专利名称：一种制备cik细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备CIK细胞的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
肿瘤生物治疗是继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗模式。CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced killer, CIK)是ー种新型的免疫活性细胞，CIK増殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性，是目前国际上公认用于肿瘤生物治疗最有效的细胞之一。与过去过继免疫治疗所使用过的淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer, LAK)和 CD3 单抗活化的杀伤细胞(CD3AK)相比，CIK 细胞具有更强的细胞増殖能力和更强的抗肿瘤细胞作用，且毒副作用较小。CIK细胞治疗肿瘤的疗效主要取决于输注细胞的数量和杀伤活性。目前传统的 CIK细胞制备方法是先分离出外周血中的单个核细胞，用适合于淋巴细胞的培养液，加入适量的⑶3单克隆抗体、IL-2，IFN-Y等细胞因子将淋巴细胞培养成CIK细胞。如《CIK细胞的制作及对不同肿瘤细胞株体外抗肿瘤作用的研究》(隋承光等，中国医科大学学报，第34卷，第3期，210-211)公开了ー种传统的CIK细胞制备方法，采集外周血单个核细胞(PBMC)，经人淋巴细胞分离液梯度分离，取界面层细胞，PBS洗涤2次，悬浮于AM-V无血清培养基中，调整细胞浓度1父106/1111，于当日加入正.ゎ2411后加入0)310八13，IL-2，IL-I α ,在370C，5% ニ氧化碳孵箱中培养制成。该方法利用IFN- Y使CIK细胞大量扩增，但CIK细胞的杀伤活性却随着细胞的扩增有下降的趋势。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有技术中制备CIK细胞的方法在使CIK细胞大量扩增的同吋，CIK细胞的杀伤活性却下降的问题，进而提供一种既可以保证CIK细胞的数量，又可以提高其杀伤活性的制备CIK细胞的方法。为解决上述技术问题，本发明提供了一种制备CIK细胞的方法，包括以下步骤a、从外周血中采集和分离单个核细胞；b、将步骤a得到的单个核细胞置于适于淋巴细胞的培养基中，加入⑶3单克隆抗体、IL-2，IFN-Y，将淋巴细胞培养成CIK细胞；C、在步骤b的培养液中培养8-15天后，再加入IFN- α和IL-2继续培养2-6天。所述步骤c培养液中IFN-α的含量为100u/ml-1000u/ml，IL-2的浓度为IOOu/ml_500u/ml。所述步骤c培养液中IFN- α的含量为500u/ml，继续培养的时间为3天。所述步骤a中所述分离单个核细胞是经人淋巴细胞分离液密度梯度分离，经贴壁除去单核细胞。所述步骤b中培养基为无血清培养基。所述步骤b中细胞浓度为0. 5X 106/ml-l· 5X 106/ml，CD3单克隆抗体IOng/ml-70ng/ml，IL-2 浓度为 100u/ml_500u/ml，IFN-γ 浓度为 100u/ml-1000u/ml，培养时间为72h以上。所述步骤b中细胞浓度为I X 106/ml，CD3单克隆抗体50ng/ml，IL-2浓度为3000u/ml, IFN-y 浓度为 1000u/ml。本发明还涉及ー种所述方法制备的CIK细胞。本发明所述的技术方案相对于现有技术具有以下优点本发明首先按照常规方法将T淋巴细胞制备成CIK细胞，当细胞扩增至能满足临床治疗的细胞量时，加入IFN-α继续培养，既可以保证CIK细胞的数量，又可以提高其杀伤活性，MTT法检测表明利用本发明方法培养的细胞较不加IFN-α培养的细胞对肿瘤细胞的杀伤性能高50%-1000%。经过对100多例临床恶性肿瘤患者治疗，有效率(PR+CR+MR+SD)达到76%，其中PR+CR+MR达50%，不但提高了肿瘤晚期病人的生存期，还提高了病人的生存质 量。
具体实施例方式实施例I从外周血中采集和分离单个核细胞，经人淋巴细胞分离液密度梯度分离；取界面层单个核细胞，置于适于淋巴细胞的培养基中，本实施例选用AM-V无血清培养基，调整细胞浓度为O. 5Χ 106/ml，加入⑶3单克隆抗体、IL_2，IFN- Y，调整⑶3单克隆抗体浓度为30ng/ml、IL-2浓度为100u/ml，IFN-y浓度为500u/ml，培养12天；在上述培养液中再加入IFN-α和IL-2，调整IFN-α的浓度为100u/ml, IL-2浓度为100u/ml，继续培养2天即得CIK细胞。实施例2从外周血中采集和分离单个核细胞，经人淋巴细胞分离液密度梯度分离；取界面层单个核细胞，置于适于淋巴细胞的培养基中，本实施例选用AM-V无血清培养基，调整细胞浓度为1.5X106/ml，加入⑶3单克隆抗体、IL_2，IFN-Y，调整⑶3单克隆抗体浓度为70ng/ml、IL-2浓度为500u/ml，IFN-y浓度为1500u/ml，培养8天；在上述培养液中再加入IFN-α和IL-2，调整IFN-α的浓度为1000u/ml，IL-2浓度为500u/ml，继续培养6天即得CIK细胞。实施例3从外周血中采集和分离单个核细胞，经人淋巴细胞分离液密度梯度分离；取界面层单个核细胞，置于适于淋巴细胞的培养基中，本实施例选用AM-V无血清培养基，调整细胞浓度为lX106/ml，加入⑶3单克隆抗体、IL-2，IFN-Y，调整⑶3单克隆抗体浓度为50ng/ml、IL-2浓度为300u/ml，IFN-y浓度为1000u/ml，培养10天；在上述培养液中再加入IFN-α和IL-2，调整IFN-α的浓度为500u/ml, IL-2浓度为300u/ml，继续培养4天即得CIK细胞。对比例按照參考文献《CIK细胞的制作及对不同肿瘤细胞株体外抗肿瘤作用的研究》(隋承光等，中国医科大学学报，第34卷，第3期，210-211)公开的方法制备CIK细胞，采集外周血单个核细胞，经人淋巴细胞分离液梯度分离，取界面层细胞，PBS洗涤2次，悬浮于AM-V无血清培养基中，调整细胞浓度I X 106/ml，于当日加入I FN-Y (1000u/ml )，24h后加入CD3 单克隆抗体(50ng/ml)，IL-2 (300u/ml), IL-1 α (100u/ml)，在 37°C，5%C02 孵箱中培养得CIK细胞。MTT法检测CIK细胞的杀伤活性将实施例1-3和对比例所得CIK细胞分别与肿瘤细胞共同培养(实验用肿瘤细胞株有两种I、对NK敏感的K562肿瘤株；2、对NK不敏感的HL-60肿瘤株)，培养6小时胡，用MTT法检测肿瘤细胞死亡比例来比较杀瘤活性，结果换算成杀瘤单位(LU)如下表I :表I
权利要求
1.一种制备CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤a、从外周血中采集和分离单个核细胞；b、将步骤a得到的单个核细胞置于适于淋巴细胞的培养基中，除去单核细胞，悬浮细胞加入⑶3单克隆抗体、IL-2，IFN-Y，将淋巴细胞培养成CIK细胞；C、在步骤b的培养液中培养8-15天后，再加入IFN- a、IL-2继续培养2_6天。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤c培养液中IFN-α的浓度为100u/ml-1000u/ml, IL-2 的浓度为 100u/ml_500u/ml。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤c培养液中IFN-α的含量为500u/ml，继续培养的时间为3天。
4.根据权利要求I或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤a中所述分离单个核细胞是经人淋巴细胞分离液密度梯度分离，经贴壁除去单核细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤b中培养基为无血清培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤b中细胞浓度为O.5X IO6/ml-1. 5 X 106/ml，CD3 单克隆抗体 10ng/ml_70ng/ml，IL-2 浓度为 100u/ml-500u/ml，IFN- y浓度为100u/ml-1000u/ml，培养时间为72h以上。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤b中细胞浓度为lX106/ml，CD3单克隆抗体 50ng/ml，IL-2 浓度为 300u/ml，I FN-Y 浓度为 1000u/ml。
8.—种如权利要求I至7任一所述方法制备的CIK细胞。
全文摘要
本发明公开了一种制备CIK细胞的方法，包括以下步骤a、从外周血中采集和分离单个核细胞；b、将步骤a得到的单个核细胞置于适于淋巴细胞的培养基中，用单核细胞贴壁的特性除去其中的单核细胞，其余部分加入CD3单克隆抗体、IL-2，IFN-γ，将淋巴细胞培养成CIK细胞；c、在步骤b的培养液中培养8～15天后，再加入IFN-α和IL-2继续培养。本发明方法培养的细胞较不加IFN-α培养的细胞对肿瘤细胞的杀伤性能高50%-200%。经过对100多例临床恶性肿瘤患者治疗，有效率(PR+CR+MR+SD)达到75%，其中PR+CR+MR达50%，不但提高了肿瘤晚期病人的生存期，还提高了病人的生存质量。
文档编号C12N5/078GK102827808SQ201210365499
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者高岱清, 兰克涛, 马伟, 魏晓芳, 赵鹏, 解西河, 李长优, 孙伟红 申请人:高岱清