专利名称：一类酶敏感的超分子水凝胶纳米材料及凝胶因子及其制法的制作方法
技术领域：
本发明属于超分子水凝胶纳米材料技术领域，具体涉及可用于辅助细胞存活的酶敏感的超分子水凝胶及凝胶因子及其制备方法。
背景技术：
芴甲氧羰基保护的寡肽作为凝胶因子的超分子水凝胶曾见于美国化学学会的杂志《美国化学学会会志》(J. Am. Chem. Soc.，2009，131，11286-11287)的报道，该技术应用了磷酸酶调节的成胶过程，将生物过程整合其中，但并未进一步检测该材料在活体细胞层面的生物应用研究，在生物相容性及降解性方面未见相关报道。半胱天冬酶3在超分子水凝胶降解过程中的应用研究见于英国皇家化学学会的杂志《芯片实验室》(LabChip, 2010, 10，1946-1951)的报道，其中所使用的超分子水凝胶由丙烯酸酯化的聚乙二醇及相应修饰的多肽片段作为单体发生聚合反应而成，涉及到众多化合物，合成过程复杂且不易控制，文中虽然研究了所形成的超分子水凝胶的降解性，但未见其生物相容性的报道。采用可被半胱天冬酶3降解的芴甲氧羰基保护的寡肽作为凝胶因子的超分子水凝胶，用于检测细胞凋亡相关的特定酶活性及其对细胞的生物相容性方面的研究工作至今尚未见到文献报道。
发明内容
本发明的目的是提出一类酶敏感的超分子水凝胶纳米材料的凝胶因子及其制备方法，以获得酶敏感的超分子水凝胶纳米材料，克服现有相关超分子水凝胶材料制备过程复杂且不易控制的缺点，从而可以进一步在活体细胞层面用于检测凋亡相关的特定酶活性及在细胞培养中辅助细胞存活 。本发明的酶敏感的超分子水凝胶纳米材料的凝胶因子的制备方法，其特征在于先分别合成两段寡肽序列，按将I毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N- 二甲基甲酰胺里溶胀4-8分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩尔N，N- 二异丙基乙胺，反应2-3小时后，用100微升甲醇反应5-10分钟，切去甘氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第二个氨基酸甘氨酸反应2-3小时，切去甘氨酸的保护基，力口入活化的1. 6毫摩尔第三个氨基酸甘氨酸反应2-3小时，切去甘氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，切去天冬氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第五个氨基酸缬氨酸反应2-3小时，切去缬氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第六个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，最后加入活化的1. 6毫摩尔第七个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应3-4小时，切去最后一个氨基酸天冬氨酸的保护基，加2-3毫摩尔醋酐反应20-30分钟，最后用体积浓度为1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾倒除去上层乙醚，乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为多肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸；再按将I毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N- 二甲基甲酰胺里溶胀4-8分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩尔N，N- 二异丙基乙胺，反应2-3小时后，用100微升甲醇反应5-10分钟，切去甘氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第二个氨基酸甘氨酸反应2-3小时，切去甘氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第三个氨基酸甘氨酸反应2-3小时，切去甘氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第四个氨基酸缬氨酸反应2-3小时，切去缬氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第五个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，切去天冬氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第六个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，最后加入活化的1. 6毫摩尔第七个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应3-4小时，切去最后一个氨基酸天冬氨酸的保护基，加2-3毫摩尔醋酐反应20-30分钟，最后用体积浓度为1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾去上层乙醚，乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸；将上述合成的寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸取O.1毫摩尔溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入O. 12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、O. 12毫摩尔苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐及O. 12毫摩尔
1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入O.12毫摩尔N-芴甲氧羰基-乙二胺，室温搅拌反应
2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分，即为第一种初产物X1 ；将上述合成的多肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸取O.1毫摩尔溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入O. 12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、O. 12毫摩尔苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐及O. 12毫摩尔
1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入O.12毫摩尔N-芴甲氧羰基-乙二胺，室温搅拌反应
2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分，即为第二种初产物X2 ;将上述制备的第一种初产物X1溶解在10毫升体积浓度为95%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分即为第一种纯化合物Y1 ;将第二种初产物X2溶解在10毫升体积浓度为95%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分即为第二种纯化合物Y2 ；
Q其中固相肽合成所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基
权利要求
1.一类酶敏感的超分子水凝胶纳米材料的凝胶因子的制备方法，其特征在于 先分别合成两段寡肽序列，按将I毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N- 二甲基甲酰胺里溶胀4-8分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩尔N，N- 二异丙基乙胺，反应2-3小时后，用100微升甲醇反应5-10分钟，切去甘氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第二个氨基酸甘氨酸反应2-3小时，切去甘氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第三个氨基酸甘氨酸反应2-3小时，切去甘氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第四个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，切去天冬氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第五个氨基酸缬氨酸反应2-3小时，切去缬氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第六个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，最后加入活化的1. 6毫摩尔第七个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应3-4小时，切去最后一个氨基酸天冬氨酸的保护基，加2-3毫摩尔醋酐反应20-30分钟，最后用体积浓度为1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾倒除去上层乙醚，乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为多肽序列一甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸；再按将I毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N- 二甲基甲酰胺里溶胀4-8分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩尔N，N- 二异丙基乙胺，反应2-3小时后，用100微升甲醇反应5-10分钟，切去甘氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第二个氨基酸甘氨酸反应2-3小时，切去甘氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第三个氨基酸甘氨酸反应2-3小时，切去甘氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第四个氨基酸缬氨酸反应2-3小时，切去缬氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第五个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，切去天冬氨酸的保护基，加入活化的1. 6毫摩尔第六个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，最后加入活化的1. 6毫摩尔第七个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应3-4小时，切去最后一个氨基酸天冬氨酸的保护基，加2-3毫摩尔醋酐反应20-30分钟，最后用体积浓度为1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾倒除去上层乙醚，乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸； 将上述合成的寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸取O.1毫摩尔溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入O. 12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、O. 12毫摩尔苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐及O. 12毫摩尔1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入O. 12毫摩尔N-芴甲氧羰基-乙二胺，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分，即为第一种初产物X1 ; 将上述合成的多肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸取O.1毫摩尔溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入O. 12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、O. 12毫摩尔苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐及O. 12毫摩尔1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入O. 12毫摩尔N-芴甲氧羰基-乙二胺，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分，即为第二种初产物X2 ;将上述制备的第一种初产物X1溶解在10毫升体积浓度为95%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分即为第一种纯化合物1 ;将第二种初产物X2溶解在10毫升体积浓度为95%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分即为第二种纯化合物Y2 ; 其中固相肽合成所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基
2.权利要求1所述方法制备的两种超分子水凝胶纳米材料的凝胶因子，即第一种纯化合物Y1和第二种纯化合物Y2，其特征在于结构分别为
3.一种以权利要求1方法制备的超分子水凝胶纳米材料的凝胶因子即第一种纯化合物Y1调制成的酶敏感的超分子水凝胶纳米材料，其特征在于按照如下配比进行调节成胶将I毫克的第一种纯化合物Y1溶于100微升的电阻率为18. 3欧·米的去离子水中后，力口入碳酸钠固体粉末调节溶液PH至第一种纯化合物Y1完全溶解形成无色透明溶液，再加入浓盐酸调节溶液PH至1，振荡溶液使之混合均匀，至形成超分子水凝胶纳米材料。
4.一种以权利要求1方法制备的超分子水凝胶纳米材料的凝胶因子即第二种纯化合物Y2调制成的酶敏感的超分子水凝胶纳米材料，其特征在于按照如下配比进行调节成胶将I毫克的第二种纯化合物Y2溶于100微升的电阻率为18. 3欧·米的去离子水中后，力口入碳酸钠固体粉末调节溶液PH至第二种纯化合物Y2完全溶解形成无色透明溶液，再加入浓盐酸`调节溶液PH至1，振荡溶液使之混合均匀，至形成超分子水凝胶纳米材料。
全文摘要
本发明公开了一类合成简单的酶敏感超分子水凝胶纳米材料及凝胶因子及其制备方法，特征是通过简单的固相多肽合成及常规的液相羧氨缩合反应合成凝胶因子，成胶和溶胶通过调节pH的方式控制，同时由于凝胶因子含有半胱天冬酶3特异性识别的寡肽序列，可以被细胞凋亡过程产生的半胱天冬酶3剪切，能够延长细胞的存活时间。与传统的超分子水凝胶纳米材料相比，本发明的酶敏感超分子水凝胶纳米材料的优势在于不需要复杂的反应条件，凝胶因子合成简单，成胶条件容易控制；对细胞凋亡过程中产生的特定酶半胱天冬酶3敏感，对细胞有良好的生物相容性，可在活体细胞层面用于检测凋亡相关的特定酶活性及在细胞培养中辅助细胞存活。
文档编号C12N5/00GK103030682SQ20121054103
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者梁高林, 唐安明 申请人:中国科学技术大学