专利名称：一种利用磁珠提取全血基因组dna的试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因组DNA的提取方法，特别涉及一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒及应用。
背景技术：
DNA作为遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。提取基因组DNA是许多分子生物学实验的基础，在诸如基因组测序、Southern杂交、PCR扩增、构建BCA文库、分子克隆等常规实验中，获得高分子量、高纯度的基因组DNA是开展研究工作的重要前提。随着分子生物学技术的深入发展，在基因水平上对疾病进行检测、诊断已经成为临床诊断的一项基本技术手段；尤其是法医学中的个体识别、亲子鉴定等，对所提取基因组DNA的完整性及纯度要求更高。血液取材方便可靠，因此许多研究均以血液作为材料以提取完整的基因组DNA。而出于对实验成本、工作效率等多方面因素的考虑，研究人·员希望尽可能一次性获取最大采血量(2-10ml)的基因组DNA，以进行长期保存，满足长期、反复、多种研究的需要。基因组DNA提取一般需遵循以下几个原则1、保证提取的DNA具有一定的长度；2、纯化后不应存在对没有抑制作用的物质；3、排除有机溶剂和金属离子污染；4、蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度；5、排除其他核酸分子的污染。对于范围在2-10ml血样的基因组DNA提取，经典方法是用SDS、蛋白酶k消化，再用酚氯仿反复抽提，此过程不但用到了有毒的苯酚、氯仿，且操作繁琐、耗时耗力，极易造成样本的丢失和污染。目前市场上商品化的离心柱型试剂盒操作简单，但一般只能满足微量全血(100-500ul)的提取需求，而对于中大量血液的基因组提取，则操作中会包含反复的移液、离心，易造成样本的交叉污染。磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法。磁珠是指直径几十纳米至数微米，在磁场下表现出磁性，由无机/有机或者无机/无机材料组成的外形呈现为球状的复合粒子。运用此法不需要苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，提取的核酸纯度高、产量大。专利号为 200810200588. X,200910223901. 6,200910307632. 1,201110124322. 3 的专利分别公开了利用磁珠提取核酸的试剂盒或者方法，但都只是针对血液或其他来源样本中的病毒核酸所设计，并未涉及到血液基因组DNA的提取；专利号20101035963. 4的专利公开了 “一种用磁珠分离基因组DNA的试剂盒及其应用”，其应用主要针对于从动植物组织中提取基因组DNA ;专利号201010153890. I的专利公开了一种“血液基因组磁珠小提试剂盒极其提取方法”，此试剂组成和方法，只适用于小样本量(50-200ul)血液的基因组DNA提取，对于大体积样本的提取，则容易受到红细胞及血液其他组分的干扰和污染，无法适用于对基因组需求量较大的试验研究，这也是目前国内市场上磁珠法全血基因组试剂盒所面临的技术瓶颈。因此，提供一种可从大体积全血样本中提取基因组DNA的方法和试剂盒，并且操作简单、成本低廉、提取的基因组产量高、质量佳，对于满足临床诊断和研究人员对样本长期保存、反复使用的需求是很有必要的。
发明内容
本发明目的是提供一种利用磁珠提取中大量全血基因组DNA的方法和试剂盒，特别针对较大样本量(2-10ml)的全血材料，经过对血液组分的简单处理，即可去除大部分杂质，利用单分散磁性微球特异吸附基因组DNA，仅需简单的漂洗步骤，即可获得产量高、纯度好、片段完整的基因组DNA，适用于PCR检测、酶切反应、分子杂交、测序等下游实验。本发明采用的技术方案是一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，所述试剂盒由磁珠悬浮液、基因提取液和磁架构成；所述磁珠悬浮液以氯化铁和氯化亚铁为磁性材料，在氮气和氢氧化钠的作用下，通过化学共沉淀形成磁性粒子，再将磁性粒子用硅酸钠修饰，水分散，获得所述磁珠悬浮液；所述基因提取液包括红细胞裂解液、细胞裂解液、结合液、蛋白酶K工作液、漂洗液I、漂洗液2、漂洗液3和洗脱液；所述红细胞裂解液终浓度组成为10(T200mmOl/L氯化铵、5 20mmol/L钾盐，O. 05 O. lmmol/LEDTA，溶剂为水，pH 为 7. 0 8· O ；所述细胞裂解液终浓度组成为50 200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐a、5(Tl00mmol/L螯合剂、500 800mmol/L钠盐和质量终浓度O. 5^5%十二磺基硫酸钠，溶剂为水，pH为7. (Γ8. 0，所述螯合剂为EDTA (乙二胺四乙酸)；·所述结合液终浓度组成为2 8mol/L离液盐a、0. 2^2mol/L醋酸钠，溶剂为水，pH为4. (Γ6. 0，所述离液盐a为盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠或氯化锂；所述漂洗液I终浓度组成为1 4 mo I/L的离液盐b，0. f 2mol/L醋酸钠，体积终浓度2(Γ30%的无水乙醇，溶剂是水，pH值4.(Γ 6. 0，所述离液盐b为盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠或高氯酸钠；所述漂洗液2终浓度组成为1 4 mol/L的离液盐c，0. f 2mol/L醋酸钠，体积终浓度5(Γ70%的无水乙醇，pH值4. (Γ 7. 0，溶剂为水，所述离液盐c为盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠或高氯酸钠；所述漂洗液3为体积浓度75%无水乙醇溶液或无水乙醇；所述洗脱液终浓度组成为l(T20mmOl/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，0.5mmol/LEDTA 水溶液，pH9. O。所述蛋白酶K工作液在试剂盒中的终浓度为20mg/mL。进一步，所述磁珠以磁珠悬浮液的形式存在，即每毫升磁珠悬浮液中含有直径为1-5 μ m的磁珠50mg,其余为水。进一步，所述磁珠悬浮液按如下方法制备(I)磁性粒子的配制首先对4mol/L的氢氧化钠水溶液通氮气进行除氧处理，然后将氢氧化钠水溶液置于80°C的水浴中并持续通入氮气；其次，将O. 5mol/L氯化铁水溶液与O. 5mol/L氯化亚铁盐酸溶液以体积比2:1混合，缓慢倒入上述水浴中的氢氧化钠水溶液中，搅拌反应30min，将反应液静置冷却沉淀，去除上清；最后取沉淀用无水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到所述磁性粒子；所述氢氧化钠水溶液与氯化铁水溶液和氯化亚铁盐酸溶液的总体积比为1:0. 6 ；(2)磁性粒子修饰配基取上述磁性粒子用去离子水a进行超声分散，获得磁性粒子分散液，向所述磁性粒子分散液中分别加入无水乙醇a、质量浓度22 25%浓氨水、体积浓度40%的正硅酸乙酯的乙醇溶液，在400rpm下搅拌24小时，将反应混合液用乙醇与水分别清洗三次，最后用4ml去离子水b分散，获得所述磁珠悬浮液；所述去离子水a的体积用量以磁性粒子质量计为100ml/g,所述无水乙醇a体积用量以磁性粒子质量计为400ml/g,浓氨水体积用量以磁性粒子质量计为5ml/g，正硅酸乙酯的乙醇溶液体积用量以磁性粒子质量计为5ml/g。进一步，所述红细胞裂解液终浓度组成优选为150mmol/L氯化铵、lOmmol/L碳酸氢钾，O. lmmol/L EDTA，溶剂为水，pH 为 7. 4。进一步，所述细胞裂解液终浓度组成优选为100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐a、IOOmmoI/L螯合剂、500mmol/L氯化钠和质量终浓度0. 5%十二磺基硫酸钠，溶剂为水，pH为8. O，所述螯合剂为EDTA。 进一步，所述结合液终浓度组成优选为3. 6mol/L高氯酸钠、0. 2mol/L醋酸钠、溶剂为水，PH为4. O。进一步，所述漂洗液I终浓度组成优选为1. 2 mol/L的高氯酸钠，0. lmol/L醋酸钠，体积终浓度30%的无水乙醇，溶剂是水，pH值4. 5。进一步，所述漂洗液2终浓度组成优选为1. 2 mol/L的高氯酸钠，0. lmol/L醋酸钠，体积终浓度70%的无水乙醇，pH值6，溶剂为水。本发明还提供一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒在提取全血基因组DNA中的应用。进一步，所述利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒的应用为(1)预处理向新鲜、冷冻或抗凝全血中加入其体积3倍的红细胞裂解液，充分混匀后室温静置5 10min，离心，弃大部分上清，最终保留大约100 μ L体积残留上清液(通常为全部上清体积的2. 5%)；
(2)裂解将上述沉淀与残留上清充分重悬、分散后，获得重悬分散的细胞液，在每IOOyL重悬分散的细胞液中加入40 μ L蛋白酶K工作液，振荡混匀10s，再向上述每100 μ L重悬分散细胞液中加入300 μ L细胞裂解液，56°C下振荡温育15 30min，获得混合液；(3)核酸吸附向上述步骤(2)所得的每含IOOyL重悬分散细胞液的混合液中加入SOOyL结合液，充分混匀后再加入20 μ L磁珠悬浮液(加入量为每含100 μ L重悬分散细胞液的混合液中加入20 μ L磁珠悬浮液)，充分混匀后，静置5min，形成含有磁珠-DNA的复合体溶液，将上述复合体溶液置于磁架上静置吸附f2min，弃上清液，获得磁珠-DNA的复合体；(4)漂洗向上述磁珠-DNA的复合体中加入漂洗液I重悬磁珠，在磁架上静置吸附f 2min，弃上清，再加入漂洗液2重悬磁珠，在磁架上静置吸附f 2min后，弃上清，再加入漂洗液3重悬磁珠，在磁架上静置吸附f 2min后，弃上清，室温静置至无乙醇气味，获得漂洗后的磁珠-DNA的复合体；所述漂洗液广漂洗液3的体积用量以能够充分悬浮磁珠即可；(5)洗脱最后向步骤(4)漂洗后的磁珠-DNA的复合体中加入洗脱液，振荡混匀20s，55°C孵育lOmin，振荡混匀5s，在磁架上静置吸附广2min，取上清，获得所述基因组DNA。本发明所述利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒的应用中，若待提取的全血为微量(即小于200μ L )时，可以省去利用红细胞裂解液预处理的步骤，将全血直接加入蛋白酶K工作液及细胞裂解液进行裂解处理。本发明所述的漂洗液I、漂洗液2和漂洗液3均为漂洗液，为便于区分表述不同步骤所用漂洗液不同而命名，数字I，2，3本身没有含义。
本发明所述离液盐a、离液盐b、离液盐c均为离液盐，为便于区分不同溶液中所用离液盐量不同而命名，所述去离子水a和去离子水b均为去离子水，为便于区分不同步骤使用去离子水不同而命名，所述无水乙醇a和无水乙醇b均为无水乙醇，为便于区分不同步骤使用无水乙醇量不同而命名，字母本身没有含义。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明适于中大量全血基因组DNA的提取，操作简便，只需对红细胞进行简单预处理，即可对大体积的全血样本进行快速提取，Ih内可完成操作，适合高通量、自动化提取；反应体系灵活，可根据样品体积作体系的相应调整；不使用苯酚、氯仿等有机溶剂，对操作人员安全无毒副作用；提取效率高，能够从2ml全血中提取20 60 μ gDNA,且片段完整；形成的磁珠-DNA复合体可不经洗脱直接用于核酸检测实验，如PCR、qPCR，方便快速。
图I实施例2方法获得的基因组DNA片段完整性检测，泳道1、2 :利用本发明试剂盒提取的基因组DNA ;泳道3 IOOObp gene ruler ;泳道4、5 :用Qiagen试剂盒提取的基因 组 DNA。图2实施例3方法获得的基因组DNA片段完整性检测，泳道l:1000bp generuler ;泳道2、3 :用本发明试剂盒提取的基因组DNA。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :试剂盒组成与配制磁珠悬浮液的制备(I)磁性粒子的配制配制200ml、4mol/L的氢氧化钠水溶液，并通氮气对其进行除氧。然后将氢氧化钠溶液置于80°C的水浴中并进行不间断的通氮气，将O. 5mol/L氯化铁水溶液80ml与O. 5mol/L氯化亚铁盐酸溶液40ml混合，缓慢倒入上述水浴的氢氧化钠水溶液中，期间进行搅拌，会有大量黑色沉淀产生，半个小时后停止搅拌反应，室温(25°C )静置自然冷却沉淀，去除上清。取沉淀用无水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到粒径在1-5 μ m的磁性粒子。(2)磁性粒子修饰配基称取上述磁性粒子200mg,用20ml去离子水进行超声分散，然后移入一个250ml的三口烧瓶中。再分别加入80ml无水乙醇、Iml质量浓度22 25%浓氨水、ImlTEOS乙醇溶液(TE0S400 μ I )，400rpm下机械搅拌24小时，将反应混合液用无水乙醇与水分别清洗三次，最后用4ml去离子水分散，获得所述磁珠悬浮液。红细胞裂解液终浓度组成为150 mmol/L氯化铵，10 mmol/L碳酸氢钾，O. lmmol/L EDTA,溶剂是水，pH 值为 7. 4 ；蛋白酶K工作液20mg/mL ；细胞裂解液终浓度组成为100 mmoL/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，100 mmoL/LEDTA、500mmoL/L氯化钠、质量终浓度0. 5%的十二磺基硫酸钠，溶剂是水，该裂解液pH值为8 ；结合液终浓度组成为3. 6mol/L的高氯酸钠、0. 2mol/L醋酸钾，溶剂为水，pH值为 4. O ;漂洗液I终浓度组成为I. 2 mol/L高氯酸钠、体积终浓度30%的无水乙醇，O. lmol/L醋酸钠，溶 剂是水，pH值4.5 ;漂洗液2终浓度组成为1. 2 mol/L的高氯酸钠、体积终浓度70%的无水乙醇，O. lmol/L醋酸钠，溶剂为水，pH值6 ;漂洗液3 :无水乙醇；洗脱液终浓度组成为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，O. 5mmol/LEDTA水溶液，pH 值 9. O。实施例2 微量人抗凝全血基因组DNA提取I)实验材料新鲜、冷冻或抗凝人全血2)基因组DNA提取步骤微量全血基因组DNA的提取，可省略红细胞裂解步骤。(I)裂解取100 μ I新鲜、冷冻或抗凝全血加入到I. 5ml离心管中，并加入20 μ I蛋白酶K工作液(购自金普诺安(北京))使其终浓度为4mg/ml，将离心管置于旋涡振荡器上混匀10秒钟；再加入300 μ I实施例I方法制备的细胞裂解液，56°C温育15min，期间不时
震荡；(2)核酸吸附向上述混合液中加入800 μ I实施例I方法配制的结合液，充分混匀后再加入20 μ I实施例I方法制备的磁珠悬浮液(使用前混匀)，轻柔颠倒混匀lOmin，形成含有磁珠-DNA的复合体溶液；将上述装有磁珠-DNA的复合体溶液的离心管放在磁架(上海奥润微纳)上静置吸附广2min，吸弃上清，获得磁珠-DNA的复合体；(3)漂洗向上述磁珠-DNA的复合体中加入1000 μ I实施例I方法配制的漂洗液I重悬磁珠，轻柔颠倒Imin,再放在磁架上静置吸附l 2min,吸弃上清；加入1000 μ I实施例I方法配制的漂洗液2重悬磁珠，轻柔颠倒lmin，再放在磁架上吸附f 2min，吸弃上清；加入1000 μ I实施例I方法配制的漂洗液3，重悬磁珠，置于磁力架上f 2min，吸弃上清；开盖，在室温(25°C)静置2min，直至闻不到乙醇气味，获得漂洗后的磁珠-DNA的复合体；(4)洗脱向步骤(3)漂洗后的磁珠-DNA的复合体中加入50 μ I实施例I方法配制的洗脱液，在旋涡振荡器上混匀20秒钟，然后在55°C水浴孵育IOmin;取出后在旋涡振荡器上混匀5秒钟，在磁架上吸附f 2min，吸取上清于新的EP管，获得基因组DNA。同时以Q公司(Qiagen，951336)试剂盒对100 μ I新采集的人抗凝全血进行基因组DNA提取，得到的基因组DNA经超微量分光光度计(ND 1000, NanoDrop)NanoDrop检测浓度，DNA 纯度用 OD260mi/OD280nm 比值来衡量(纯 DNA 0D260/0D280 I. 8 (> I. 9，表明有 RNA污染；< I. 6，表明有蛋白质、酚等污染)，一般认为0D260/0D280在1.8-2. O之间，DNA都属于纯净)，结果见表I所示。表I两种试剂盒提取DNA结果比较
本试剂盒(磁珠法)Q公司试剂盒(吸附柱运7~ _重复I 重复2重复I 重复2_QD 比Ι 1.99 1.972.06 1.80 DNA 浓丨ii: (ng/ul) 72.7 72.228.6 29.0
从表I可以看出，本试剂盒提取得到的基因组DNA纯度达到了质和量的要求，比Q公司提取结果略好一些(本发明试剂盒0D260nm/0D280nm比值均在I. 8-2. O范围内)，且本发明所得的基因组DNA产量明显提高，约为Q公司产量的2. 5倍左右。3)基因组DNA片段完整性检测分别取10 μ I步骤2)提取的基因组DNA，于质量浓度O. 8%的琼脂糖凝胶上，在IOOv电压下电泳15min，用紫外凝胶成像系统进行照相，以Q公司试剂盒提取的基因组DNA作为对照，如图I所示。从图I可以看到，两种试剂盒提取得到的基因组DNA均比较完整。实施例3 中量人抗凝全血基因组DNA提取实验材料新鲜、冷冻或抗凝人全血
基因组DNA提取步骤(I)预处理将抗凝全血(使用前回复到室温)颠倒混勻后，吸取2ml加至装有6ml实施例I方法制备红细胞裂解液的离心管中，颠倒混匀6-8次，倒置轻弹管壁，确保充分混勻，室温放置IOmin,期间不时颠倒轻弹混勻数次,3，500g离心3 min,倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清，留下完整的管底白细胞团和大约100 μ I的残留上清；涡旋振荡至白细胞团充分重悬、分散，获得重悬分散的细胞液；(2)裂解将分散重悬的细胞液100 μ I转移至I. 5ml离心管，并加入40 μ I蛋白酶K工作液旋涡振荡器上混匀10秒钟，再加入300 μ I实施例I方法制备细胞裂解液，560C下温育30min，期间不时震荡,获得混合液440 μ I。(3)核酸吸附再向上述混合液中加入800 μ I实施例I方法制备结合液，充分混勻后加入20 μ I实施例I方法制备磁珠悬浮液，轻柔颠倒混勻IOmin ;形成含有磁珠-DNA的复合体溶液，将上述复合体溶液置于磁架上静置吸附f2min，弃上清液，获得磁珠-DNA的复合体；(4)漂洗向上述磁珠-DNA的复合体中加入1000 μ I实施例I方法制备漂洗液1，重悬磁珠，轻柔颠倒lmin,再放在磁架上静置吸附l 2min,吸弃上清；加入1000 μ I实施例I方法制备漂洗液2，重悬磁珠，轻柔颠倒lmin，再放在磁架上吸附l 2min，吸弃上清；再加入1000 μ I漂洗液3,重悬磁珠,置于磁力架上f 2min,吸弃上清；开盖,在室温静置2min,直至闻不到乙醇气味，获得漂洗后的磁珠-DNA的复合体；(5)洗脱向步骤(4)漂洗后的磁珠-DNA的复合体中加入600 μ I实施例I方法制备洗脱液，在旋涡振荡器上混匀20秒钟，然后在55°C水浴孵育lOmin，取出后在旋涡振荡器上混匀5秒钟，在磁架上静置吸附f2min，吸取上清于新的EP管，获得基因组DNA。将所提取的基因组DNA经NanoDrop检测浓度，DNA纯度用OD26(lnm/OD28(lnm比值来衡量(I. 80-2. O)。每个检测重复2次，结果见表2所示。表2人全血基因组提取效果
重复I重复2OD Ltifl.Γ 9~\
DNA 浓度(ng/ul )_777_78_8_从表2可以看出，本试剂盒提取得到的基因组DNA纯度能够满足实验要求，且基因组DNA提取效率较高，可从2ml全血获得约45 μ gDNA。取10 μ I的基因组DNA，于质量浓度 O.8%的琼脂糖凝胶上在IOOv电压下，电泳15min，用紫外凝胶成像系统进行照相，可见基因组DNA完整性好(图2所示)。
权利要求
1.一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由磁珠悬浮液、基因提取液和磁架构成；所述磁珠悬浮液以氯化铁和氯化亚铁为磁性材料，在氮气和氢氧化钠的作用下，通过化学共沉淀形成磁性粒子，再将磁性粒子用硅酸钠修饰，水分散，获得所述磁珠悬浮液；所述基因提取液包括红细胞裂解液、细胞裂解液、结合液、蛋白酶K工作液、漂洗液I、漂洗液2、漂洗液3和洗脱液； 所述红细胞裂解液终浓度组成为10(T200mmoI/L氯化铵、5 20mmoI/L钾盐，O. 05 O.lmmol/L EDTA，溶剂为水，pH 为 7. 0 8· O ； 所述细胞裂解液终浓度组成为50 200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐a、50^500mmol/L螯合剂、500 800mmol/L钠盐和质量终浓度O. 5 5%十二磺基硫酸钠，溶剂为水，pH为7. 0 8· 0，所述螯合剂为EDTA ； 所述结合液终浓度组成为2 8mol/L离液盐a、0. 2^2mol/L醋酸钠，溶剂为水，pH为4.(Γ6. 0，所述离液盐a为盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠或氯化锂； 所述漂洗液I终浓度组成为I 4 mol/L的离子液盐b，0. f2mol/L醋酸钠，体积终浓度2(Γ30%的无水乙醇，溶剂是水，pH值4.(Γ 6. 0，所述离液盐b为盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠或高氯酸钠； 所述漂洗液2终浓度组成为4 mol/L的离液盐C，O. f 2mol/L醋酸钠，体积终浓度5(Γ70%的无水乙醇，pH值4. (Γ 7. 0，溶剂为水，所述离液盐c为盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠或高氯酸钠； 所述漂洗液3为体积浓度75%无水乙醇水溶液或无水乙醇； 所述洗脱液终浓度组成为l(T20mmOl/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，O. 5mmol/L EDTA水溶液，pH9. O。
2.如权利要求I所述利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，其特征在于所述磁珠以磁珠悬浮液的形式存在，即每毫升磁珠悬浮液中含有直径为1-5 μ m的磁珠50mg,其余为水。
3.如权利要求I所述利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，其特征在于所述磁珠按如下方法制备(1)磁性粒子的配制首先对4mol/L的氢氧化钠水溶液通氮气进行除氧处理，然后将氢氧化钠水溶液置于80°C的水浴中并持续通入氮气；其次,将O. 5mol/L氯化铁水溶液与O. 5mol/L氯化亚铁盐酸溶液以体积比2:1混合，缓慢倒入上述水浴中的氢氧化钠水溶液中，搅拌反应30min，将反应液静置冷却沉淀，去除上清；最后取沉淀用无水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到所述磁性粒子；所述氢氧化钠水溶液与氯化铁水溶液和氯化亚铁盐酸溶液的总体积比为1:0. 6 ; (2)磁性粒子修饰配基取上述磁性粒子用去离子水a进行超声分散，获得磁性粒子分散液，向所述磁性粒子分散液中分别加入无水乙醇a、质量浓度22 25%浓氨水、体积浓度40%的正硅酸乙酯的乙醇溶液，在400rpm下搅拌24小时，将反应混合液用无水乙醇与水分别清洗三次，最后用去离子水b分散，获得所述磁珠悬浮液；所述去离子水a的体积用量以磁性粒子质量计为100ml/g，所述无水乙醇a体积用量以磁性粒子质量计为400ml/g，浓氨水体积用量以磁性粒子质量计为5ml/g，正硅酸乙酯的乙醇溶液体积用量以磁性粒子质量计为5ml/g。
4.如权利要求I所述利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，其特征在于所述红细胞裂解液终浓度组成为150mmol/L氯化铵、10mmol/L碳酸氢钾，O. lmmol/L EDTA，溶剂为水，pH 为 7. 4。
5.如权利要求I所述利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，其特征在于所述细胞裂解液终浓度组成为100 mmol/L三轻甲基氨基甲烧盐酸盐a、100mmol/L螯合剂、500mmol/L氯化钠和质量终浓度O. 5%十二磺基硫酸钠，溶剂为水，pH为8. 0，所述螯合剂为EDTA。
6.如权利要求I所述利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，其特征在于所述结合液终浓度组成为3. 6mol/L高氯酸钠、O. 2mol/L醋酸钠、溶剂为水，pH为6. O。
7.如权利要求I所述利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，其特征在于所述漂洗液I终浓度组成为1. 2mol/L的高氯酸钠，O. lmol/L醋酸钠，体积终浓度30%的无水乙醇，溶剂是水，pH值4. 5。
8.如权利要求I所述利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，其特征在于所述漂洗液2终浓度组成为I. 2mol/L的高氯酸钠，O. lmol/L醋酸钠，体积终浓度70%的无水乙醇，pH值6.0，溶剂为水。
9.一种权利要求I所述利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒在提取全血基因组DNA中的应用。
10.如权利要求9所述利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒的应用，其特征在于所述的应用为(1)预处理向新鲜、冷冻或抗凝全血中加入其体积3倍的红细胞裂解液，充分混匀后室温静置5 10min，离心，弃大部分上清；(2)裂解将上述沉淀与残留上清充分重悬、分散后，获得重悬分散的细胞液，将每100 μ L重悬分散的细胞液中加入40 yL蛋白酶K工作液，振荡混匀10s，再向上述每100 μ L重悬分散细胞液中加入300 μ L细胞裂解液，56°C下振荡温育15 30min，获得混合液；(3)核酸吸附向上述步骤(2)所得的每含100 μ L重悬分散细胞液的混合液中加入800 μ L结合液，充分混匀后再加入20 μ L磁珠悬浮液，充分混匀后，静置5min，形成含有磁珠-DNA的复合体溶液，将上述复合体溶液置于磁架上静置吸附f 2min，弃上清液，获得磁珠-DNA的复合体；(4)漂洗向上述磁珠-DNA的复合体中加入漂洗液I重悬磁珠，在磁架上静置吸附f2min，弃上清，再加入漂洗液2重悬磁珠，在磁架上静置吸附f 2min后，弃上清，再加入漂洗液3重悬磁珠，在磁架上静置吸附f 2min后，弃上清，室温静置至无乙醇气味，获得漂洗后的磁珠-DNA的复合体；(5)洗脱最后向步骤(4)漂洗后的磁珠-DNA的复合体中加入洗脱液，振荡混匀20s，55°C孵育lOmin，振荡混匀5s，在磁架上静置吸附f2min，取上清，获得所述基因组DNA。
全文摘要
本发明公开了一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒及应用，所述试剂盒由磁珠悬浮液、基因提取液和磁架构成；所述基因提取液包括红细胞裂解液、细胞裂解液、结合液、蛋白酶K工作液、漂洗液1、漂洗液2、漂洗液3和洗脱液；本发明适于中大量全血基因组DNA的提取，操作简便，只需对红细胞进行简单预处理，即可对大体积的全血样本进行快速提取，1h内可完成操作，适合高通量、自动化提取；反应体系灵活，可根据样品体积作体系的相应调整；不使用苯酚、氯仿等有机溶剂，对操作人员安全无毒副作用；提取效率高，能够从2ml全血中提取20~ 60μgDNA，且片段完整。
文档编号C12N15/10GK102888397SQ20121036219
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者吴箭, 王珺, 张琼 申请人:杭州硕航生物科技有限公司