专利名称：一种复合鸭α干扰素基因、其重组载体及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种复合鸭α干扰素基因、其重组载体及其在生产鸭α干扰素中的应用。
背景技术：
干扰素(interferon, IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白),是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。干扰素是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙 肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是动物机体最重要细胞因子之一，具有广谱、高效的抗病毒功能，对免疫系统起关键调节作用。干扰素是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素的作用具有物种局限性，不同物种的干扰素可能会有一定的交叉作用，如人干扰素在犬类应用也有一定效果，然而研究表明，大多数干扰素不能跨物种使用，干扰素用在本种动物才能发挥较好的抗病毒和免疫调控效果。九十年代,美国安进公司研究出一种全新的人复合alpha干扰素Infergen。这种复合干扰素是一种非自然的干扰素，166aa序列的获得是通过对几种天然alpha亚型干扰素序列的扫描，把最常见的氨基酸转移到各个相应的位置。为便于分子构造，还另改变了 4个氨基酸。Infergen序列与alpha II型干扰素的同源性为88%,与beta干扰素的同源性为30%，且相似性较任何天然的α干扰素要高。实验证明=Infergen的抗多种病毒的活性较天然的干扰素高5倍，按WHO人源干扰素抗病毒策略为标准得到其抗病毒活性为I X IO9U/
mg ο近年来，鸡干扰素(ChIFN)的研究与应用十分引人注目，尤其是其重组干扰素-α(rChIFN- α )在改善和治疗A类传染病(新城疫和禽流感)，以及传染性法氏囊炎(IBD)和传染性支气管炎(IB)等病毒性疾病方面效果显著，展示出了禽类干扰素的应用前景。禽类干扰素用于禽类疾病防制，可直接注射，也可通过饮水给药。Marcu等采用饮水给药的方法进行了重组ChIFN-α抗新城疫病毒的研究，雏鸡I日龄起每天给予不同浓度的重组ChIFN- α (10、100、500、1 000,2 000 IU/mL)饮水，在2日龄时进行新城疫病毒La Sota株的攻毒试验(点眼O. 5 mL (5 10)X 105 EID50/只)，研究表明高剂量的重组ChIFN-α可以延迟病症的出现并且显著降低试验鸡的发病程度。在试验中，对照组鸡只在7日龄出现致死性症状及组织学病变，而饮用高剂量(I 000,2 000 IU/mL)重组ChIFN-α的鸡只则在整个试验期间(12 d)精神状态良好，与未攻毒的雏鸡相比，无大体病变及组织学病变出现，500 IU/mL的重组ChIFN-α足以缓和新城疫引起的病理变化。
与鸡相比，鸭干扰素方面的研究相对较少。1995年，Schultz等以ChIFN-α基因为探针，从绿头野鸭的基因组中克隆了鸭α-干扰素基因(DuIFN-a)，并在pET28A-E. coli和pcDNAI- C0S7表达系中进行了有效表达。Schult z等发现重组鸭干扰素-a (rDuIFN -a)能抑制VSV、NDV和A型流感病毒(Flu- A)的增殖，并建立了鸭病毒性肝炎(DHBV)-干扰素实验系用于人类病毒性肝炎的模型研究[2]。2004年，阮小飞[3]等从北京鸭(A nas p latyr hy nchos d oestica L innaeus)基因组中克隆了其干扰素-α基因克隆片段长486 bp，编码161个氨基酸的成熟肽。将该基因插入原核表达载体PQE30，在E. coli JM109工程菌中进行表达，重组蛋白以包涵体形式存在于E. coli. JM109工程菌中，在经过SM尿素变性、透析、复性后成为了具有抗病毒活性的重组鸭干扰素，抗水疱性口炎病毒(VSV)活性高达7. 9 X IO5IU/ mg。陈斌M等克隆了北京麻鸭生物信息学分析表明，麻鸭α -干扰素的开放性阅读框有576个核苷酸组成，蛋白质相对分子质量为21kD，编码191个氨基酸，其中前28个氨基·酸可能是信号肽部分，切割位点在28号氨基酸和29号氨基酸之间，基因序列中无内含子。继而陈斌将麻鸭α-干扰素插入质粒PCDNA3. 1，将获得的重组质粒作为免疫调节剂研究对DPV/DVH弱毒苗免疫活性调节作用，结果表明，含有麻鸭α _干扰素基因的重组表达质粒在鸭体内具有表达活性，并在一定时间内能促进和提高免疫和体液免疫应答，发挥着有效的正向免疫调节作用。以往干扰素的制备方法主要有两种由诱生剂诱导动物细胞产生、原核表达。由诱生剂诱导产生鸭IFN-α，产生的干扰素产量少、成本高、纯化工艺复杂，因而价格昂贵，极大程度上限制了临床和科研的应用。原核表达系统中其产物主要以无生物活性的包涵体形式存在，若要想获得具有生物活性的重组蛋白必须对包涵体进行变性、复性等繁琐的后续处理工作，而后续处理工作中重组蛋白的损失量大而且对工作人员的技术水平要求也很高，这不利于工业化生产。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种复合鸭α干扰素基因。本发明的另一个目的在于提供含有复合鸭α干扰素基因的克隆载体。本发明的另一个目的在于提供含有复合鸭α干扰素基因的表达载体。本发明的另一个目的在于提供一种鸭α干扰素的生产方法。本发明所采用的技术方案是
一种复合鸭α干扰素基因，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示，或是SEQ ID Ν0:1所示的序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸和/或末端修饰后具有同等活性的序列。一种克隆载体，含有上述的复合鸭α干扰素基因。—种表达载体，含有上述的复合鸭α干扰素基因。其出发载体为酵母表达载体pPICZ a A、pPICZ a B 或 pPICZ α C。一种鸭α干扰素的生产方法，包括将上述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到鸭α干扰素。所述宿主细胞为毕赤酵母X-33、GS115、KM71或SMD1168。
由以上方法生产得到的鸭α干扰素。本发明的有益效果在于
本发明经优化后的复合鸭α干扰素基因可在毕赤氏酵母基因工程菌中表达生产复合鸭α干扰素。该方法得到的复合鸭α干扰素与天然鸭α干扰素和用大肠杆菌表达的天然鸭α干扰素相比具有下几个优点
(1)本发明的复合鸭α干扰素表达量大、纯度高酵母表达的鸭α干扰素SDS-PAGE结果经薄层扫描显示，重组酵母鸭α干扰素的目的条带占总表达蛋白量的80%以上；
(2)抗病毒作用强该新型基因组表达的蛋白与酵母表达的天然鸭α干扰素相比，有更好的抗病毒活性，其在鸭胚成纤维细胞上抵抗Iootcid5ciVSV病毒感染的作用提高了 40倍；
(3)无毒害物质酵母不会分泌像大肠杆菌表达的外源蛋白那样附带一些对鸭体细胞·有毒害的毒素。说明书附图
图I质粒pPICZ a-MDuIFNa质粒图谱；
图2重组表达载体pPICZ a-MDuIFNa的EcoRI和XbaI双酶切鉴定(Μ· DL5000marker ；1. pPICZ a -MDuIFNa 的 EcoRI 和 XbaI 双酶切产物)；
图 3 重组毕赤酵母 X-33/pPICZ a-MDuIFNa 的 PCR 鉴定(I. DL5000marker ；2-5.X-33/pPICZa -MDuIFNa ；C.菌株 X33 作为阴性对照)；
图 4 复合鸭 a 干扰素的诱导表达的 SDS-PAGE(M. marker ；1. X-33/pPICZ a -MDuIFN α诱导表达上清；C. Χ33培养上清作为阴性对照)；
图5复合鸭α干扰素和天然鸭α干扰素的诱导表达的SDS-PAGE (Μ. marker ；1.天然鸭α干扰素诱导表达上清；2. X-33/pPICZ-MDuIFN α复合鸭α干扰素诱导表达上清)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例I 材料
I.I复合鸭α干扰素基因
根据Genbank中的鸭α干扰素成熟蛋白的编码基因(Genbank登录号EF053034)，对其进行DNA核苷酸序列密码子优化设计，得到复合α鸭干扰素基因序列，如SEQ ID NO: I所示。由上海捷瑞生物工程有限公司合成。I. 2菌种、细胞和病毒
巴斯德毕赤酵母(/7ZcAia pas tor is X33)、酵母表达载体pPICZ a A购自Invitrogen公司；大肠杆菌DH5a株本实验室保存；水疱性口炎病毒(VSV病毒)由本实验室保存。
I. 3 试剂
质粒小量提取试剂盒、酵母基因组DNA提取试剂盒、T4连接酶等试剂均购自TaKaRa公司。2方法与结果
权利要求
1.一种复合鸭α干扰素基因，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示，或是SEQ ID NO 1所示的序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸和/或末端修饰后具有同等活性的序列。
2.一种克隆载体，含有权利要求I所示的基因。
3.—种表达载体,含有权利要求I所不的基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，出发载体为酵母表达载体pPICZa A、pPICZaB 或 pPICZaC。
5.—种鸭a干扰素的生产方法,包括将权利要求3或4所述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到鸭a干扰素。
6.根据权利要求5所述的鸭a-干扰素的生产方法，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母 X-33、GS115、KM71 或 SMDl 168
7.根据权利要求5所述的方法生产得到的鸭a干扰素。
全文摘要
本发明公开了一种复合鸭α干扰素基因、其重组载体及应用。所述复合鸭α干扰素基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明经优化后的复合鸭α干扰素基因可在毕赤氏酵母基因工程菌中表达生产复合鸭α干扰素，所得到的复合鸭α干扰素纯度高酵母表达的鸭α干扰素SDS-PAGE结果经薄层扫描显示，重组酵母鸭α干扰素的目的条带占总表达蛋白量的80%以上；抗病毒作用强该新型基因组表达的蛋白与酵母表达的天然鸭α干扰素相比，有更好的抗病毒活性，其在鸭胚成纤维细胞上抵抗100TCID50VSV病毒感染的作用提高了40倍。可用于制备治疗禽类病毒性疾病的药物。
文档编号C12N15/21GK102899331SQ201210362429
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者向华, 黄元, 王晓虎, 陈晶, 张健騑 申请人:广东省农业科学院兽医研究所