专利名称：一种昆虫中肠细胞的分离及离体培养方法
一种昆虫中肠细胞的分离及离体培养方法技术领域
本发明属于昆虫细胞研究和培养技术领域,具体涉及从家蚕(Bomyx mori)幼虫的中肠组织中分离中肠细胞，并进行培养的方法。
背景技术：
中肠是昆虫消化道的主要组成部分，中肠细胞由柱状细胞、杯状细胞和干细胞等组成，在昆虫生命活动中起着重要作用。昆虫中肠作为分泌消化酶和其它酶类的主要部位， 起着消化食物和吸收营养物质的作用。同时中肠也是病原微生物、农药、各种毒素、甚至包括不适pH在内的多种不利因素作用的祀标,如核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus，NPV)先在中肠细胞増殖后再转移到其它组织感染，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白与中肠细胞膜上的特异受体结合,破坏中肠正常的结构， 达到杀虫的效果。因此，研究中肠的结构和生理功能，对于利用病原微生物防治害虫和益虫疾病的预防等具有重要意义。
目前，国内外关于昆虫中肠生理功能的研究主要在活体昆虫内进行，由于在活体内中肠结构的复杂性和中肠细胞之间广泛的相互作用使得中肠生理学、病理学和毒理学的研究变得困难，而离体培养为研究中肠细胞的功能提供了简单、快速和准确的手段以及理想的体外模型。从上个世纪90年代，国外一些实验室对昆虫中肠细胞的分离和原代培养进行了尝试和报道，包括对鳞翅目的烟草天蛾(Manduca sexta)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)等，双翅目的埃及伊蚊(Aedes aegypti)和鞘翅目的红脂大小蠹(Dendroc tonus valens)等昆虫，但均存在着细胞在离体条件下活力明显减弱、存活时间不长等问题。其中，中肠细胞的分离技术是造成细胞难以成活的主要因素，在分离中肠细胞时酶和机械作用会对中肠细胞造成不同程度的损伤，选择对中肠细胞伤害较小的处理方法尤为重要。目前，国内外主要是采用胶原酶或胰蛋白酶等酶解法处理中肠组织来分离中肠细胞，分离效果和细胞生长状态并不理想。因此，如何减少中肠细胞的损伤、提高细胞离体存活率以及延长细胞离体存活的时间是亟待解决的问题。发明内容
针对现有技术的缺点，本发明所要解决的技术问题是提供一种简单有效的、并对昆虫中肠细胞伤害最轻的细胞分离方法，所分离的昆虫中肠细胞可用于细胞的离体培养、 中肠生理学以及病理学的研究等。
本发明首先提供一种家蚕幼虫中肠细胞的分离方法，是将分离的中肠组织用 Dispase II酶进行酶解，酶解结束后，吹打酶解后的中肠组织，并将酶解液进行过滤以除去中肠底膜组织，将收集的细胞滤液离心弃去上清，即获得分离的家蚕幼虫的中肠细胞。
上述的酶解条件如下Dispase II酶在LPS缓冲液中的浓度为lmg/mL，在28°C条件下静置处理30min完成酶解。
上述的LPS 缓冲液的配方如下178mmol/L 的 NaCl、4. 3mmol/L 的 KCl、4. 3mmol/L 的 CaCl2,3. 8mmol/L 的 NaHCO3、100mg/L 的庆大霉素、2. 5mg/L 的两性霉素 B ；pH 为 6. 5。
所述的过滤是用孔径为100 μ m的过滤网进行过滤。
分离的家蚕幼虫的中肠细胞的离体培养方法如下将分离的家蚕幼虫中肠细胞悬浮于添加有条件培养基和胎牛血清的TNM-FH培养基中，在25 30°C下培养来保持活性；所述的条件培养基的制备方法如下将家蚕胚胎细胞系Bm-Em-I在添加有胎牛血清的 ΤΝΜ- 培养基中培养至对数生长期后，将培养上清液经滤膜过滤后的滤液即为条件培养基。
上述的条件培养基在TNM-FH培养基中的添加体积比浓度为20%。
本发明提供了一种简单有效适合昆虫中肠细胞离体培养、中肠生理学以及病理学研究的昆虫中肠细胞分离方法，包括解离中肠细胞所用的酶液，维持细胞离体状态的适合培养基以及血清浓度和添加物，使刚分离下的中肠细胞存活率达80%以上，离体培养60d后的细胞存活率在20%以上，离体条件下中肠细胞可以被核型多角体病毒侵染，并具有碱性磷酸酶等的分泌能力，为从事昆虫中肠生理功能的研究奠定基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细的描述。
实施例I :家蚕(Bomyx mori)幼虫中肠细胞分散酶Dispase II的分离效果
(I)取健康的家蚕四龄初幼虫，在超净工作台内经10%次氯酸钠消毒5min，75%酒精消毒5min，用无菌水冲洗3次。将幼虫移入装有IOmL灭菌LPS缓冲液的培养皿(直径 33mm)中，解剖昆虫，获得中肠组织。
(2)将取出的家蚕幼虫的中肠组织于灭菌培养皿中，分别用浓度为lmg/mL的胶原酶 Collagenase(Roche 公司)，膜蛋白酶 Trypsin(Thermo 公司)，分散酶 Dispase II (Roche 公司)和HyQTase酶(Thermo公司)等4种酶进行处理,28°C条件下静置处理,分别于15min, 30min，60min, 90min和120min取样，用吸管轻轻吹打中肠组织和细胞，加到孔径为100 μ m 的过滤网(BD Falcon公司)进行过滤,收集细胞虑液，1000r/min离心5min,吸去上清,将细胞沉淀悬浮于15% FBS的 Μ-FH培养基中，即获得分离的中肠细胞。
(3)将悬浮于ΤΝΜ- 培养基中的中肠细胞移入24孔细胞培养板(BD Falcon公司) 中，每孔lmL，置于28°C培养箱中培养，在倒置相差显微镜1X71 (Olympus公司)下观察细胞状态，通过血球计数板计算解离中肠细胞的密度，并通过台盼蓝染色测定细胞的存活率。
(4)通过对细胞计数、细胞形态观察和台盼蓝染色等进行分析，结果表明，用 Dispase II酶法分离的家蚕幼虫中肠细胞，在TNM-FH培养基中处于比较分散的状态，多为单细胞，极少数细胞成团，细胞折光度好，呈均匀的悬浮状态；中肠细胞的类型主要有杯状细胞、柱状细胞和再生细胞三种，其中杯状细胞与柱状细胞的比例约为I :5 ;通过台盼蓝染色，酶处理30min的细胞存活率为82. I %。从细胞状态和存活率等方面看，Dispase II酶法较其它几种酶的分离效果好，HyQTase酶、胶原酶Collagenase和胰蛋白酶Trypsin处理后细胞有成团聚堆现象，分散效果不好，且出现细胞碎片，酶处理30min的细胞存活率分别为 78. 8%,77. 6%和 62. 6%。
用Dispase II酶法分离的中肠细胞，随着酶处理时间的延长，解离下的中肠细胞4数量不断增多，处理120min中肠细胞可全部从肠壁组织上解离下来,处理15min,30min, 60min和90min解离下的细胞比例分别为38. 3%，71. 2%，83. 9%和92. 4% ;随着酶处理时间的延长，活细胞所占的比例逐渐下降，处理15min,30min,60min,90min和120min后中肠细胞的存活率分别^ 86.6%,82. 1%,68.8%,62.2%和62.0%。综合分析认为，以Dispase II酶在28°C条件下处理中肠组织30min获得的中肠细胞状态和分离效果最佳。
实施例2 :家蚕幼虫中肠细胞的离体培养
(I)中肠细胞最适培养基的筛选取Dispase II酶法分离的中肠细胞,血球计数板计数后，将细胞分别加入含15% FBS的TNM-FH (Thermo公司)、TC-100 (GIBC0公司)、 Grace (GIBC0公司)和IPL-41 (GIBC0公司)等4种不同的培养基中，按照每孔I. OX IO5个细胞的浓度，接种到24孔细胞培养板(BD Falcon公司)中，每孔lmL，置于28°C培养箱中培养。每隔7d取出样品，用血球计数板计数细胞密度，并通过台盼蓝染色测定细胞的存活率。
家蚕中肠细胞在TNM-FH、TC-100、Grace和IPL-41等4种培养基中，最初培养的中肠细胞状态比较好，随着培养时间的延长，细胞密度减少，细胞存活率也呈下降趋势。从接种到培养三周，中肠细胞在TNM-FH、TC-100、Grace和IPL-41中的细胞密度从 1.0X 105cells/mL 分别降到 8. 9X 104cells/mL、6. 3X 104cells/mL、5. 3X 104cells/mL 和3.9X104cells/mL,在TNM-FH中培养的中肠细胞的细胞密度最高，其次是TC-100、Grace、 IPL-41。从接种到培养三周，中肠细胞在TNM-FH、TC-100、Grace和IPL-41中的细胞存活率分别从最初的83. 7%降到26. 1%、19· 8%、17· 6%和14. 3%，在TNM-FH中培养的中肠细胞的细胞存活率最高，其次是TC-100、Grace、IPL-41。由以上结果可以得出，在ΤΝΜ- 中的家蚕中肠细胞的生长状态、细胞密度和细胞存活率均较其他三种培养基好。
(2)中肠细胞培养基最适血清浓度的筛选取Dispase II酶法分离的中肠细胞， 血球计数板计数后，将细胞分别加入含0%、5%、10%、15%和20%FBS的TNM-FH培养基(Thermo 公司)中，按照每孔I. OX IO5个细胞的浓度,接种到24孔细胞培养板(Becton Dickinson公司)中，每孔lmL，置于28°C培养箱中培养。每隔7d取出样品，用血球计数板计数细胞密度， 并通过台盼蓝染色测定细胞的存活率。
家蚕中肠细胞离体培养三周后，在含有0%、5%、10%、15%、20%血清的TNM-FH中的细胞密度从最初的 I. 0X105cells/mL 分别降到 3. 6 X 104cells/mL、5. I X 104cells/mL、5.6X 104cells/mL、7. I X 104cells/mL 和 3· 8 X 104cells/mL。同样的，中肠细胞在含有 0%、 5%、10%、15%、20%血清的TNM-FH中的细胞存活率从最初的81. 6%分别降到11. 5%、13· 8%、 16. 8%,22. 3%和12. 6%。总之，在含15%血清的TNM-FH中细胞的状态最好，也最适合中肠细胞的离体培养。
(3)条件培养基对中肠细胞离体培养的影响取生长状态良好的家蚕胚胎细胞系 Bm-Em-I (李苗苗等，“家蚕胚胎细胞系Bm-Em-I的建立和特性研究”，《昆虫学报》，2011，54(12):1341-1347)接种于添加有15%胎牛血清的了匪_!^培养基中，在281条件下培养5(1 至对数生长期后，4000r/min离心IOmin后，将上清液经孔径为O. 22 μ m的滤膜过滤后的滤液即为条件培养基。再按照I :4的比例(v/v)将条件培养基加入到含15% FBS的ΤΝΜ- 培养基中，制成含20 %条件培养基和15% FBS的ΤΝΜ- 培养基。取Dispase II酶法分离的中肠细胞，血球计数板计数后，将细胞分别加入含条件培养基以及不含条件培养基的TNM-FH 培养基中，按照每孔I. OX IO5个细胞的浓度，接种到24孔细胞培养板(BDFalcon公司)中，每孔lmL，置于28°C培养箱中培养。每隔7d取出样品，用血球计数板计数细胞密度，并通过台盼蓝染色测定细胞的存活率。试验结果表明，添加条件培养基后培养的中肠细胞无论在细胞密度还是细胞存活率方面均高于不添加条件培养基。
(4)家蚕幼虫中肠细胞的离体培养取Dispase II酶法分离的中肠细胞，血球计数板计数后，接种细胞于含20%条件培养基和15% FBS的ΤΝΜ- 培养基中，分装于24孔细胞培养板(BD Falcon公司)中，置于28°C培养箱中培养，每隔15d更换1/2的新鲜培养基，在倒置相差显微镜1X71 (Olympus公司)下观察细胞状态，并通过台盼蓝染色测定细胞的存活率。离体培养60d，细胞的存活率仍有25.6%。上述研究和结果证明，本发明配置的复合培养基对于保持家蚕幼虫中肠细胞的活性具有突出的效果。
实施例3 :家蚕幼虫中肠细胞的离体病毒侵染
(I)家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染家蚕胚胎细胞系Bm-Em-I (李苗苗等，“家蚕胚胎细胞系Bm-Em-I的建立和特性研究”，《昆虫学报》，2011，54 (12) :1341_1347)后进行增殖，制成病毒悬液。
(2)取离体培养7d的家蚕中肠细胞，血球计数板计数后，按I. 0X105cells/well 的量接入24孔细胞培养板中，3次重复；28°C培养2h，吸去培养基，每孔加入BmNPV病毒(感染复数M0I=10)，28°C培养并观察，4d后检查病毒侵染结果。
(3)接种BmNPV后，细胞形态逐渐发生变化，圆形细胞数量增加,细胞核增大,核内染色质凝聚成块，细胞膨胀，在病毒感染4d后细胞中开始出现多角体，病毒感染6d时，细胞内多角体的数量增多，出现典型的病毒感染症状。由此可见，离体培养的家蚕中肠细胞可以被BmNPV所侵染。
实施例4 :家蚕中肠离体细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性测定
(I)取离体培养7d的家蚕中肠细胞，1000r/min离心5min收集细胞，悬浮在缓冲液(IOOmM甘露醇，IOmM Hepes-Tris, pH 7. 2)中，超声波裂解细胞后，细胞总蛋白的浓度测定采用Bradford法,分光光度法测定595nm的OD值,通过标准曲线计算细胞蛋白浓度。
( 2)碱性磷酸酶的活性是测定P-对硝基苯磷酸酯水解产生的P-硝基酚浓度，使用细胞碱性磷酸酶活性比色法定量检测试剂盒(Genmed公司)，参照产品说明书，于分光光度计测定400nm的OD值，根据公式AKP比活性(U/mg)=每mL细胞中AKP活性单位数(U) / 每mL细胞中蛋白质含量(mg),计算酶活性。
(3)经测定，培养7d的离体家蚕中肠细胞中，能够检测到碱性磷酸酶的活性，其活性为 143±16mU/mg。
上述的结果表明本发明方法在离体条件下可以有效的维持中肠细胞的活性，从而使分离培养的家蚕中肠离体细胞可以被核型多角体病毒侵染，并具有碱性磷酸酶等的分泌能力，为从事昆虫中肠生理功能的研究奠定基础。
权利要求
1.一种家蚕幼虫中肠细胞的分离方法，其特征在于，所述的分离方法是将分离的中肠组织用Dispase II酶进行酶解，酶解结束后，吹打酶解后的中肠组织，并将酶解液进行过滤以除去中肠底膜组织，将收集的细胞滤液离心弃去上清，即获得分离的家蚕幼虫的中肠细胞。
2.如权利要求I所述的分离方法，其特征在于所述的酶解条件如下=DispaseII酶在 LPS缓冲液中的浓度为lmg/mL，28°C条件下静置处理30min完成酶解。
3.如权利要求2所述的分离方法，其特征在于所述的LPS缓冲液的组成如下 178mmol/L 的 NaCl、4. 3mmol/L 的 KC1、4. 3mmol/L 的 CaCl2、3. 8mmol/L 的 NaHC03、lOOmg/L 的庆大霉素、2. 5mg/L的两性霉素B ;pH为6. 5。
4.如权利要求I所述的分离方法，其特征在于所述的酶解液进行过滤，是用孔径为 100 μ m的过滤网进行过滤。
5.一种家蚕幼虫的中肠细胞的离体培养方法，其特征在于，所述的离体培养方法是将分离的家蚕幼虫中肠细胞悬浮于添加有条件培养基和胎牛血清的ΤΝΜ- 培养基中， 在25 30°C下培养来保持活性；所述的条件培养基的制备方法如下将家蚕胚胎细胞系 Bm-Em-I在添加有胎牛血清的ΤΝΜ- 培养基中培养至对数生长期后，将培养上清液经滤膜过滤后的滤液即为条件培养基。
6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于所述的条件培养基在TNM-FH培养基中添加的浓度为20%。
全文摘要
本发明提供一种昆虫中肠细胞的分离及离体培养方法，是将分离的中肠组织用Dispase Ⅱ酶进行酶解。获得的中肠细胞用添加有条件培养基和胎牛血清的TNM-FH培养基进行离体培养。本发明提供了一种简单有效适合昆虫中肠细胞离体培养、中肠生理学以及病理学研究的昆虫中肠细胞分离方法，包括解离中肠细胞所用的酶液，维持细胞离体状态的适合培养基以及血清浓度和添加物，使刚分离下的中肠细胞存活率达80%以上，离体培养60d后的细胞存活率在20%以上，离体条件下中肠细胞可以被核型多角体病毒侵染，并具有碱性磷酸酶等的分泌能力，为从事昆虫中肠生理功能的研究奠定基础。
文档编号C12N5/07GK102911908SQ201210475498
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者李长友, 郑桂玲, 周洪旭, 吴艳蕾, 童丹丹 申请人:青岛农业大学