专利名称：一种体外诱导扩增nkt细胞的方法
一种体外诱导扩增NKT细胞的方法本发明涉及NKT细胞的诱导扩增方法，具体涉及一种体外诱导扩增NKT细胞的方法。自然杀伤T细胞(NKT细胞)是继T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)之后又一类新型的T淋巴细胞，属于第4类免疫细胞。作为一种新型的免疫调节细胞，NKT细胞既表达T细胞的表面标志，又表达NK细胞的表面标志，NKT细胞具有细胞毒性和免疫调节作用。近几年在其表型特征、分布及发育、免疫学效应及与疾病关系、肿瘤治疗等方面的研究有了很大进展。NKT细胞最显著的特征是其表达的TCR和NK细胞的激活受体，NKT细胞主要分布于肝、骨髓、胸腺、脾及外周血中，在外脐血中也有NKT细胞。NKT细胞最佳刺激效应物是α 半乳糖神经酰胺(glycolipid a -galactosylceramide, a-GalCer),是一类来源于海绵体或者共生微生物的的提取物。最近，许多内源性的哺乳动物自身的脂质体也是CDld的配体，能被NKT识别。在细胞毒方面，NKT细胞在自身配体及合成配体的刺激下，其表面的IL-12受体活化，刺激DC细胞分泌大量的IL-12，并促使未成熟DC细胞的分化及成熟，而其本身迅速、大量的分泌IFN- Y，同时IFN- Y作用于NK细胞促使NK细胞亦分泌大量的穿孔素，DC细胞分泌的IL-12作用于初始⑶4Τ细胞，使其向Thl极化，上述因素共同作用而介导某些病毒感染、胞内寄生菌感染的靶细胞和肿瘤靶细胞发生溶解破坏；也可通过表达FasL，经Fas/FasL途径使上述靶细胞发生凋亡。在免疫调节作用活化NKT细胞可分泌IL-4和IFN- Y等细胞因子。IL-4可诱导CD4+ThO细胞向CD4+Th2细胞分化，参与体液免疫应答或超敏反应；IFN-Y与IL-12协同作用，可使CD4+ThO细胞向⑶4+Thl细胞分化，增强细胞免疫应答。此外NKT细胞还可分泌多种趋化性细胞因子等参与炎症反应。
总之，NKT细胞作为一类新型的免疫调节细胞，在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中具有远大的应用前景。为了解决现有技术中的不足，本发明提供一种体外诱导扩增NKT细胞的方法，该方法诱导扩增出的NKT细胞分泌细胞因子水平高，杀瘤活性高。为实现上述目的，设计一种体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成a. IL-2 和 GM-CSF 共培养 DC 细胞，b. a -GalCer 对 DC 细胞的负载，c.用a -GalCer负载的DC细胞培养NKT细胞。所述的IL-2和GM-CSF共培养DC细胞由以下步骤组成用淋巴细胞分离液分离初外周血单个核细胞，用1640培养液调整PBMC浓度为2 4X 106/ml，置于37°C、5%的CO2培养箱，用1640培养液洗板2次，加入含有IL-2，GM-CSF的培养液，置于37°C、5%的CO2培养箱2小时。所述的a-GalCer对DC细胞的负载由以下步骤组成保存5天后，在培养的DC细胞中加入a-GalCer，24小时后收集细胞。a -GalCer负载的DC细胞培养NKT细胞由以下步骤组成用含有IL-2、IL-15和a -GalCer的培养液调整洗板后的悬浮淋巴细胞浓度至f 2Χ IO6 /ml，在37°C、5%的CO2培养箱中培养5天；在第3 4天进行补液及传代；其中第O天、7天、14天加入DC细胞共培养，第21天收获细胞。所述的IL-2的浓度为100U/ml。所述的GM-CSF 浓度为 50ng/ml。所述的a-Galcer 浓度为 100ng/ml。步骤(C)中，IL-2的浓度为50U/ml。步骤(c)中，IL-15的浓度为 50ng/ml。步骤(c)中，a-Galcer 的浓度为 50ng/ml-500ng/ml。与常规方法比较仅使用NKT培养液培养的NKT细胞相比，本发明的方法有以下优点用a -GalCer激活的DC细胞可促进NKT细胞扩增，其效果明显优于单独用a -GalCer0与常规仅使用a-GalCer培养NKT细胞的培养方法相比，本发明的方法具有以下优点I. a -GalCer作为一种糖脂类抗原，用其负载的DC细胞能够充分刺激NKT细胞增殖。2.用IL-2和GM-CSF共培养的DC细胞其活性优于用IL-4和GM-CSF的DC细胞。3.同DC细胞共培养的NKT细胞分泌IFN- Y的能力更强，从而作用于NK细胞、DC细胞和T细胞。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例I机采PBMC，将采集的血样转至离心管；700g，IOmin离心，吸取上层血浆培养时备用；血样标本还原至原体积，混匀；稀释血缓慢加在Ficoll上，称取900g，离心20min ;吸取分离液界面乳白色单个核细胞层；离心洗涤2次；用1640培养基以2. O 4X IO6 /ml的细胞浓度铺板，2h后用1640培养液洗板2次，加入含有浓度为100U/ml IL-2和浓度为50ng/ml GM-CSF的培养液，置于37°C、5%的C02培养箱2小时；第5天加入浓度为100ng/ml的a -GalCer, 24小时候收集细胞。用1640培养液调整洗板后的悬浮淋巴细胞浓度至f 2Χ IO6 /ml，在37°C、含5%C02的培养箱中培养5天；1640培养液中还含有浓度为50U/ml的IL_2、50ng/ml的IL-15和浓度为 100ng/ml 的 a -GalCer。
在第3 4天进行补液及传代工作；其中第O天、7天、14天加入DC细胞共培养，每天观察细胞的生长和死亡情况，及时用扩瓶补液，第21天收获细胞。实施例2两组培养方法NKT细胞增殖倍数的比较分别取a -GalCer单独培养和DC与a -GalCer共培养组的NKT细胞，IOOul加入FITC标记的TCRVP 11单克隆抗体，避光孵育15min，加入O. 5mlPBS，测定人外周血培养的NKT细胞扩增后效应细胞的比较(如表一所示)。表一两种培养方法NKT细胞扩增后效应细胞的扩增比较
权利要求
1.一种体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成 a.IL-2和GM-CSF共培养DC细胞， b.a-GalCer对DC细胞的负载， c.用a-GalCer负载的DC细胞培养NKT细胞。
2.如权利要求I所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于所述的IL-2和GM-CSF共培养DC细胞由以下步骤组成用淋巴细胞分离液分离初外周血单个核细胞，用1640培养液调整PBMC浓度为2 4X107mL，置于37°C、5%的CO2培养箱，用1640培养液洗板2次，加入含有IL-2，GM-CSF的培养液，置于37°C、5%的CO2培养箱2小时。
3.如权利要求I所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于所述的a-GalCer对DC细胞的负载由以下步骤组成保存5天后，在培养的DC细胞中加入a -GalCer，24小时后收集细胞。
4.如权利要求I所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于a-GalCer负载的DC细胞培养NKT细胞由以下步骤组成用含有IL-2、IL-15和a -GalCer的培养液调整洗板后的悬浮淋巴细胞浓度至f 2X IO6 /ml，在37°C、5%的CO2培养箱中培养5天；在第3 4天进行补液及传代；其中第0天、7天、14天加入DC细胞共培养，第21天收获细胞。
5.如权利要求I或2或3所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于所述的IL-2的浓度为100U/ml。
6.如权利要求I或2或3所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于所述的GM-CSF 浓度为 50ng/ml。
7.如权利要求I或3所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于所述的a -Galcer 浓度为 100ng/ml。
8.如权利要求4所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于步骤(c)中，IL-2的浓度为50U/ml。
9.如权利要求4所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于步骤(c)中，IL-15的浓度为50ng/ml。
10.如权利要求4所述的体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于步骤(c)中，a -Galcer 的浓度为 50ng/ml-500ng/ml。
全文摘要
本发明涉及NKT细胞的诱导扩增方法，具体涉及一种体外诱导扩增NKT细胞的方法，该方法由以下步骤组成a.IL-2和GM-CSF共培养DC细胞，b.α-GalCer对DC细胞的负载，c.用α-GalCer负载的DC细胞培养NKT细胞，本发明的方法具有以下优点1.α-GalCer作为一种糖脂类抗原，用其负载的DC细胞能够充分刺激NKT细胞增殖。2.用IL-2和GM-CSF共培养的DC细胞其活性优于用IL-4和GM-CSF的DC细胞。3.同DC细胞共培养的NKT细胞分泌IFN-γ的能力更强，从而作用于NK细胞、DC细胞和T细胞。
文档编号C12N5/0783GK102978160SQ201210541319
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者唐田娟, 苏国新, 叶永清 申请人:上海柯莱逊生物技术有限公司