专利名称：用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，特别涉及到一种用于高温发酵生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其用途。
背景技术：
Y-聚谷氨酸(Poly (y-glutamic acid), Y -PGA)是由L-谷氨酸和D-谷氨酸通过α-氨基和Y-羧基聚合而成的ー种独特的生物高分子。通常是由500-5000个谷氨酸单体聚合而成，分子量在IOO-IOOOkDa之间。Y -聚谷氨酸分子中的谷氨酸残基上带有大量游离的亲水性羧基，可在分子内部或分子间形成氢键，具有极高的水溶性和吸水保湿性；这些游离羧基同时提供了阳离子结合的基团，使其对金属离子具有良好的吸附性。除此之外，Y-聚谷氨酸作为ー种环境友好型生物高分子，还具有一些独特的优良特性，如可食用、可降解、生物兼容性、对人体和环境无毒害等。因此，其被作为冷冻保护剂、祛苦剂、增稠剂和矿物质吸附剂应用于食品领域；作为药物输送剂、基因载体、医用生物粘合剂应用于医药领域；作为热塑性材料、水凝胶等应用于エ业和农业领域；作为金属吸附剂和生物絮凝剂应用于环保领域；作为保湿剂应用于化妆品领域。Y-聚谷氨酸于1937年由IWnovics等人首先在炭疽芽胞杆菌荚膜中发现(Ivanovics and Brucknerl937; Ivanovics and Erd5sl937);并在 1942年被证实可作为发酵产物由枯草芽孢杆菌分泌至液体培养基中(BoVamickl942)。由此，枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌被作为主要的Y-聚谷氨酸产生菌引起了广泛的研究。尤其是近十年来，国内外对微生物发酵生产Y-聚谷氨酸进行了广泛深入地研究。目前，日本和韩国已进行了エ业化试生产。国内开展Y-聚谷氨酸的研究相对较晚，ー些科研院校主要对Y-聚谷氨酸产生菌筛选、发酵エ艺优化、分批发酵生产等进行了研究，取得了一些可喜的研究成果。Y-聚谷氨酸经过近二十年的研究和发展，菌种的发酵生产能力得到了较大幅度的提高，但是菌株发酵周期长、生产效率低、发酵エ艺成本高等严重制约了 Y-聚谷氨酸发酵エ业化的进程。因此，寻找具有优良发酵特性的Y-聚谷氨酸产生菌具有重要的生产意义。海沙是由岩石经过风和水的侵蚀和冲刷形成的小颗粒，主要成分是ニ氧化硅。广西北海海沙因长期浸于高盐浓度的海水中，且广西北海地处亚热带地区，日照时间长，海沙长期处于高温日照条件下，因此从这种海沙样品中可分离到ー些较其他材料来源发酵特性更加优良的菌种，如耐高盐、耐高温菌种。目前用于生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其分离菌种材料大多来源于土壌、豆腐乳、酱萝卜条、酱黄瓜、酱大蒜、豆酱、西瓜酱、酱菜、腊肠、豆鼓、納豆、腊肉，关于以海沙为分离菌种材料，尚未有公开文献报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于高温发酵生产Y-聚谷
4氨酸的枯草芽孢杆菌及其用途，本发明的枯草芽孢杆菌是从海沙中分离得到，可在较高温度下高效合成Y-聚谷氨酸，最高温度可为50°C，发酵时间18 25h，产量最高可达2(T30g/1，生产速率可达O. iTl.3g/l *h，具有优良的温度特性、营养要求简单和培养方法简便易行等优点，这些优良特性为エ业化生产提供了有利条件。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的一种用于高温发酵生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) GXA-28，保藏编号为 CCTCC NO :M2012347，保藏日期为 2012 年 9月14日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。以上所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) GXA-28的培养方法包括如下步骤(I)制备菌悬液将海沙样品接入装有80 120ml无菌生理盐水的250ml三角瓶中，室温下磁力搅拌25 40分钟，制成菌悬液，于9(T110°C处理8 15min ；(2)菌悬液稀释、菌落挑取将步骤(I)的菌悬液采用10倍稀释法梯度稀释成不同浓度的菌悬液，选择105、106和IO7倍的菌悬液100 μ L涂布于固体分离培养基平板上,45飞(TC恒温培养2(T25h后，挑取菌落表面粘稠、用牙签能挑起拉丝的单菌落；(3)划线纯化用平整、圆滑的接种环，在无菌操作条件下，挑取少量步骤(2)中的单菌落，在固体分离培养基平板上连续划线，将划线后的平板至于45飞(TC恒温培养15^20h后，挑取平板上的纯种单菌落至试管斜面，经培养后保存；(4)传代培养用平整、圆滑的接种环，在无菌操作条件下，挑取少量斜面保存的菌种转接至另ー支新鲜试管斜面上，45飞(TC恒温条件下，传代培养15 20h ；(5)摇瓶检测发酵性能获取目标菌株用平整、圆滑的接种环挑取斜面上长度为f 2cm的菌苔接入装有25 30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速16(T250rpm，4(T50°C培养l(Tl5h至菌株对数生长中期，将种子液按1 10%接种量接入装有2(T80ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，摇床转速16(T250rpm，4(T5(rC培养18 25h后，检测发酵液中Y-聚谷氨酸产量，选取产量最高者为目标菌株，即枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) GXA-28 ο以上所述固体分离培养基的浓度组分如下葡萄糖8 12g/l，酵母膏3飞g/Ι，谷氨酸和 / 或谷氨酸盐 3 6g/l，MgSO4 · 7H20 O. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，琼脂 10 15g/I, pH值6. 5^7. 5,蒸懼水配制。以上所述液体种子培养基的浓度组分如下葡萄糖8 12g/l，酵母膏3飞g/Ι，谷氨酸和 / 或谷氨酸盐 3 6g/l，MgSO4 · 7H20 O. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，pH 值 6. 5 7· 5，蒸馏水配制。以上所述液体发酵培养基浓度组分如下葡萄糖2(T50g/l，酵母膏2飞g/Ι，谷氨酸和 / 或谷氨酸盐 15 30g/l，MgS04 ·7Η20 O. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，pH 值 6· 5 7· 5，蒸馏水配制。作为进一歩限定，以上所述谷氨酸为L-谷氨酸。作为进一歩限定，以上所述谷氨酸盐为谷氨酸钠和市售味精中的任意ー种或几种混合物。如上所述的用于高温发酵生产Y -聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的用途，是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) GXA-28在高温发酵生产Y -聚谷氨酸方面的应用，其高温发酵的温度为4(T50°C。作为优选，以上所述高温发酵的温度为45 50°C。本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) GXA-28,以下称为CCTCC NO M2012347，其性状特征如下(I)菌体形态特征菌株CCTCC NO M2012347在固体斜面培养基上50°C培养16h后电镜观察，菌体呈杆状,大小O. 7-0. 9X2. 0-3. O μ m，可运动，革兰氏染色阳性。菌株CCTCC NO :M2012347在固体斜面培养基上50°C培养30h后芽孢染色观察，可见明显芽抱。(2)菌落形态特征菌株CCTCC NO M2012347在固体分离培养基平板上50°C培养24h后，在添加谷氨酸的平板上，菌落圆形、表面呈树突状、边缘分泌粘稠物、菌落直径达I. 5-2. Ocm ;在不添加谷氨酸的平板上，菌落干燥、扁平、中央凹陷、边缘不规则。菌株CCTCC NO M2012347在液体分离培养基中培养，在液体表面可形成菌膜，培养液略显浑浊。(3) CCTCC NO M2012347生理生化性质如下表I所示。表I
权利要求
1.一种用于高温发酵生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其特征在干所述菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA_28，保藏编号为CCTCC NO M 2012347，保藏日期为2012年9月14日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
2.根据权利要求I所述的用于高温发酵生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其特征在于所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) GXA-28的培养方法包括如下步骤 制备菌悬液将海沙样品接入装有8(Tl20ml无菌生理盐水的250ml三角瓶中，室温下磁力搅拌25 40分钟，制成菌悬液，于9(TllO°C处理8 15min ； 菌悬液稀释、菌落挑取将步骤(I)的菌悬液采用10倍稀释法梯度稀释成不同浓度的菌悬液，选择IO5UO6和IO7倍的菌悬液100 μ L涂布于固体分离培养基平板上，45飞(TC恒温培养2(T25h后，挑取菌落表面粘稠、用牙签能挑起拉丝的单菌落； 划线纯化用平整、圆滑的接种环，在无菌操作条件下，挑取少量步骤(2)中的单菌落，在固体分离培养基平板上连续划线，将划线后的平板至于45飞(TC恒温培养15 20h后，挑取平板上的纯种单菌落至试管斜面，经培养后保存； 传代培养用平整、圆滑的接种环，在无菌操作条件下，挑取少量斜面保存的菌种转接至另ー支新鲜试管斜面上，45飞(TC恒温条件下，传代培养15 20h ； 摇瓶检测发酵性能获取目标菌株用平整、圆滑的接种环挑取斜面上长度为f2cm的菌苔接入装有25 30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速16(T250rpm，40 50で培养l(Tl5h至菌株对数生长中期；将所得种子液按广10%接种量接入装有2(T80ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，摇床转速16(T250rpm，4(T5(rC培养18 25h后，检测发酵液中Y -聚谷氨酸产量，选取产量最高者为目标菌株，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28ο
3.根据权利要求2所述的用于高温发酵生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其特征在于所述固体分离培养基的浓度组分如下葡萄糖8 12g/l，酵母膏3飞g/Ι，谷氨酸和/或谷氨酸盐 3 6g/l，MgSO4*7Η200. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，琼脂 10 15g/l，pH 值 6· 5 7. 5,蒸懼水配制。
4.根据权利要求2所述的用于高温发酵生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其特征在于所述液体种子培养基的浓度组分如下葡萄糖8 12g/l，酵母膏3飞g/Ι，谷氨酸和/或谷氨酸盐 3 6g/l，MgSO4·7Η200. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，pH 值 6· 5 7· 5，蒸馏水配制。
5.根据权利要求2所述的用于高温发酵生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其特征在于所述液体发酵培养基浓度组分如下葡萄糖2(T50g/l，酵母膏2飞g/Ι，谷氨酸和/或谷氨酸盐 15 30g/l，MgSO4·7Η200. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，pH 值 6· 5 7· 5，蒸馏水配制。
6.根据权利要求:Γ5中任一项所述的用于高温发酵生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其特征在于所述谷氨酸为L-谷氨酸。
7.根据权利要求:Γ5中任一项所述的用于高温发酵生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其特征在于所述谷氨酸盐为谷氨酸钠和市售味精中的任意ー种或几种混合物。
8.—种如权利要求f 7中任一项所述的用于高温发酵生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的用途，其特征在于所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) GXA-28是在高温发酵生产Y-聚谷氨酸方面的应用，其高温发酵的温度为40 50°C。
9.根据权利要求8所述的用于高温发酵生产Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的用途，其特征在干所述高温发酵的温度为45 50°C。
全文摘要
本发明公开一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GXA-28，保藏编号为CCTCCNOM2012347，保藏日期为2012年9月14日，保藏单位中国典型培养物保藏中心。该枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GXA-28是在高温发酵生产γ-聚谷氨酸方面的应用，高温发酵的温度为40~50℃。本发明的枯草芽孢杆菌是从海沙中分离得到，可在较高温度下高效合成γ-聚谷氨酸，最高温度可为50℃，发酵时间18~25h，产量最高可达20~30g/l，生产速率可达0.9~1.3g/l h，具有优良的温度特性、营养要求简单和培养方法简便易行等优点，这些优良特性为工业化生产提供了有利条件。
文档编号C12P13/02GK102911896SQ20121037176
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者梁智群, 曾伟, 陈桂光, 张云开 申请人:广西南宁智天生物科技有限公司