酵；(3)发酵液中加入异丙醇和正已烷混合物处理，处理后进行离心处理，取上清液过滤；(4)滤液经挥发后即可得到维生素K2的油状物，经过真空冷冻干燥后即可得到黄褐色维生素K2的成品。 在本发明中，所述纳豆芽孢杆菌BS-5是合肥工业大学食品学院微生物实验室提供的，所述纳豆芽孢杆菌CICC10262由中国微生物菌种保藏管理中心提供；所述纳豆芽孢杆菌BS-5菌株是一种从自然界中分离的可以产MK的革兰氏阳性枯草芽孢杆菌,但是产量比较低；纳豆芽孢杆菌CICC 10262是一种MK产量低但生长速度快的菌株；纳豆芽孢杆菌BS-53是纳豆芽孢杆菌BS-5菌株诱变处理后MK产量高但生长速度慢的菌株。在本发明中，所述纳豆芽孢杆菌BS-5突变体BS-53原生质体和纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体之间采用电融合方式进行融合。在本发明中，所述种子培养液为完全培养基，它包括如下质量百分比的组分蛋白胨1%，葡萄糖O. 5%，酵母粉O. 5%，牛肉膏O. 5%和NaClO. 5%，余量为水；所述恒温培养的温度为37°C，时间为12h。在本发明中，所述发酵培养基包括如下质量百分比的组分甘油5%，大豆提取物3%，酵母粉 O. 6g/L, K2HPO4 O. 3mol/L, CaCl2 · 2H20 O. lg/L 和 MgSO4 · 7H20 0. 3g/L，余量为水；所述发酵的温度为37°C，时间为4d。在本发明中，所述异丙醇和正已烷混合物中异丙醇和正已烷的体积比为I :2，处理方式为在摇床上以220r/min的速度震荡lOmin，用于提取纳豆芽孢杆菌发酵液中的维生
素K2。在本发明中，所述离心处理的离心时间为15min，离心速率为8000rmp。实施例菌种复苏菌种BS-5和CICC10262复壮后，接种于斜面固体培养基上，37°C恒温培养18_24h,置于4°C保存。种子培养活化菌种接入液体培养基中(30/250ml)，37 °C，120r/min恒温培养48h。取种子培养液，按5%的接种量(v/v)接入到液体培养基中(30/250ml)，37°C，120r/min
恒温培养。BS-5菌株的紫外诱变BS-5菌对数生长早期的菌悬液，于3500R/min离心收集菌体，用灭菌生理盐水洗涤菌体2-3次后，制成细胞浓度为I X 108个/mL的菌悬液。在超净工作台上，吸取15mL菌悬液于直径9cm的无菌培养皿中，调整培养皿至紫外灯(20W)的垂直距离为30cm。在紫外灯下照射45s后，连续处理两代，将菌液涂布于抗性平板，37 °C恒温培养箱中避光培养24h，筛选得到BS-52菌。BS-5菌株的紫外诱变取BS-52菌悬液9ml，加入亚硝基弧溶液1ml，使其在菌悬液中的终浓度达到100ug/ml，置于37°C恒温振荡30min，取出菌悬液8000r/min离心IOmin,弃去上清液，用生理盐水洗涤2-3次，再用IOml液体培养基悬浮菌体，于37°C培养24h。制备的菌悬液，适当稀释，取O. Iml涂布抗性平板，37°C恒温培养箱中避光培养24h，筛选得到BS-53菌。BS-53菌和CICC10262原生质体制备将2%活化菌株CICC10262接种到20mL新鲜完全培养基中，37°C振荡培养至对数生长前期，加入青霉素O. 6U/mL继续培养约2h，取菌液，离心lOmin，弃去上清液，用磷酸缓冲液洗2次，再悬浮于高渗缓冲液(SMM)中。加入溶菌酶I. Omg/mL于37°C保温lh，每隔一段时间在倒置显微镜下观察是否有原生质体生成，当镜检有90%的原生质体形成时，3000r/mim离心lOmin，弃上清液，沉淀用高渗缓冲液(SMM)洗涤2次以除酶，最终悬浮于SMM中。将2%活化菌株BS-53菌接种到20mL新鲜完全培养基中，37°C振荡培养至对数生长前期，加入青霉素2U/mL继续培养约2h，取菌液，离心lOmin，弃去上清液，用磷酸缓冲液洗2次，再悬浮于高渗缓冲液(SMM)中。加入溶菌酶I. 4mg/mL于37°C保温40min，每隔一段时间在倒置显微镜下观察是否有原生质体生成，当镜检有90%的原生质体形成时，3000R/ mim离心lOmin，弃上清液，沉淀用SMM洗涤2次，悬浮于SMM中。原生质体电融合BS_53菌(热灭活法)和CICC10262菌株(紫外灭活法)分别经过灭活后，取两亲本灭活原生质体悬液各2ml，以I: I等量混合于灭菌离心管中，用SMM离心洗涤2次(3500r/min，IOmin)，并用电击缓冲液离心洗涤一次，之后悬浮于电击液中，调整原生质体浓度为108个/ml。用无菌移液器取少量混合悬液注入Icm的融合电极小室中，置于倒置显微镜下，之后接通电融合仪，先接通成串电压和电流，调整电压的大小，当电极小室中的原生质体在电压的作用下逐渐形成串珠状时，维持电压几分钟，使其形成稳定的串珠状。再接通直流融合电压，直流脉冲可瞬间可逆击穿相邻的原生质体膜，从而触发相邻原生质体的融合。将融合小室取出，放入超净工作台内，静置约5-10min，将电融合液用微量移液器接种于再生培养基上，于37°C培养4d,并从再生培养基上分离融合子。融合子的筛选选择再生平板上生长速度快、菌落直径大的单菌落，进行维生素K2高产菌株的初步筛选；淘汰菌落偏小、生长速度慢、易老化的菌落。将初筛菌株接种于液体复筛培养基中，37°C，200r/min培养4d，以MK产量作为筛选指标，同时以出发菌株作为对照，进一步筛选即可获得MK产量最高的融合菌株BUK-6。纳豆芽孢杆菌发酵培养纳豆芽孢杆菌BUK-6接种至3L液体完全培养基(蛋白胨1%，葡萄糖O. 5%，酵母粉O. 5%，牛肉膏O. 5%和NaClO. 5%，余量为水)中，在恒温摇床上，180rmp，37°C 条件下培养 10_12h。向3(T60L种子罐中加入无菌种子培养基(甘油5%，大豆提取物3%，酵母粉O. 6g/L，K2HPO4 O. 3mol/L, CaCl2 · 2H20 O. lg/L 和 MgSO4 · 7Η200· 3g/L，余量为水)，种子灌液的灭菌温度121°C，时间为15min，冷却至37°C ;将纳豆芽孢杆菌BUK-6活化菌液接种至种子罐中，温度控制在37°C左右，罐压为O. 5kg/cm2，种子罐转速为180-220转/分，通风量为10m3/h，生产周期4d。第九步维生素K2的分离纯化发酵液中加入异丙醇和正已烧混合物,在摇床上220r/min震荡IOmin后,8000rmp离心15min,取上清液过滤。
维生素K2的浓缩干燥滤液经挥发后即可得到维生素K2的油状物，经过真空冷冻干燥后即可得到黄褐色维生素K2的成品。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
权利要求
1.一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，其特征在于，它包括如下步骤 (1)用纳豆芽孢杆菌BS-5突变体BS-53原生质体和纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体融合后筛选获得的高产菌株BKU-6 ； (2)纳豆芽孢杆菌菌株BUK-6复合后，接种于20ml的种子培养液中进行恒温培养，再接种5%的活化培养基于IOOml发酵培养基中进行发酵； (3)发酵液中加入异丙醇和正已烷混合物处理，处理后进行离心处理，取上清液过滤； (4)滤液经挥发后即可得到维生素K2的油状物，经过真空冷冻干燥后即可得到黄褐色维生素K2的成品。
2.如权利要求I所述的利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌BS-5是合肥工业大学食品学院微生物实验室提供的，所述纳豆芽孢杆菌CICC10262由中国微生物菌种保藏管理中心提供。
3.如权利要求I所述的利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌BS-5突变体BS-53原生质体和纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体之间采用电融合方式进行融合。
4.如权利要求I所述的利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，其特征在于，所述种子培养液为完全培养基，它包括如下质量百分比的组分蛋白胨1%，葡萄糖0. 5%，酵母粉0. 5%,牛肉膏0. 5%和NaCl 0. 5%,余量为水。
5.如权利要求I所述的利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，其特征在于，所述恒温培养的温度为37°C，时间为12h。
6.如权利要求I所述的利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下质量百分比的组分甘油5%，大豆提取物3%，酵母粉0. 6g/L，K2HPO40.3mol/L, CaCl2 2H20 0. lg/L 和 MgSO4 7H20 0. 3g/L，余量为水。
7.如权利要求I所述的利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，其特征在于，所述发酵的温度为37°C，时间为4d。
8.如权利要求I所述的利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，其特征在于，所述异丙醇和正已烷混合物中异丙醇和正已烷的体积比为I :2，处理方式为在摇床上以220r/min的速度震荡lOmin，用于提取纳豆芽孢杆菌发酵液中的维生素K2。
9.如权利要求I所述的利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，其特征在于，所述离心处理的离心时间为15min,离心速率为8000rmp。
全文摘要
本发明的目的在于公开一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法，通过高产维生素K2的纳豆芽孢杆菌BS-53与生长速度快但维生素K产量低的纳豆芽孢杆菌CICC10262进行原生质体融合，筛选具有双亲优势的融合子，利用获得的高产而且生长速度快的高产菌株在优化的发酵条件下生产维生素K2，并用异丙醇和正己烷来提取分离维生素K2，提高了菌种的生长速度和维生素K2的产量，为实现维生素K2规模化生产提供了有效方法，实现本发明的目的。
文档编号C12P7/66GK102808005SQ20121033941
公开日2012年12月5日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者刘国庆, 赵肖, 胡卫华, 钱晓勇 申请人:上海红马饲料有限公司