一种红曲色素高产菌株的高通量筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种红曲色素高产菌株的高通量筛选方法。本发明人将诱变后的所有红曲霉菌悬液接种于深孔板，混合培养后，高通量检测出产量最高的混合体，进行平板分离纯化，摇瓶发酵检测，获得纯种的高产菌株。本发明提供了将深孔板培养技术和酶标仪检测结合于一体的简便、快速、精准、高效的完整高通量筛选技术。
【专利说明】一种红曲色素高产菌株的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物学领域，涉及一种用于微生物诱变育种、发酵工程领域以实现对菌种高通量筛选的方法，尤其涉及一种高耗氧的产色素真菌的高通量筛选方法。
【背景技术】
[0002]红曲古代称丹曲,起源于中国，是红曲霉属菌株(Monascus purpureus)在生长代谢过程中产生的天然色素， 也是世界上目前仅有的利用微生物生产的食用天然色素。在中国已有1000多年的生产和应用历史，长期以来广泛用作食品着色剂和调味剂等。目前主要通过传统的固态发酵产品红曲米提取物和深层液态发酵红曲菌提取物红曲红来获得。相对合成色素和其它已知天然色素而言，它具有安全性高、热稳定性强、对蛋白质的染着力好、色调鲜艳、质量稳定和价格低廉等优点。近年来，科研人员不断的深入研究发现红曲霉可以产生多种功能性活性物质，有抑菌防腐、降低血脂和预防心血管疾病等特殊的生理功能，随着市场需求量正日益扩大，优良的红曲霉菌株是发酵生产红曲色素的关键。
[0003]从当前中国生物技术产业来看，目前高产的工业生产菌种的获得主要还是采用随机选育，包括自然选育、诱变育种和以原生质体融合为代表的杂交育种技术，筛选工作量大，费时费力。这是因为产量性状受多基因决定，一次诱变和筛选很难有大幅度提高，需要多轮诱变筛选才能获得稳定、高产的单菌落培养物(菌株)，每轮都是一个大量筛选的过程，这一点不同于以发现化合物为目标的菌种筛选。因此，扩大筛选量可以有效减少随机筛选的盲目性特点，是提高育种效率的一个重要方面，可以说筛选是菌种选育过程成败的一个关键步骤，但无论是随机筛选还是推理选育，都受到人力物力等诸多因素的限制，使得筛选效率很低，势必造成漏筛。因此，需要建立新的筛选方法以提高筛选效率。
[0004]近几年用于微生物菌种高通量筛选装置及其相关技术不断发展和成熟。特别是欧美等发达国家开发出全自动高通量筛选工作站，应用最先进的计算机技术和机器人技术，能够实现高效高通量筛选，但是此类大型设备价格相当昂贵，即使在发达国家，也只有财力雄厚的大型实验室具备购买能力。因此，使用现有的通用低成本仪器设备，自主开发简便、快速、精准、高效的高通量筛选技术具有重要现实意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种红曲色素高产菌株的高通量筛选方法。
[0006]在本发明的第一方面，提供一种高通量筛选红曲色素高产菌株的方法，包括:
[0007](I)以红曲霉菌为出发菌株，进行诱变处理，获得经诱变处理的菌丝悬液混合体；
[0008](2)将经诱变处理的菌丝悬液混合体，等量等分后分别加入到装有发酵培养基的深孔板的各孔中进行培养，获得培养液；同时设置对照孔，其中加入等量出发菌株的菌丝悬液；和
[0009](3)测定在530nm波长下各孔中培养液的吸光度，获得培养液的色价；比较各孔中培养液的色价，追踪出色价高于出发菌株的菌丝悬液混合体(其中含有混合菌群)，从中分离获取高产菌株单菌落。
[0010]在另一优选例中，步骤(1)中，采用紫外线照射诱变方法进行诱变处理。
[0011]在另一优选例中，所述紫外线照射诱变方法包括:将菌丝悬液置于直径带搅拌子的平皿中，开启磁力搅拌器，距离15W紫外灯20cm处，照射3分钟，然后加入等量体积的1.0%氯化锂溶液(IOml)，混匀静置20分钟。
[0012]在另一优选例中，步骤(2)中，所述的深孔板选自(但不限于):12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、192孔板或384孔板。
[0013]在另一优选例中，步骤(2)中，所述的深孔板是24孔板；更佳地是方底24深孔板；和/或
[0014]采用酶标仪测定在530nm波长下各孔中培养液的吸光度；
[0015]每孔装发酵培养基50-70 μ I。较佳地,种子培养基和发酵培养基是装在24深孔 板中，色价检测是在96孔酶标板中。培养时候培养基装量在1.2ml，检测时酶标板每孔最大装300 μ I。
[0016]在另一优选例中，所述的酶标仪与所述深孔板是对应的，所述的酶标仪适合于检测所述的深孔板中各孔的吸光度。
[0017]在另一优选例中，步骤⑵中，培养条件是:220±50rpm、33±2°C培养40-50小时；
[0018]在另一优选例中，先在一深孔板的孔中进行种子培养:220±50rpm、33±2°C培养40-45小时；之后转移到另一深孔板相应的孔中进行发酵培养:220±50rpm、33±2°C培养45-50小时。
[0019]在另一优选例中，步骤(3)中，应用酶标仪测定的方法是:从深孔板各孔中分别移取部分培养液，转移到另一深孔板的相应孔中，每一孔中培养液体积相同，每孔加入70%乙醇(较佳地为一定量70%乙醇)，静置(较佳地静置15分钟)，离心取上清，在530nm波长下测定吸光度(较佳地，上清转移至96孔酶标板中后在530nm波长下测定；较佳地，在24孔板里稀释后转移至96孔酶标板，测定吸光度)。
[0020]在另一优选例中，离心条件为:3000rpm离心5min，整个深孔板离心。
[0021]在另一优选例中，测定吸光度时，以同样处理的70%乙醇溶液做空白对照。
[0022]在另一优选例中，培养液的色价如下获得:将吸光度乘以培养液的稀释倍数。
[0023]在另一优选例中，步骤(3)中，从中分离获取高产菌株单菌落的方法是:找到色价高于出发菌株的培养液所在孔所对应的经诱变处理的菌株，转接于新鲜培养基，分离单菌落，发酵鉴定，获得纯种高产菌株
[0024]在另一优选例中，步骤(3)中，分离单菌落的方法是:待单菌落长出后，挑取菌落较大，颜色较深的单菌落；或
[0025]发酵鉴定的方法是:220±50rpm、33±2°C培养45-50小时，测定发酵液红曲色素的色价，选择色价显著高于出发菌株的单菌落。
[0026]在另一优选例中，步骤(3)之后，还包括，挑取经筛选出来的高产菌株进行传代培养，连续传3-10代(如5代)，对每一代进行摇瓶发酵培养，收集发酵液，测定产物产量，选择遗传稳定性好的菌株。
[0027]本发明的其它 方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【具体实施方式】
[0028]本发明人经过深入的研究，将诱变后的所有红曲霉菌悬液接种于深孔板(较佳地，根据红曲霉高耗氧、易结球的特点，选用方底24深孔板提高供氧)，混合培养后，高通量检测出产量最高的混合体，进行平板分离纯化，摇瓶发酵检测，获得纯种的高产菌株。本发明提供了从菌株培养到产物检测的完整高通量筛选平台，将深孔板培养技术和酶标仪检测结合于一体的简便、快速、精准、高效的完整高通量筛选技术。
[0029]本发明是基于多孔板培养和检测技术的高通量筛选方法。本发明选用深孔板(也称为微孔板)，例如24孔、48孔、96孔或更多孔的深孔板。深孔板是一种经事先包理专用于放置待测样本的透明塑料板， 板上有多排大小均匀一致的小孔，对其可进行一排一排地检测或阵列式检测。应用所述的深孔板(较佳地24孔板)，平衡了装液量、混合效果、供氧强度和筛选通量等多项要求。
[0030]本发明应用的检测技术是吸光度检测技术，应用的仪器较佳地为酶标仪。酶标仪可以与深孔板相配合，实现高通量的检测。与普通的光电比色计相比，酶标仪的优点是盛装待测比色液的容器不再使用比色皿，而是使用微孔板；由于盛样本的微孔板是多排多孔的，光线只能垂直穿过，因此酶标仪的光束通常是垂直通过待测溶液和微孔板的，光束既可是从上到下，也可以是从下到上穿过孔。
[0031]对出发菌株进行诱变的方法是本领域技术人员熟知的，通常包括化学诱变和物理诱变。物理诱变主要包括紫外照射诱变、电离辐射处理、离子注入处理、激光处理、微波处理；其中最常用的是紫外照射诱变，其是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。化学诱变主要包括:烷化剂诱变、碱基类似物诱变、无机化合物诱变(如亚硝基胍诱变)等。上述这些诱变方法均可被应用于本发明中，以提供多种经诱变的菌株。
[0032]以获取目标产物为目的的孔板培养技术是本领域所熟知的。根据感兴趣的目标菌种，相关的种子培养基、发酵培养基、培养条件和培养时间等均可参照现有技术中的相关教导，予以采纳或加以调整和改进，这些调整和改进都属于领域技术人员的常规技能。本发明中，培养红曲霉菌所应用的种子培养基，发酵培养基也是本领域技术人员易于获得的。
[0033]作为本发明的优选方式，提供了一种高通量筛选红曲色素高产菌株的方法，包括:
[0034](1)菌丝悬液的制备
[0035]室温下，将新鲜斜面上的菌体连同表面培养基一起刮洗下至IOml匀浆器中，加入适量无菌水轻轻研磨成均匀的悬浮液，定容至10ml，震荡均匀备用。
[0036](2)诱变处理
[0037]将IOml菌丝悬液置于直径9cm的带搅拌子的平皿中，开启磁力搅拌器，距离15W紫外灯20cm处，照射3分钟，然后将其与等体积的1.0%氯化锂溶液(IOml)混合均匀，静置20分钟，致死率达90%以上。
[0038](3)初筛
[0039]将诱变后的所有菌丝悬液用8孔道排枪依次接入装有1.2ml/孔种子培养基的24深孔板中，每孔60μ 1，尽可能全部分配完，共得到324孔混合菌株。33°C、220r/min振荡培养42h。待种子长好后，按照5%的接种量接入装有1.2ml/孔发酵培养基的24孔板中，33°C、220r/min发酵48h。剩余的种子培养板暂时用封口膜封住保存于4°C冰箱，待发酵结束，产物检测结果出来后追踪并再接于新鲜斜面保藏。
[0040](4)红曲色素检测
[0041]采用酶标仪快速测定法:用8孔道移液枪从24孔深孔板中吸取0.1ml发酵液，转移到另一块24孔深孔板的相应孔中，每孔加入0.9ml 70%乙醇溶液(pH6.0~7.0)，混匀，静置15~20min后将整块板3000rpm离心5min ;取上清适当稀释，70%乙醇溶液做空白对照，用酶标仪在530nm波长下测定吸 光度。吸光度乘以发酵液的稀释倍数，即得发酵液的色价(U/ml)。
[0042]发酵液色价(U/ml)=0D530X稀释倍数
[0043](5)混合体分离纯化
[0044]最高产量的混合体，找到其对应的种子培养板，立即涂布于新鲜平板上，33°C培养7天后，待单菌落长成，挑取菌落较大，颜色较深的单菌落接入斜面保存并摇瓶发酵检测，获得纯种高产菌株。
[0045](6)遗传稳定性实验
[0046]挑取经筛选出来的高产突变菌株进行传代培养，连续传5代，对每一代进行摇瓶发酵培养，收集发酵液，测定产物产量，从而判断遗传稳定特性。
[0047]传统的菌种筛选先从平板上挑取单菌落，待斜面长成后，摇瓶发酵初筛，再进行摇瓶发酵复筛，色素产量用高效液相色谱检测；筛选过程具有一定盲目性，容易漏筛，造成筛选效率低且费时费力。本发明中，对诱变后的所有样本进行一定数量的混合培养，先检测获得高产混合体，再从平板上分离纯化，获得纯种的高产菌株，采用酶标仪检测色素产量，整个筛选过程每一环节都实现了高通量。本发明有效增加了筛选样本，降低筛选工作强度，节约原料，提高筛选效率。
[0048]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0049]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0050]以下实施例所用培养基成分如下:
[0051]种子培养基(g/L):淀粉3.0、硝酸钠2.5、磷酸二氢钾2.5、硫酸镁1.0、黄豆粉1.0、玉米浆干粉1.0，pH 4.3 (用乳酸调)。
[0052]发酵培养基(g/L):葡萄糖40.0、蛋白胨5.0、硫酸镁1.0、硝酸钠3.0、磷酸二氢钾1.5，？財~4.5(用乳酸调)。
[0053]实施例1、高通量检测红曲色素产量的可行性论证
[0054]摇瓶培养:挖取一纟产红曲霉菌(Monascus purpureus) CGMCC3.4651接种至装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，33°C、220r/min振荡培养42h。按照5%(v/v)的接种量分别转接到装有50ml发酵培养基的500ml三角瓶中，33°C、220r/min发酵48h。每隔6小时取样，获得发酵液样品。
[0055]选取30个各阶段取样获得的红曲霉发酵液样品，分别用酶标仪与紫外分光光度计测定红曲色素色价。
[0056]按照现有技术的检测法，采用紫外分光光度计法:针对每一红曲霉菌的摇瓶发酵液样品，分别吸取Iml加入装有9ml70%(v/v)乙醇溶液(pH6.0~7.0)的试管中，加塞，摇匀，静置15~20min后，用快速滤纸过滤得清液，再适当稀释，70%乙醇溶液做空白对照，用Icm比色皿在最大吸收波长下测定吸光度。吸光度乘以发酵液的稀释倍数，即得发酵液的色价(U/ml)。样品只能依次检测，无法满足大批样品的同时检测。因此，进行方法改进非常重要。
[0057]本发明中， 采用酶标仪的实验方法:针对每一红曲霉菌的摇瓶发酵液样品，分别吸取0.1m加入到一块24深孔板中的相应孔中，每孔加入0.9ml70%乙醇溶液(pH6.0~7.0)，混匀，静置15~20min后将整块板3000rpm离心5min ;取上清适当稀释,移至另一 96孔板酶标板里检测,70%乙醇溶液做空白对照，用酶标仪在530nm波长下测定吸光度。吸光度乘以发酵液的稀释倍数，即得发酵液的色价(U/ml)。
[0058]酶标仪与紫外分光光度计分别测定红曲色素样品的结果比较见表1。
[0059]表1、酶标仪与紫外分光光度计分别测定红曲色素样品的结果比较(U/ml)
[0060]
【权利要求】
1.一种高通量筛选红曲色素高产菌株的方法，其特征在于，包括: (1)以红曲霉菌为出发菌株，进行诱变处理，获得经诱变处理的菌丝悬液混合体； (2)将经诱变处理的菌丝悬液混合体，等量等分后分别加入到装有发酵培养基的深孔板的各孔中进行培养，获得培养液；同时设置对照孔，其中加入等量出发菌株的菌丝悬液；和 (3)测定在530nm波长下各孔中培养液的吸光度，获得培养液的色价；比较各孔中培养液的色价，追踪出色价高于出发菌株的菌丝悬液混合体，从中分离获取高产菌株单菌落。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用紫外线照射诱变方法进行诱变处理。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的深孔板选自:12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、192孔板或384孔板。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的深孔板是24孔板；更佳地是方底24深孔板；和/或 采用酶标仪测定在530nm波长下各孔中培养液的吸光度； 每孔装发酵培养基50-70 μ I。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养条件是:220±50rpm、33±2°C培养40-50 小时。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，先在一深孔板的孔中进行种子培养:220±50rpm、33±2°C培养40-45小时；之后转移到另一深孔板相应的孔中进行发酵培养:220±50rpm、33±2°C培养 45-50 小时。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，应用酶标仪测定的方法是:从深孔板各孔中分别移取部分培养液，转移到另一深孔板的相应孔中，每一孔中培养液体积相同，每孔加入70%乙醇(较佳地为一定量70%乙醇)，静置，离心取上清，在530nm波长下测定吸光度(较佳地，上清转移至96孔酶标板中后在530nm波长下测定)。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，培养液的色价如下获得:将吸光度乘以培养液的稀释倍数。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，从中分离获取高产菌株单菌落的方法是:找到色价高于出发菌株的培养液所在孔所对应的经诱变处理的菌株，转接于新鲜培养基，分离单菌落，发酵鉴定，获得纯种高产菌株。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，分离单菌落的方法是:待单菌落长出后，挑取菌落较大，颜色较深的单菌落；或 发酵鉴定的方法是:220±50rpm、33±2°C培养45-50小时，测定发酵液红曲色素的色价，选择色价显著高于出发菌株的单菌落。
【文档编号】C12N13/00GK103725669SQ201210393517
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月16日 优先权日:2012年10月16日
【发明者】储炬, 谭俊, 王永红, 李友元, 庄英萍, 张嗣良, 郭元昕 申请人:华东理工大学