汉滩病毒核蛋白特异性CD4⁺T细胞表位肽的制作方法

专利名称：汉滩病毒核蛋白特异性CD4⁺T细胞表位肽的制作方法
技术领域：
本发明属于汉滩病毒的防治技术领域，具体涉及汉滩病毒核蛋白特异性的CD4+T细胞表位肽。
背景技术：
汉滩病毒(hantaan virus, HTNV)属于布尼亚病毒科汉坦病毒属(Hantavirus,HTV),为单股负链RNA有包膜病毒。基因组包括大(L)、中(M)、小(S)三个片段，其中L片段编码RNA聚合酶，M片段编码包膜糖蛋白I和2 (glycoprotein I, Gl/Gn和glycoprotein
2,G2/Gc), S片段编码核蛋白(nucleocapsid protein, NP)。1978年李镐汪等首先分离出的HTNV76-118株是HTNV的代表株，也是在我国引起肾综合征出血热(hemorrhagicfeverwith renal syndrome, HFRS)的主要病原体之一。HFRS是一种以发热、出血和急性肾功能损害为特征的急性传染病，典型病例可有发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期五期经过，同时存在有大量轻型非典型病例，并可见多种非典型的特殊临床表现。人群对HTNV有较普遍的易感性，在人口密集，带病毒鼠数量多的条件下容易出现爆发和流行。全球每年HFRS发病人数达10万例，死亡率在29TlO%左右，90%以上病例发生在我国，已成为我国目前死亡人数最多的传染病之一。在针对病毒感染的细胞免疫过程中，⑶4+和⑶8+Τ细胞分别通过识别抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)表面的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)-1I类或I类分子与抗原肽表位形成的复合体,发挥清除病原体的效应。其中CD4+T细胞识别与MHC-1I类分子结合的长度多为13-17个氨基酸的肽段，通过分泌细胞因 子调节CD8+T细胞介导的抗病毒免疫，对辅助B细胞产生特异性抗体至关重要。迄今为止，对HTNV结构蛋白上的T细胞表位的研究只有零星报道。这种研究现状大大限制了人们对HTNV感染后适应性免疫应答规律及其与免疫保护或免疫损伤关系的认识，也限制了人们利用多肽疫苗对疾病进行治疗及控制的研究。因此鉴定出HTNV结构蛋白T细胞表位，对于研发可用于预防和治疗HTNV感染的安全有效的表位肽疫苗具有重要意义。

发明内容
本发明的目的在于，提供汉滩病毒核蛋白特异性的CD4+T细胞表位肽，有望应用于HTNV多肽疫苗的制备。为了实现上述任务，本发明是通过以下技术方案来实现汉滩病毒核蛋白特异性的CD4+T细胞表位肽，其特征在于，该汉滩病毒核蛋白特异性的CD4+T细胞表位肽可诱导CD4+T细胞产生细胞免疫应答，分泌IFN- Y细胞因子，具体氨基酸序列为如下SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 7所示其中之一SEQ ID NO.1 TSFVVPILLKALYML
SEQ ID NO. 2 JLLKALYMLTTRGRQSEQ ID NO. 3 GRQTTKDNKGTRIRFSEQ ID NO. 4 IEPCKLLPDTAAVSLSEQ ID NO. 5 LPDTAAVSLLGGPATSEQ ID NO. 6 LRKKSSFYQSYLRRTSEQ ID NO. 7 :FYQSYLRRTQSMGIQ。上述汉滩病毒核蛋白特异性的CD4+T细胞表位肽，可用于制备T细胞表位肽疫苗，或用于诱导产生表位肽特异性的CD4+T细胞。或用于诱导产生表位肽特异性的T细胞，或用于诱导和辅助B细胞产生针对HTNV-NP的特异性抗体。与现有技术相比，本发明提供的汉滩病毒核蛋白特异性的CD4+T细胞表位肽，可诱导CD4+T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN- Y等细胞因子，并可辅助B细胞产生针对HTNV-NP的特异性抗体。可应用于在HLA多态性背景下T细胞表位肽多价疫苗的制备，或应用于诱导产生表位肽特异性的CD4+T细胞，在HFRS特异性免疫预防和治疗领域中有着良好的开发应用前景。
具体实施例方式HTNV NP全长为429个氨基酸残基，从N端开始合成部分重叠肽，每条肽长度为15个氨基酸残基，相邻两条肽重叠9个氨基酸残基，共合成70条15肽。利用固相酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay, ELISP0T)及磁珠分离技术检测HFRS病人外周血单个核细胞(peripheralblood `mononuclear cell, PBMC)对抗原肽刺激的反应性,鉴定出NP上的⑶4+T细胞15肽表位。在以下的实施例中，对涉及的用语作如下的定义T细胞表位肽为应用ELISP0T检测PBMC分泌干扰素- Y (Interferon-gamma,IFN-y )的水平而获得鉴定。⑶4+T细胞表位肽为应用免疫磁珠法分离去除⑶8+T细胞后，再应用ELIS0PT技术检测效应细胞分泌IFN-Y的水平而获得鉴定。效应细胞即为⑶8PBMC (含⑶4+T细胞)，⑶8PBMC中还包含有抗原提呈细胞提呈15肽，诱导⑶4+T细胞免疫应答。PBMC为应用Ficoll密度梯度离心法分离获得。以下是具体的实施过程首先分离HFRS患者静脉抗凝血中的外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclear cell,PBMC),将抗原肽分成7个混合肽组,每组包含10条15肽,将PBMC分别与不同NP混合肽组共同孵育，筛选出可刺激患者PBMC分泌IFN- Y的阳性混合肽组。再将PBMC与该混合肽组中每一条肽分别进行孵育，确定该混合肽组中能诱导T细胞应答的单个15肽。采用免疫磁珠分离去除PBMC中的CD8+T细胞，以特定单个阳性15肽加载⑶4+PBMC(去除⑶8+T细胞，含⑶4+T细胞)作为效应细胞，利用ELISP0T确定该15肽是⑶4+T细胞15肽表位。1、从HFRS患者外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC)根据我国肾综合征出血热临床诊断标准(血清抗HTNV IgM抗体和临床症状)，无菌采集HFRS患者外周血(EDTA抗凝)。然后将采集的外周血用等量无血清RPMI 1640培养液稀释混匀，用弯头吸管将已稀释的抗凝血缓缓叠加在淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物公司)上，2000rpm离心20min，小心吸取两层界面处得白色云雾层，用5倍体积的RPMI 1640洗涤，1500rpm离心lOmin，再洗涤2次，获得HFRS患者外周血中分离的PBMC。2、固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)筛选能够刺激HFRS患者PBMC产生特异性应答(分泌IFN- Y )的HTNV-NP阳性15肽HTNV (病毒株76-118)的NP由429个氨基酸残基组成，可以由NCBI网站的蛋白质数据库获得其明确的蛋白序列(P05133)。从N端开始，依次合成部分重叠肽，每条肽长度为15个氨基酸残基，相邻两条肽重叠9个氨基酸残基，共合成70条15肽，从N端开始将15肽依次命名为NPl NP70。合成肽委托西安联美生物公司完成，每种肽10mg。所有合成肽均经RP-HPLC测定，纯度在90%以上。将合成的15肽先用适量二甲基亚砜(DMSO)溶解，再用PBS配成浓度为lmmol/L的溶液，分装后_70°C冻存备用。将70条多肽以每组10条肽按顺序分成7组，采用商品化IFN- Y ELISPOT试剂盒(购自Mabtech公司)筛选可刺激PBMC分泌IFN- Y的阳性混合肽组，按照说明书进行操作如下用15 μ g/ml 鼠抗人 IFN- ymAb 50 μ I (1-D1K)包被 96 孔 PVDF 滤膜板，4°C过夜。PBS洗6遍，用10%FCS/RPMI 1640培养液于37°C封闭Ih后，每孔加入2 X IO5个PBMC，依次加入7组混合肽(每种15肽的终浓度为20 μ mol/L)。同时设阳性和阴性对照孔，阳性对照孔加入植物血凝素(PHA，终浓度为10 μ g/ml),阴性对照孔不加15肽和PHA。37°C、5%C02孵育14 18h后洗板，再加入I μ g/ml生物素化鼠抗人IFN-YmAb50 μ I (7-B6-l-Biotin)，室温孵育3h，洗板后加入碱性磷酸酶(ALP)-链霉亲和素50 μ 1，室温孵育1 211,洗板后加入 8(1 /他1'显色液10(^ I,室温避光显色Ih,自来水冲洗,晾干后，用ELISPOT读数仪测定斑点数，每孔斑点数>5判定为阳性孔。计算IFN-Y斑点形成细胞数即T细胞频率，以分泌IFN- Y的细胞数/IO6 PBMC表示。计算式为T细胞频率=[(阳性孔的斑点数一阴性对照孔的斑点数)/每孔PBMC总数]X IO6进一步，将筛选得到的阳性混合肽组中的每条肽依次利用商品化IFN- Y ELISPOT试剂盒进行鉴定，得到可刺激HFRS患者PBMC分泌IFN- Y的单个阳性15肽。
具体实施方式
与混合肽组筛选相同，区别在于每孔加入单个15肽(终浓度为20 μ mol/L)。3、⑶4+T细胞的分离及单个阳性15肽⑶4+Τ细胞表位的鉴定采用商品化⑶8+Τ细胞阳性分离试剂盒(购自Dynal公司)，按照说明书进行操作，分离去除HFRS患者PBMC中⑶8+Τ细胞，具体如下取25 μ I 磁珠(Dynabeads),用 Iml Bufferl (无 Ca2+、Mg2+PBS w/0. 1% BSA, 2mMEDTA，pH7. 4)重悬混匀，在磁架上静置lmin，弃上清，去除游离抗体。将HFRS患者PBMC(等分为2份)用Bufferl调整细胞浓度为IX 107/ml,加入用Bufferl重悬并洗漆过的Dynabeads,
2-8°C孵育20min。取出后在磁架上静置2min，⑶8+T细胞即与磁珠结合为沉淀。收集上清，上清中为含⑶4+T淋巴细胞的悬液，可直接作为效应细胞加入ELISPOT实验检测分泌IFN- Y水平。对磁珠分离后获得的CD8 — PBMC细胞进行免疫荧光染色和FCM分析，鉴定其纯度。调整细胞浓度为4X 106/ml，取50 μ I CD8 — PBMC细胞悬液，加入藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)标记的⑶8单克隆抗体，同型对照组加入PE-1gGl，4°C孵育30min，用FACS洗涤液洗3次后，用适量FACS固定液固定，流式细胞仪分析。结果显示⑶8 — PBMC细胞中的⑶8+T细胞
含量小于5%。再次采用商品化IFN- Y ELISPOT试剂盒，按照说明书进行操作，对筛选得到的单个阳性15肽分别进行CD4+T细胞表位鉴定，具体操作如下用15 μ g/ml 鼠抗人 IFN- ymAb 50 μ I (1-D1K)包被 96 孔 PVDF 滤膜板，4°C 过夜。PBS洗6遍，用10%FCS/RPMI 1640培养液于37°C封闭Ih后，每孔加入3X IO5 5X IO5个⑶8 — PBMC细胞，再加入待检测15肽(终浓度为20 μ mol/L)，共同孵育过夜。同时设阳性和阴性对照孔，阳性孔加入PHA(终浓度为10 μ g/ml),阴性孔不加肽和PHA。洗板后加入I μ g/ml生物素化鼠抗人IFN-YmAb 50 μ I (7-B6-l_Biotin)，室温孵育3h，洗板后加入ALP-链霉亲和素50 μ 1，室温孵育I 2h，洗板后加入BCIP/NBT显色液100 μ 1，室温避光显色lh，自来水冲洗，晾干后，用ELISPOT读数仪测定斑点数。每孔斑点数>5判定为阳性孔。计算IFN-y斑点形成细胞数即T细胞频率， 以分泌IFN-Y的细胞数/IO6PBMC表示。计算式为T细胞频率=[(阳性孔的斑点数一阴性对照孔的斑点数)/每孔PBMC总数]X IO6鉴定出能够刺激机体免疫应答核蛋白上抗原肽表位的汉滩病毒核蛋白特异性的⑶4+T细胞表位肽，具体氨基酸序列为如下SEQ ID NO.1 SEQ IDN0. 7所示其中之一SEQ ID NO.1 TSFVVPILLKALYMLSEQ ID NO. 2 ILLKALYMLTTRGRQSEQ ID NO. 3 GRQTTKDNKGTRIRFSEQ ID NO. 4 IEPCKLLPDTAAVSLSEQ ID NO. 5 LPDTAAVSLLGGPATSEQ ID NO. 6 LRKKSSFYQSYLRRTSEQ ID NO. 7 FYQSYLRRTQSMGIQ。这些被鉴定的多肽序列能够刺激机体⑶4+T细胞产生针对汉滩病毒的细胞免疫应答，表现为产生高水平IFN- Y。
权利要求
1.汉滩病毒核蛋白特异性的CD4+T细胞表位肽，其特征在于，该汉滩病毒核蛋白特异性的CD4+T细胞表位肽可诱导CD4+T细胞产生细胞免疫应答，分泌IFN- Y细胞因子，具体氨基酸序列为如下SEQ ID NO.1 SEQ IDNO. 7所示其中之一SEQ ID NO.1 =TSFVVPILLKALYMLSEQ ID NO. 2 JLLKALYMLTTRGRQSEQ ID NO. 3 GRQTTKDNKGTRIRFSEQ ID NO. 4 IEPCKLLPDTAAVSLSEQ ID NO. 5 LPDTAAVSLLGGPATSEQ ID NO. 6 LRKKSSFYQSYLRRTSEQ ID NO. 7 :FYQSYLRRTQSMGIQ。
全文摘要
本发明公开了汉滩病毒核蛋白特异性的CD4+T细胞表位肽，该汉滩病毒核蛋白特异性的CD4+T细胞表位肽可诱导CD4+T细胞产生细胞免疫应答，分泌IFN-γ细胞因子，具体氨基酸序列为如下SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示其中之一。可应用于T细胞表位肽疫苗的制备，或应用于诱导产生表位肽特异性的CD4+T细胞，在HFRS特异性免疫预防和治疗领域中有着良好的开发应用前景。
文档编号C12N5/0783GK103059103SQ20121050764
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者张赟, 马樱, 袁斌, 徐竹蔚, 刘蓓, 张宇丝, 张春梅, 庄然, 易静, 陈丽华, 杨琨, 宋朝君, 李琦, 方亮, 周幸春, 刘蓉蓉, 孙元杰, 金伯泉 申请人:中国人民解放军第四军医大学